von Dr. Alexej Dronov
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| [1.] Ad/Fragment 060 01 - Diskussion Zuletzt bearbeitet: 2014-07-09 23:51:59 Hindemith | Ad, Becker 1999, Fragment, Gesichtet, KomplettPlagiat, SMWFragment, Schutzlevel sysop |
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| Untersuchte Arbeit: Seite: 60, Zeilen: 1 ff. (kpl.) |
Quelle: Becker 1999 Seite(n): 22, 23, Zeilen: 22: 18 ff.; 23: 8 ff. |
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| [KELLOGG et al., (1990), quantifizierten HIV I-DNA] durch Koamplifikation mit einer Sequenz des DQ alpha locus der HLA-Region. Es ist nicht von Relevanz, ob es sich ursprünglich um RNA oder DNA handelt, denn RNA muß praktisch immer zuerst durch reverse Transkription (RT) in DNA umgewandelt werden, um eine PCR
durchzuführen. Bei einer kompetitiven PCR gibt es zusätzlich zur target-DNA-Region eine zweite DNA-Sequenz (der sogenannte Standard), welche gleichzeitig in dem gleichen Reaktionsansatz amplifiziert wird. In den frühen Arbeiten über qPCR wurde oft ein endogenes housekeeping gene (Referenzgen) koamplifiziert. Später ging man meist zu künstlich hergestellten Fragmenten über. Man amplifiziert eine target-DNA gleichzeitig mit einem Standard. Dieser Standard muß gut von den Produkten der target-DNA separierbar sein. Dies wird meistens durch eine identische Sequenz mit einer künstlich eingebauten Deletion oder Insertion von einigen Basenpaaren erreicht. Dann lassen sich die DNAFragmente z.B. über ein Gel durch Laufzeitunterschiede auftrennen. Die Menge der zugesetzten Standard-DNA kann dann so variiert werden, daß in etwa gleiche Mengen an target-Produkt als auch Standard-Produkt entstehen. Unter der Voraussetzung, daß beide nur geringfügig unterschiedliche Fragmente mit einer vergleichbaren Effektivität amplifiziert werden, kann man sagen, dass beide in dergleichen Menge vor der PCR vorhanden waren. Diese Aussagen müssen mit Plotmethoden überprüft werden, damit man von einer gewissen Zuverlässigkeit dieser Methode ausgehen kann. Zu diesem Thema wurde mittlerweile eine Anzahl von theoretischen Ansätzen publiziert (RAEYMAEKERS 1993; CONNOLLY et al. 1995). Limiting dilution PCR Die PCR ist unter extrem optimierten Bedingungen fähig einzelne DNA-Moleküle zu Signal zu amplifizieren. 1992 wurde von SYKES et al. die Idee zur Quantifizierung unter dem Stichwort limiting dilution qPCR genutzt. Im Prinzip wird die zu quantifizierende Menge an target-DNA in entsprechend kleinen Schritten verdünnt und mit PCR amplifiziert. Bei einem oder auch mehr vorhandenen target-DNA-Molekülen wird ein PCR-Produkte erhalten. Ist die Verdünnung jedoch so stark, dass statistisch gesehen kein einziges DNA-Molekül vorhanden ist, gibt es keine PCR-Produkte mehr. Die Messergebnisse dieser Methode sind also diskrete Alles-oder-Nichts-Werte. Um diese Alles-oder-Nichts-Werte in reale Mengen umzuwandeln, verwendet man eine statistische Methode, die sogenannte Poisson-Verteilung. Die Poisson- Verteilung wird bei sehr seltenen, asymmetrischen und diskreten Ereignissen angewendet (Wissenschaftliche Tabellen. Geygy,1985, S.225) |
1.4.3.3 Limiting dilution PCR
Die PCR ist unter extrem optimierten Bedingungen fähig einzelne DNA-Moleküle zu einem Signal zu amplifizieren. 1992 wurde von Sykes et al. die Idee zur Quantitierung unter dem Stichwort limiting dilution qPCR genutzt. Im Prinzip wird die zu quantitierende Menge an target-DNA in entsprechend kleinen Schritten verdünnt und mit PCR amplifiziert. Bei einem oder auch mehr vorhandenen target-DNA-Molekülen wird ein PCR-Produkte erhalten. Ist die Verdünnung jedoch so stark, daß statistisch gesehen kein einziges DNA-Molekül vorhanden ist, gibt es keine PCR-Produkte mehr. Die Messergebnisse dieser Methode sind also diskrete Alles-oder-Nicht-Werte. Um diese Alles-oder-Nicht-Werte in reale Mengen umzuwandeln, verwendet man eine statistische Methode die sogenannte Poisson-Verteilung. Die Poisson-Verteilung wird bei sehr seltenen, asymmetrischen und diskreten Ereignissen angewendet (Wissenschaftliche Tabellen Geigy,.1985, S. 225). [Seite 23:] Kellogg et al., 1990, quantitierten HIV I-DNA durch Koamplifikation mit einer Sequenz des DQ alpha locus der HLA-Region. Für unsere Überlegungen ist es nicht von Relevanz, ob es sich um RNA oder DNA handelt, denn RNA muß praktisch immer zuerst durch reverse Transkription (RT) in DNA umgewandelt werden, um eine PCR durchzuführen. Bei einer kompetitiven PCR gibt es zusätzlich zur target-DNA-Region eine zweite DNA-Sequenz (der sogenannte Standard), welche gleichzeitig in dem gleichen Reaktionsansatz amplifiziert wird. In den frühen Arbeiten über qPCR wurde oft ein endogenes housekeeping gene koamplifiziert. Später ging man meist zu künstlich hergestellten Fragmenten über. Man amplifiziert eine target-DNA gleichzeitig mit einem Standard. Dieser Standard muß gut von den Produkten der target-DNA separierbar sein. Dies wird meistens durch eine identische Sequenz mit einer künstlich eingebauten Deletion oder Insertion von einigen Basenpaaren erreicht. Dann lassen sich die DNA-Fragmente z.B. über ein Gel durch Laufzeitunterschiede auftrennen. Die Menge der zugesetzten Standard- DNA kann dann so variiert werden, daß in etwa gleiche Mengen an target-Produkt als auch Standard-Produkt entstehen. Unter der Voraussetzung, daß beide nur geringfügig unterschiedliche Fragmente mit einer vergleichbaren Effektivität amplifiziert werden, kann man sagen, daß beide in dergleichen Menge vor der PCR vorhanden waren. Diese Aussagen müssen mit bestimmten Plotmethoden überprüft werden, damit man von einer gewissen Zuverlässigkeit dieser Methode ausgehen kann. Zu diesem Thema wurde mittlerweile eine Anzahl von theoretischen Ansätzen publiziert. (Raeymaekers, 1993; Connolly et al., 1995). |
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