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Funktionelle und molekularbiologische Parameter zum Nachweis immunmodulatorischer Wirkungen: Dargestellt an unterschiedlichen Zellpopulationen von Pferden mit und ohne Sommerekzem

von Dr. Alexej Dronov

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Statistik und Sichtungsnachweis dieser Seite findet sich am Artikelende
[1.] Ad/Fragment 059 01 - Diskussion
Zuletzt bearbeitet: 2014-07-08 09:19:06 Hindemith
Ad, Bente 2003, Fragment, Gesichtet, KomplettPlagiat, SMWFragment, Schutzlevel sysop

Typus
KomplettPlagiat
Bearbeiter
SleepyHollow02
Gesichtet
Yes.png
Untersuchte Arbeit:
Seite: 59, Zeilen: 1-13
Quelle: Bente 2003
Seite(n): 18, 19, Zeilen: 18: 10 ff.; 19: 1 ff.
[Auch werden im Verlauf der Reaktion dNTPs und Primer durch] Einbau in neusynthetisierte Produkte verbraucht. Diese Reduktion von Reaktionsprodukten führt ebenfalls zum Rückgang der Vermehrungsrate der PCR (KAINZ 2000). Soll RNA in der PCR amplifiziert werden, muss mit dem Enzym Reverse Transkriptase (RNA-ahängige-DNA-Polymerase) zuerst eine komplementäre DNA synthetisiert werden, da RNA nicht als Matrize für die Polymerase geeignet ist. Die dabei entstehenden RNA-DNA-Heteroduplexe dienen als Ausgangsmatrize für eine Amplifikation mittels PCR. Als Primer für die Reverse Transkription kann man Oligo-dT-Primer, Hexamere oder spezifische Primer verwenden („spezifisches Priming“). Bei den Oligo-dT-Primern handelt es sich um kurze Nukleotide, die ausschließlich aus der Base Thymidin bestehen. Sie binden an den Poly-A-Schwanz von zellulären mRNAs und ermöglichen so eine gezielte Amplifikation der mRNAs. Die Reverse Transkription (cDNA-Synthese) ist ein wichtiger Teilschritt in der Amplifizierung der gewünschten Zielsequenz. Die Effizienz der cDNASynthese liegt zwischen 5 und 90 %, je nach Optimierung des Protokolls im Labor (RAPPOLEE 1990). Auch werden im Verlauf der Reaktion dNTPs und Primer durch Einbau in neusynthetisierte Produkte verbraucht. Diese Reduktion von Reaktionsprodukten führt ebenfalls zum Rückgang der Vermehrungsrate der PCR (KAINZ 2000).

[Seite 19]

Soll RNA in der PCR amplifiziert werden, muss mit dem Enzym Reverse Transkriptase (RNA-ahängige-DNA-Polymerase) zuerst eine komplementäre DNA synthetisiert werden, da RNA nicht als Matrize für die Polymerase geeignet ist (KAWASAKI 1989). Die dabei entstehenden RNA-DNA-Heteroduplexe dienen als Ausgangsmatrize für eine Amplifikation mittels PCR. Als Primer für die Reverse Transkription kann man Oligo-dT-Primer, Hexamere oder spezifische Primer verwenden („spezifisches Priming“). Bei den Oligo-dT-Primern handelt es sich um kurze Nukleotide, die ausschließlich aus der Base Thymidin bestehen. Sie binden an den Poly-A-Schwanz von zellulären mRNAs und ermöglichen so eine gezielte Amplifikation der mRNAs. Die Reverse Transkription (cDNA-Synthese) ist ein wichtiger Teilschritt in der Amplifizierung der gewünschten Zielsequenz. Die Effizienz der cDNASynthese liegt zwischen 5 und 90 %, je nach Optimierung des Protokolls im Labor (RAPPOLEE 1990).

Anmerkungen

Kein Hinweis auf die Quelle.

