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Funktionelle und molekularbiologische Parameter zum Nachweis immunmodulatorischer Wirkungen: Dargestellt an unterschiedlichen Zellpopulationen von Pferden mit und ohne Sommerekzem

von Dr. Alexej Dronov

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Statistik und Sichtungsnachweis dieser Seite findet sich am Artikelende
[1.] Ad/Fragment 079 01 - Diskussion
Zuletzt bearbeitet: 2014-07-11 07:10:18 Singulus
Ad, Fragment, Frank 2000, Gesichtet, SMWFragment, Schutzlevel sysop, Verschleierung

Typus
Verschleierung
Bearbeiter
Graf Isolan
Gesichtet
Yes.png
Untersuchte Arbeit:
Seite: 79, Zeilen: 1-8
Quelle: Frank 2000
Seite(n): 45, Zeilen: 13-20
Das Fluorochrom Propidiumjodid (PJ, s. 3.2.2) gelangt nur bei Membrandefekten ins Innere der Zelle und interkaliert dort mit der doppelsträngigen DNA, so dass es nicht mehr aus der Zelle austreten kann. Folglich diente Propidiumjodid als Hilfsmittel zur Beurteilung der morphologischen Integrität der untersuchten Zellen und damit ihrer Vitalität. Aus der

kristallinen Trockensubstanz wurde mit Hilfe von PBS (3.2.2) die Gebrauchslösung (100 μg/ml) hergestellt, die in aliquoten Teilen zu 1 ml bei –20°C eingefroren wurde. Bei durchflusszytometrischen Messungen wurden jeder 20 μl PJ-Gebrauchslösung pro ml Untersuchungssuspension zugesetzt, was einer Endkonzentration von 2 μg PJ/ml entsprach.

Das Fluorochrom Propidiumjodid (Pj, s. 3.1.2) gelangt nur bei Membrandefekten ins Innere der Zelle und interkaliert dort mit der doppelsträngigen DNA. Somit dient Propidiumjodid als Hilfsmittel zur Beurteilung der morphologischen Integrität der untersuchten Zellen und damit ihrer Vitalität. Aus der kristallinen Trockensubstanz wurde mit Hilfe von PBS die Gebrauchslösung (100 μg/ml) hergestellt, die in aliquoten Teilen zu 1 ml bei –20°C eingefroren wurde. Bei durchflußzytometrischen Messungen enthielt jede Probe eine Konzentration von 20 μl Pj-Gebrauchslösung pro ml Untersuchungssuspension, was einer Endkonzentration von 2 μg Pj/ml entspricht.
Anmerkungen

Ohne Hinweis auf eine Übernahme.

Sichter
(Graf Isolan), SleepyHollow02

[2.] Ad/Fragment 079 15 - Diskussion
Zuletzt bearbeitet: 2014-07-11 07:11:37 Singulus
Ad, Fragment, Frank 2000, Gesichtet, SMWFragment, Schutzlevel sysop, Verschleierung

Typus
Verschleierung
Bearbeiter
Graf Isolan
Gesichtet
Yes.png
Untersuchte Arbeit:
Seite: 79, Zeilen: 15-27
Quelle: Frank 2000
Seite(n): 45, Zeilen: 21-33
Referenzzellen zur Zellzahlbestimmung

Verwendung fanden bovine, mononukleäre Zellen (MNC), die gemäß der unter 0 zur Gewinnung mononukleärer Zellen beschriebenen Methode mit einer Reinheit von über 98% gewonnen wurden. Nach dem dritten Waschgang wurde die Zellsuspension mit dem monoklonalen Antikörper (mAk) Bo1 (500 μl unverdünnte Lösung) versetzt und für 30 Minuten bei 4°C inkubiert. Es folgten drei weitere Waschgänge (jeweils 300 x g, 8 Minuten, 4°C) mit MIF-Puffer (s. 3.2.4) und eine weitere Inkubation bei 4°C für 30 Minuten mit dem konjugierten Antikörper (DTAF - ZgαM – IgG + M (H + L), 500 μl, 1:100 verdünnt, s. 3.2.2). Nach weiteren drei Waschgängen (s. oben) wurden die Zellen mit Paraformaldehyd (4% in PBS, s. 3.2.4) 12–24 Stunden lichtgeschützt bei 4°C fixiert. Nach der Fixation wurden die Zellen dreimal mit MIF-Puffer gewaschen (s. oben) und dann in einer Endkonzentration von 3 bis 6 x 104 Zellen/50 μl Sheath fluid-Propidiumjodid-Lösung (2 μg PJ/ml Sheath fluid(3.2.5), bei 4°C lichtgeschützt gelagert.

Referenzzellen zur Zellzahlbestimmung

Verwendung fanden bovine, mononukleäre Zellen, die mit Hilfe eines Ficoll®-Dichtegradienten mit einer Reinheit von über 98% aus EDTA-Blut gewonnen wurden. Nach hypotoner Lyse und zwei Waschgängen mit PBS (jeweils 300 x g, 8 min, 4°C) wurde die Zellsuspension mit dem mAk Bo1 (500 μl unverdünnte Lösung, s. 3.1.5) versetzt und für 30 min bei 4°C inkubiert. Es folgten drei weitere Waschgänge (jeweils 300 x g, 8 min, 4°C) mit MIF-Puffer (s. 3.1.3.1) und eine weitere Inkubation bei 4°C für 30 min mit dem konjugierten Antikörper (DTAF - Zg? M – IgG + M (H + L), 500 μl, 1:100 verdünnt, s. 3.1.5). Nach weiteren drei Waschgängen (s. oben) wurden die Zellen mit 4%igem Paraformaldehyd (gelöst in PBS, s. 3.1.2) 12–24 Stunden lichtgeschützt bei 4°C fixiert. Nach der Fixation wurden die Zellen dreimal mit MIF-Puffer gewaschen (s. oben) und dann in einer Endkonzentration von 4–6 x 104 Zellen/50μl Sheath fluid-Propidiumjodid-Lösung (2 ng Pj/ml Sheath fluid, siehe unten) bei 4°C lichtgeschützt gelagert.

Anmerkungen

Ohne Hinweis auf eine Übernahme.

Sichter
(Graf Isolan), SleepyHollow02


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Letzte Bearbeitung dieser Seite: durch Benutzer:Singulus, Zeitstempel: 20140711071055

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