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Funktionelle und molekularbiologische Parameter zum Nachweis immunmodulatorischer Wirkungen: Dargestellt an unterschiedlichen Zellpopulationen von Pferden mit und ohne Sommerekzem

von Dr. Alexej Dronov

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Statistik und Sichtungsnachweis dieser Seite findet sich am Artikelende
[1.] Ad/Fragment 070 01 - Diskussion
Zuletzt bearbeitet: 2014-07-09 12:34:06 Hindemith
Ad, Bente 2003, Fragment, Gesichtet, SMWFragment, Schutzlevel sysop, Verschleierung

Typus
Verschleierung
Bearbeiter
SleepyHollow02
Gesichtet
Yes.png
Untersuchte Arbeit:
Seite: 70, Zeilen: 1 ff. (komplett)
Quelle: Bente 2003
Seite(n): 56, 57, 58, Zeilen: 56: letzte Zeilen; 57: 1 ff.; 58: 1 ff.
[Die Quantitative PCR kann für verschiedene Anwendungen genutzt werden, wie z.B. das Monitoring der Genexpression oder die Bestimmung der Viruslast im Rahmen von] Pathogenesestudien (BUSTIN 2000; FREEMAN et al. 1999; HALFORD 1999; HEID et al. 1996).

Das Prinzip der Quantifizierung der Ausgangsmenge an Nukleinsäure mittels real-time RTPCR unterscheidet sich grundlegend von der Quantifizierung mit Hilfe einer konventionellen RT-PCR, da hier nicht die absolute Menge an PCR-Produkt, das bis zum Ende der Reaktion entsteht, gemessen wird. Bei der QRT-PCR wird der CT-Wert genutzt. Der CT-Wert verhält sich umgekehrt proportional zum Logarithmus der Ausgangsmenge an Nukleinsäure (HIGUCHI et al. 1993). Rein theoretisch könnte anhand des CT-Wertes auf die ursprüngliche Matrizenmenge zurückgeschlossen werden, wenn gleichzeitig die Vermehrungsrate der PCR bekannt wäre. Die Amplifikation eines bestimmten Fragments wird aber von vielen Faktoren beeinflusst, so dass es nicht möglich ist, die genaue Vermehrungsrate einer Reaktion zu ermitteln (BUSTIN 2000). Es ist daher einfacher, parallel zu den zu untersuchenden Proben, Proben mit bekannter Menge in Form eines Standards zu amplifizieren und die so ermittelten CT-Werte miteinander zu vergleichen. Die Quantifizierung kann relativ oder absolut erfolgen. Dies beruht auf unterscheidlichen Prinzipien des verwendeten Standards.

Grundsätzlich gibt es zwei Arten der Berechnung der relativen Menge: Die Standardkurven- Methode und die ΔΔCt-Methode (LIVAK & SCHMITTGEN 2001).


Beide Berechnungsmethoden benötigen neben der eigentlichen Zielsequenz auch eine „endogene Kontrolle“ (Referenzgen), die mit amplifiziert wird. Somit lässt sich anhand der m-RNA des Referenzgens die relative Menge an m-RNA des Zielgenes in einer RT-PCR Probe bestimmen. Als endogene Kontrolle sollten Gene verwendet werden, die ubiquitär und in einer konstanten Menge in den verwendeten Zellen vorkommen wie z.B. 18s rRNA, GAPDH (Glycerinaldehyd-3-phosphatdehydrogenase) oder β-Aktin. Sie sollten unter den verschieden experimentellen Bedingungen immer konstant exprimiert werden. Da 18s rRNA keinen Poly-A-Schwanz besitzt, kann sie nicht als endogene Kontrolle für eine RT-PCR eingesetzt werden, bei der Oligo-dTs für den Schritt der reversen Transkription verwendet werden. Allerdings konnte gezeigt werden, dass es zu einer unterschiedlichen Expression von Housekeeping Genen in Zellen kommen kann (LIVAK & SCHMITTGEN 2001). Die Verwendung z.B. von GAPDH ist daher kritisch zu sehen. β-Aktin stellt womöglich eine bessere Alternative dar. Vorab sollte immer evaluiert werden, wie hoch die Genexpression der gewählten endogenen Kontrolle in den verwendeten Zellen ist. Die erste Möglichkeit besteht darin, die zu untersuchende Probe aufzuteilen und die endogene Kontrolle und die Zielsequenz in zwei getrennten Reaktionsgefäßen auszuwerten. Die zweite Möglichkeit ist [das Housekeeping Gen und die Zielsequenz im selben Reaktionsgefäß zu messen. Man nennt dies Multiplex-Reaktion.]

