von Dr. Alexej Dronov
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| [1.] Ad/Fragment 067 01 - Diskussion Zuletzt bearbeitet: 2014-07-08 12:05:19 Hindemith | Ad, Bente 2003, Fragment, Gesichtet, KomplettPlagiat, SMWFragment, Schutzlevel sysop |
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| Untersuchte Arbeit: Seite: 67, Zeilen: 1 ff. (komplett) |
Quelle: Bente 2003 Seite(n): 52, 53, Zeilen: 52 letzte 4 Zeilen; 53 : 1 ff. |
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| [Die Auswertung erfolgt in der real-time RT-PCR durch die Messung der emittierten Fluoreszenz eines Farbstoffs. Emittierte Fluoreszenz und] entstehendes Amplifikat sind linear proportional. Durch diese Verhältnismäßigkeit lässt sich über die Messung der Fluoreszenz auf die entstehende Menge an Produkt schließen.
Grundsätzlich lassen sich zwei Auswertungsmöglichkeiten bei real-time PCR-Systemen unterscheiden: Die Endpunktmessung und die Echtzeitmessung. Bei der Endpunktmessung, die alle zurzeit erhältlichen Geräte anbieten, werden die Fluoreszenzwerte der Probe zu Beginn (bei einigen Geräten auch zusätzlich einmal in der Mitte der Zyklenanzahl) und am Ende gemessen. Mit dieser Art der Messung ist nur eine qualitative Aussage (Ja/Nein- Aussage) möglich, da nur ermittelt wird, ob es während der PCR-Reaktion zu einem Anstieg der Fluoreszenz gekommen ist. Eine Beobachtung der Ergebnisse während des Amplifikationsprozesses und eine Quantifizierung sind hier nicht möglich. Bei der Echtzeitmessung wird die Fluoreszenz während jedes einzelnen Zyklus gemessen. Die während des Amplifikationsprozesses gemessene native Fluoreszenz des Reporterfarbstoffs wird als R bezeichnet. Wird die gemessene Fluoreszenz um den Fluoreszenzwert der Basislinie korrigiert, so wird dieser Wert als dR bezeichnet (Tab.3). Des Weiteren besteht die Möglichkeit, die gemessene Fluoreszenz mit der Fluoreszenz eines Referenzfarbstoffes abzugleichen (Rn). Der Referenzfarbstoff –meist ROX oder HEX– ist ein fluoreszierender Farbstoff, der allen Reaktionsansätzen in konstanter Menge zugegeben wird. Er dient zur Abgleichung möglicher Fluoreszenzunterschiede der Sonde, die aufgrund von unterschiedlichen Volumina (Pipettierfehlern) in den einzelnen Reaktionsgefäßen entstehen. Des Weiteren dient der Referenzfarbstoff zum Abgleich variierender Fluoreszenzwerte, die dadurch entstehen, dass die optische Detektionseinheit von Reaktionsgefäß zu Reaktionsgefäß fährt und so unterschiedliche Aberrationen des Lichtes entstehen können. Wird die gemessene Fluoreszenz mit Basislinie und Referenzfarbstoff korrigiert, so entsteht der Wert dRn (Tab.3).
Tabelle 2: Die während einer real-time PCR gemessene native Fluoreszenz (RReporter) wird im Folgenden an die Fluoreszenz der Basislinie und der des Referenzfarbstoffs angepasst. Das real-time System erzeugt aus den ermittelten Fluoreszenzwerten eine grafische Darstellung, die als Amplifikationsgrafik bezeichnet wird. |
Die Auswertung erfolgt in der real-time RT-PCR durch die Messung der emittierten Fluoreszenz eines Farbstoffs. Emittierte Fluoreszenz und entstehendes Amplifikat sind linear proportional. Durch diese Verhältnismäßigkeit lässt sich über die Messung der Fluoreszenz auf die entstehende Menge an Produkt schließen.
[Seite 53] Grundsätzlich lassen sich zwei Auswertungsmöglichkeiten bei real-time PCR-Systemen unterscheiden: Die Endpunktmessung und die Echtzeitmessung. Bei der Endpunktmessung, die alle zurzeit erhältlichen Geräte anbieten, werden die Fluoreszenzwerte der Probe zu Beginn (bei einigen Geräten auch zusätzlich einmal in der Mitte der Zyklenanzahl) und am Ende gemessen. Mit dieser Art der Messung ist nur eine qualitative Aussage (Ja/Nein- Aussage) möglich, da nur ermittelt wird, ob es während der PCR-Reaktion zu einem Anstieg der Fluoreszenz gekommen ist. Eine Beobachtung der Ergebnisse während des Amplifikationsprozesses und eine Quantifizierung sind hier nicht möglich. Bei der Echtzeitmessung wird die Fluoreszenz während jedes einzelnen Zyklus gemessen. Ob Annealing- oder Elongationsschritt als Zeitpunkt der Messung definiert werden, ist von der Sondenart abhängig. Die während des Amplifikationsprozesses gemessene native Fluoreszenz des Reporterfarbstoffs wird als R bezeichnet. Wird die gemessene Fluoreszenz um den Fluoreszenzwert der Basislinie korrigiert, so wird dieser Wert als dR bezeichnet (Abb. 2.15). Des Weiteren besteht die Möglichkeit, die gemessene Fluoreszenz mit der Fluoreszenz eines Referenzfarbstoffes abzugleichen (Rn). Der Referenzfarbstoff –meist ROX oder HEX– ist ein fluoreszierender Farbstoff, der allen Reaktionsansätzen in konstanter Menge zugegeben wird. Er dient zur Abgleichung möglicher Fluoreszenzunterschiede der Sonde, die aufgrund von unterschiedlichen Volumina (Pipettierfehlern) in den einzelnen Reaktionsgefäßen entstehen. Des Weiteren dient der Referenzfarbstoff zum Abgleich variierender Fluoreszenzwerte, die dadurch entstehen, dass die optische Detektionseinheit von Reaktionsgefäß zu Reaktionsgefäß fährt und so unterschiedliche Aberrationen des Lichtes entstehen können. Wird die gemessene Fluoreszenz mit Basislinie und Referenzfarbstoff korrigiert, so entsteht der Wert dRn (Abb. 2.16).
Abbildung 2-16: Die während einer real-time PCR gemessene native Fluoreszenz (RReporter ) wird im Folgenden an die Fluoreszenz der Basislinie und der des Referenzfarbstoffs angepasst Das real-time System erzeugt aus den ermittelten Fluoreszenzwerten eine graphische Darstellung, die als Amplifikationsgrafik bezeichnet wird. |
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