von Dr. Alexej Dronov
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| [1.] Ad/Fragment 091 05 - Diskussion Zuletzt bearbeitet: 2014-07-10 07:34:21 Singulus | Ad, Fragment, Gesichtet, SMWFragment, Scheibner 2000, Schutzlevel sysop, Verschleierung |
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| Untersuchte Arbeit: Seite: 91, Zeilen: 5-26 |
Quelle: Scheibner 2000 Seite(n): 69-70, Zeilen: 69: 2-3, 24-25, 27-28, 70: 1-16 |
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| 3.3.4.3 Präparation der RNA aus equinen Leukozyten mit dem Machery&Nagel Nucleo Spin RNA
KitDas [sic] beim Machery & Nagel Nucleo Spin RNA Kit eingesetzte Prinzip nutzte die Bindung von Nukleinsäuren an Glasfaseroberflächen, wie bei den Kits der Firma Qiagen (s.unten) besprochen. Das Machery&Nagel Nucleo Spin RNA II Kit enthielt zusätzlich DNase I und den dazugehörigen Reaktionspuffer. 400 μl Puffer RA1 (Kitbestandteil) und 4 μl ß Mercaptoäthanol wurden in einem 1,6 ml Reaktionsgefäß vorgelegt und zur 4 x 103 Zellen wurden hinzugefügt [sic] und durch mehrmaliges Auf- und Abpipettieren gut gemischt. Anschließend wurden 250 μl 96 % Äthanol hinzugefügt und der Isolierungsansatz auf einem Schüttler gut durchmischt. Die Nucleo Spin Säule (Kitbestandteil) wurde in ein 2 ml Auffanggefäß gestellt, mit 750 μl RNA-Isolierungsansatz beladen und für 1 Min bei 10.000 x g zentrifugiert. Der Durchfluss wurde verworfen, die Nucleo Spin Säule in ein neues Auffanggefäß überführt und für 1 Min bei 8000 g zentrifugiert. 10 μl rekonstitutierter DNase I (Kitbestandteil) und 90 μl DNase-Reaktionspuffer (Kitbestandteil) wurden miteinander gemischt und davon 95 μl direkt auf die Nucleo Spin Säulchen-Membran pipettiert und 15 min bei 24 °C inkubiert. Anschließend wurden 500 μl Puffer RA2 (Kitbestandteil) auf die Nucleo-Spin Säule gegeben. Es folgte 1 min Zentrifugation bei 8.000 x g. Danach wurden Durchfluß und Auffanggefäß verworfen und die Nucleo Spin Säule in ein neues 2 ml Auffanggefäß umgesetzt. 600 μl Puffer RA3 (Kitbestandteil) wurden auf die Nucleo Spin Säule pipettiert und 1 min bei 8.000 x g zentrifugiert. Der Durchfluß wurde entsorgt. 250 μl Puffer RA3 wurden auf die Nucleo Spin Säule pipettiert und 2 min bei 10.000 x g zentrifugiert. Danach wurde die Nucleo Spin Säule vorsichtig in ein neues 1,6 ml Reaktionsgefäß überführt und 50 μl RNase freies Wasser (s.3.2.8) dazugegeben. Die RNA wurde durch 1 min Zentrifugation bei 10.000 x g eluiert. |
[Seite 69]
Das beim Machery&Nagel Nucleo Spin RNA Kit eingesetzte Prinzip nutzte die Bindung von Nukleinsäuren an Glasfaseroberflächen, wie bei den Kits der Firma Qiagen besprochen. Mit dem Machery&Nagel Nucleo Spin RNA Kit wurde entsprechend der Vorschrift "Isolierung aus biologischen Flüssigkeiten" RNA isoliert. 400 μl Puffer RA1 und 4 μl ß Mercaptoethanol wurden in einem 1.6 ml Reaktionsgefäß vorgelegt. 100 μl Probe wurden hinzugefügt und durch mehrmaliges Auf- und Abpipettieren gut gemischt. [...] Das Machery&Nagel Nucleo Spin RNA II Kit enthielt zusätzlich DNase I und den dazugehörigen Reaktionspuffer. Das eingesetzte Herstellerprotokoll lautete wie folgt: 400 μl Puffer RA1 und 4 μl ß Mercaptoethanol wurden in einem 1,6 ml Reaktionsgefäß vorgelegt. 100 μl Probe wurden hinzugefügt und durch mehrmaliges Auf- und Abpipettieren [Seite 70] gut gemischt. Anschließend wurden 250 μl 96 % Ethanol hinzugefügt und der Isolierungsansatz auf einem Schüttler geschüttelt. Die Nucleo Spin Säule wurde in ein 2 ml Auffanggefäß gegeben und mit 750 μl RNA-Isolierungsansatz beladen. Anschließend wurde 1 min bei 8000 x g zentrifugiert. Der Durchfluß wurde verworfen und die Nucleo Spin Säule in ein neues Auffanggefäß überführt und 1 min bei maximaler Zentrifugengeschwindigkeit zentrifugiert. 10 μl rekonstitutierter DNase I und 90 μl DNase-Reaktionspuffer wurden miteinander gemischt und davon 95 μl direkt auf die Nucleo Spin Säulchen-Membran pipettiert und 15 min bei 24 °C inkubiert. Anschließend wurden 500 μl Puffer RA2 auf die Nucleo Spin Säule gegeben. Es folgte 1 min Zentrifugation bei 8000 x g. Danach wurden Durchfluß und Auffanggefäß verworfen und die Nucleo Spin Säule in ein neues 2 ml Auffanggefäß umgesetzt. 600 μl Puffer RA3 wurden auf die Nucleo Spin Säule pipettiert und 1 min bei 8000 x g zentrifugiert. Der Durchfluß wurde entsorgt. 250 μl Puffer RA3 wurden auf die Nucleo Spin Säule pipettiert und 2 min bei Maximalgeschwindigkeit zentrifugiert. Danach wurde die Nucleo Spin Säule vorsichtig in ein neues 1,6 ml Reaktionsgefäß überführt und 50 μl RNase freies Wasser dazugegeben. Die RNA wurde durch 1 min Zentrifugation bei Maximalgeschwindigkeit eluiert. |
Ohne Hinweis auf eine Übernahme. Warum kann nicht wie im Original bei einer derartigen wörtlichen Übereinstimmung auf das "Herstellerprotokoll" verwiesen werden? Interessanterweise sind an einer Stelle gegenüber der Vorlage die Zentrifugengeschwindigkeiten vertauscht und statt 1 min mit der "maximalen Zentrifugengeschwindigkeit" wird nur bei "8000 g" zentrifugiert. |
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