Die Quantitative PCR kann für verschiedene Anwendungen genutzt werden, wie z.B. das Monitoring der Genexpression oder die Bestimmung der Viruslast im Rahmen von

[Seite 57:]

Pathogenesestudien (BUSTIN 2000, FREEMAN et al. 1999, HALFORD 1999, HEID et al. 1996).

Das Prinzip der Quantifizierung der Ausgangsmenge an Nukleinsäure mittels real-time RTPCR unterscheidet sich grundlegend von der Quantifizierung mit Hilfe einer konventionellen RT-PCR, da hier nicht die absolute Menge an PCR-Produkt, das bis zum Ende der Reaktion entsteht, gemessen wird. Bei der QRT-PCR wird der CT-Wert genutzt. Der CT-Wert verhält sich umgekehrt proportional zum Logarithmus der Ausgangsmenge an Nukleinsäure (HIGUCHI et al. 1993). Rein theoretisch könnte anhand des CT-Wertes auf die ursprüngliche Matrizenmenge zurückgeschlossen werden, wenn gleichzeitig die Vermehrungsrate der PCR bekannt wäre. Die Amplifikation eines bestimmten Fragments wird aber von vielen Faktoren beeinflusst, so dass es nicht möglich ist, die genaue Vermehrungsrate einer Reaktion zu ermitteln (BUSTIN 2000). Es ist daher einfacher, parallel zu den zu untersuchenden Proben, Proben mit bekannter Menge in Form eines Standards zu amplifizieren und die so ermittelten CT-Werte miteinander zu vergleichen. Die Quantifizierung kann relativ oder absolut erfolgen. Sie unterscheidet sich in einem unterschiedlichen Prinzip des verwendeten Standards.

[...]

Grundsätzlich gibt es zwei Arten der Berechnung der relativen Menge: Die Standardkurven- Methode und die ΔΔCt-Methode (LIVAK u. SCHUTTEN 2001).

Beide Berechnungsmethoden benötigen neben der eigentlichen Zielsequenz auch eine „endogene Kontrolle“ (Referenzgen), die mit amplifiziert wird. Diese endogene Kontrolle wird als Housekeeping Gene bezeichnet. Es ist eine aktive Referenz –eine Normalisierungwomit die Menge an Ziel-RNA im Verhältnis zu der insgesamt in der Probe vorhandenen RNA gesetzt wird. Als endogene Kontrolle sollten Gene verwendet werden, die ubiquitär und in einer konstanten Menge in den verwendeten Zellen vorkommen wie z.B. 18s rRNA, GAPDH (Glycerinaldehyd-3-phosphatdehydrogenase) oder β-Aktin. Sie sollten unter den verschieden experimentellen Bedingungen immer konstant exprimiert werden. Da 18s rRNA keinen Poly-A-Schwanz besitzt, kann sie nicht als endogene Kontrolle für eine RT-PCR eingesetzt werden, bei der Oligo-dTs für den Schritt der Reversen Transkription verwendet werden. Allerdings konnte gezeigt werden, dass es zu einer unterschiedlichen Expression von Housekeeping Genen in Zellen kommen kann (BUSTIN 2000). Die Verwendung z.B. von

[Seite 58:]

GAPDH ist daher kritisch zu sehen. β-Aktin stellt womöglich eine bessere Alternative dar. Vorab sollte immer evaluiert werden, wie hoch die Genexpression der gewählten endogenen Kontrolle in den verwendeten Zellen ist. Die erste Möglichkeit besteht darin, die zu untersuchende Probe aufzuteilen und die endogene Kontrolle und die Zielsequenz in zwei getrennten Reaktionsgefäßen auszuwerten. Die zweite Möglichkeit ist, das Housekeeping Gen und die Zielsequenz im selben Reaktionsgefäß zu messen. Man nennt dies Multiplex- Reaktion.

Anmerkungen

Kein Hinweis auf die Quelle.

Sichter
(SleepyHollow02), Hindemith


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Letzte Bearbeitung dieser Seite: durch Benutzer:Hindemith, Zeitstempel: 20140709123458

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