Sichter
(SleepyHollow02), Hindemith

[2.] Ad/Fragment 059 14 - Diskussion
Zuletzt bearbeitet: 2014-07-09 19:56:12 Hindemith
Ad, Becker 1999, Fragment, Gesichtet, SMWFragment, Schutzlevel sysop, Verschleierung

Typus
Verschleierung
Bearbeiter
SleepyHollow02
Gesichtet
Yes.png
Untersuchte Arbeit:
Seite: 59, Zeilen: 14-31
Quelle: Becker 1999
Seite(n): 20, 21 f, 23, Zeilen: 20 unten, 21: 1 ff; 21 unten - 22: 1 ff.; 23: 1 ff.
Mit der Einführung der PCR in die molekularbiologischen Techniken stand zum erstenmal eine dynamische Methode der DNA-Vermehrung zur Verfügung.

2.16.2 PCR-Methoden zur Quantifizierung

Kinetische PCR

Für das Design der PCR stehen verschiedene theoretische Ansätze zur Verfügung. Die einfachste Methode ist, die PCR in mehreren Ansätzen getrennt und mit variierenden Zyklenzahlen durchzuführen, die Produkte aufzutrennen und zu quantifizieren. Beim Plotting mehrerer Zyklen versus der Produktmenge kann man auf die Menge an gesuchter DNA (target-DNA) zurückzuschließen. Diese Methode wird auch als kinetische qPCR bezeichnet (KÖHLER et al. 1995)

Kompetitive PCR

Die kompetitive PCR ist eine der älteren etablierten Methoden in der Reihe der qPCRs. Einen Erstbeschreiber festzulegen, ist nicht ohne weiteres möglich. Die ersten Publikationen zu diesem Thema erschienen 1989. BECKER-ANDRE und HAHLBROCK 1989, koamplifizierten ein um ein Basenpaar verändertes DNA-Fragment. Sie führten damit eine neue Restriktionsschnittstelle ein, welche im Wildtyp nicht vorhanden war. Damit konnten sie die entstandenen Produkte über eine Restriktionsendonukleasebehandlung eindeutig als Standard oder Wildtyp identifizieren. KELLOGG et al., (1990), quantifizierten HIV I-DNA [durch Koamplifikation mit einer Sequenz des DQ alpha locus der HLA-Region.]

Mit der Einführung der PCR in die molekularbiologischen Techniken stand zum erstenmal eine dynamische Methode der Quantitierung zur

[Seite 21]

Verfügung.

[...]

1.4.3.1 Kinetische PCR

Für das Design der PCR stehen verschiedene theoretische Ansätze zur Verfügung. Die einfachste Methode ist, die PCR in mehreren Ansätzen getrennt und mit variierenden Zyklenzahlen durchzuführen, die Produkte aufzutrennen und zu

[Seite 22]

quantifizieren. Beim Plotting mehrerer Zyklen versus der Produktmenge kann man auf die Menge an target-DNA zurückzuschließen (s. a. Abbildung 2). Diese Methode wird auch als kinetische qPCR bezeichnet (Köhler, 1995, S.7f).

[Seite 23]

1.4.3.4 Kompetitive PCR

Die kompetitive PCR ist eine der älteren etablierten Methoden in der Reihe der qPCRs. Einen Erstbeschreiber festzulegen ist nicht ohne weiteres möglich. Die ersten Publikationen zu diesem Thema erschienen 1989. Becker-Andre, M. et al., 1989, koamplifizierten ein um ein Basenpaar verändertes DNA-Fragment. Sie führten damit eine neue Restriktionsschnittstelle ein, welche im Wildtyp nicht vorhanden war. Damit konnten sie die entstandenen Produkte über eine Restriktionsendonukleasebehandlung eindeutig als Standard oder Wildtyp identifizieren. Kellogg et al., 1990, quantitierten HIV I-DNA durch Koamplifikation mit einer Sequenz des DQ alpha locus der HLA-Region.

Anmerkungen

Kein Hinweis auf die Quelle.

Sichter
(SleepyHollow02) Schumann


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Letzte Bearbeitung dieser Seite: durch Benutzer:Hindemith, Zeitstempel: 20140709195625

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