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Funktionelle und molekularbiologische Parameter zum Nachweis immunmodulatorischer Wirkungen: Dargestellt an unterschiedlichen Zellpopulationen von Pferden mit und ohne Sommerekzem

von Dr. Alexej Dronov

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Statistik und Sichtungsnachweis dieser Seite findet sich am Artikelende
[1.] Ad/Fragment 071 01 - Diskussion
Zuletzt bearbeitet: 2014-07-08 15:35:52 Singulus
Ad, Bente 2003, Fragment, Gesichtet, KomplettPlagiat, SMWFragment, Schutzlevel sysop

Typus
KomplettPlagiat
Bearbeiter
SleepyHollow02
Gesichtet
Yes.png
Untersuchte Arbeit:
Seite: 71, Zeilen: 1 ff. (komplett)
Quelle: Bente 2003
Seite(n): 58, 60, Zeilen: 58: 5 ff.; 60: 14-19
[Die zweite Möglichkeit ist,] das Housekeeping Gen und die Zielsequenz im selben Reaktionsgefäß zu messen. Man nennt dies Multiplex-Reaktion. Die Verwendung von Sonden, die mit unterschiedlichen Fluorochromen markiert sind, erlaubt es prinzipiell, mehrere Fragmente in dem gleichen Reaktionsgefäß zu messen. Die Normalisierung der gemessenen Daten durch das Verhältnis zur endogenen Kontrolle verhindert Fehler, die auf gering veränderten PCR-Effektivitäten oder verschiedenen Ausgangskonzentrationen basieren.

1. Die Berechnung über eine Standardkurven-Methode:

Neben den zu untersuchenden Proben werden in der real-time PCR serielle Verdünnungen eines Housekeeping Gens und eines der Zielsequenz ähnlichen Standards zur Bestimmung der PCR-Effizienz mit analysiert. Genaue Konzentrationen müssen nicht bekannt sein. Ist die Effizienz der PCR-Reaktion von Standard und Housekeeping Gen gleich, so ist es ausreichend, für die weiteren Berechnungen nur die Standardkurve des Housekeeping Gens heranzuziehen. Im zweiten Schritt werden die CT-Werte für die zu untersuchenden Proben gegen die ermittelten Housekeeping Gen-CT-Werte „normalisiert“. Im letzten Schritt wird der resultierende niedrigere Wert als Kalibrator festgesetzt und gleich 1 gesetzt. So ergibt sich eine Relation beider Proben zu einander.

2. Alternativ können die CT-Werte miteinander verglichen werden; eine Standardkurve ist nicht nötig. Dies wird als ΔΔCt-Methode bezeichnet (LIVAK & SCHMITTGEN 2001). Grundlage hierfür ist eine gleiche Effizienz der Housekeeping Gen-PCR und der Zielsequenz- PCR. Die Formel für die Berechnung lautet:

2-ΔΔCt

ΔΔCT = ΔCtq – ΔCtcb

ΔCtq = CtX - CtR ; Normalisierter CT für die Probe

ΔCtb = CtX - CtR ; Normalisierter CT für den Kalibrator

CtX = CT der Zielsequenz der entsprechenden Probe

CtR = CT der Referenz der entsprechenden Probe

2.16.5 Vergleich real-time RT-PCR und konventionelle RT-PCR

Die quantitative real-time PCR beinhaltet zunächst alle Vorteile einer konventionellen PCR, nämlich die Schnelligkeit der Durchführung, die Sensitivität und die Nutzbarkeit einer Reihe von Ausgangsmaterialien. Durch das Entfallen der Agarose-Gel-Auswertung nach der PCR sowie das verkürzte Thermoprofil (Zwei-Schritt- anstatt Drei-Schritt-Programme), werden der [Zeit- und Arbeitsaufwand sowie das Kontaminationsrisiko für die Proben und für das Labor reduziert.]

Die zweite Möglichkeit ist, das Housekeeping Gen und die Zielsequenz im selben Reaktionsgefäß zu messen. Man nennt dies Multiplex-Reaktion. Die Verwendung von Sonden, die mit unterschiedlichen Fluorochromen markiert sind, erlaubt es prinzipiell, mehrere Fragmente in dem gleichen Reaktionsgefäß zu messen.

Die Normalisierung der gemessenen Daten durch das Verhältnis zur endogenen Kontrolle verhindert Fehler, die auf gering veränderten PCR-Effektivitäten oder verschiedenen Ausgangskonzentrationen basieren.

1. Die Berechnung über eine Standardkurven-Methode:

Neben den zu untersuchenden Proben werden in der real-time PCR serielle Verdünnungen eines Housekeeping Gens und eines der Zielsequenz ähnlichen Standards zur Bestimmung der PCR-Effizienz mit analysiert. Genaue Konzentrationen müssen nicht bekannt sein. Ist die Effizienz der PCR-Reaktion von Standard und Housekeeping Gen gleich, so ist es ausreichend, für die weiteren Berechnungen nur die Standardkurve des Housekeeping Gens heranzuziehen. Im zweiten Schritt werden die CT-Werte für die zu untersuchenden Proben 1 und 2 gegen die ermittelten Housekeeping Gen-CT-Werte „normalisiert“. Im letzten Schritt wird der resultierende niedrigere Wert als Kalibrator festgesetzt und gleich 1 gesetzt. So ergibt sich eine Relation beider Proben zu einander.

2. Alternativ können die CT-Werte miteinander verglichen werden; eine Standardkurve ist nicht nötig. Dies wird als ΔΔCt-Methode bezeichnet (LIVAK u. SCHUTTEN 2001). Grundlage hierfür ist eine gleiche Effizienz der Housekeeping Gen-PCR und der Zielsequenz- PCR. Die Formel für die Berechnung lautet:

ΔΔCT = ΔCtq – ΔCtcb

ΔCtq = CtX - CtR ; Normalisierter CT für die Probe

ΔCtq = CtX - CtR ; Normalisierter CT für den Kalibrator

CtX = CT der Zielsequenz der entsprechenden Probe

CtR = CT der Referenz der entsprechenden Probe

[Seite 60]

Die quantitative real-time PCR beinhaltet zunächst alle Vorteile einer konventionellen PCR, nämlich die Schnelligkeit der Durchführung, die Sensitivität und die Nutzbarkeit einer Reihe von Ausgangsmaterialien. Durch das Entfallen der Agarose-Gel-Auswertung nach der PCR sowie das verkürzte Thermoprofil (Zwei-Schritt- anstatt Drei-Schritt-Programme), werden der Zeit- und Arbeitsaufwand sowie das Kontaminationsrisiko für die Proben und für das Labor reduziert.

Anmerkungen

Kein Hinweis auf die Quelle.

Sichter
(SleepyHollow02) Schumann


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Letzte Bearbeitung dieser Seite: durch Benutzer:Singulus, Zeitstempel: 20140708153642

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