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Funktionelle und molekularbiologische Parameter zum Nachweis immunmodulatorischer Wirkungen: Dargestellt an unterschiedlichen Zellpopulationen von Pferden mit und ohne Sommerekzem

von Dr. Alexej Dronov

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[1.] Ad/Fragment 092 01 - Diskussion
Zuletzt bearbeitet: 2014-07-10 07:32:34 Singulus
Ad, Fragment, Gesichtet, SMWFragment, Scheibner 2000, Schutzlevel sysop, Verschleierung

Typus
Verschleierung
Bearbeiter
Graf Isolan
Gesichtet
Yes
Untersuchte Arbeit:
Seite: 92, Zeilen: 1-21
Quelle: Scheibner 2000
Seite(n): 66-67, Zeilen: 66:23-28 - 67:1-14
Das Kit basiert auf dem Prinzip, dass Nukleinsäuren in Gegenwart eines chaotropen Salzes an

Glasoberflächen binden. Ein anschließender Waschvorgang entfernt die Verunreinigungen. (VOGELSTEIN & GILLESPIE 1979; BOOM et al. 1990; COLPAN 1992).

In Anlehnung an die Originalanleitung des RNeasy Mini Kits wurde RNA folgendermaßen isoliert: 400 μl Puffer RLT und 4 μl ß-Mercaptoethanol wurden in ein 1,6 ml Reaktionsgefäß vorgelegt, 4 x 103 Zellen zugegeben und durch mehrmaliges Auf- und Abpipettieren gemischt.

Danach wurden 400 μl 70 % Äthanol zur Probe hinzugefügt und alles durch starkes Schütteln mit einem elektrischen Schüttler gut gemischt. Die RNeasy-Säule wurde in ein 2 ml Auffanggefäß gegeben und mit 700 μl des Probenansatzes beladen. Es wurde bei 7.500 x g für 15 sekunden zentrifugiert. Der Durchfluss wurde verworfen. Anschließend wurde der verbliebene Rest an Probenansatz auf die RNeasy-Säule gegeben und wiederum 15 sek bei 7.500 x g zentrifugiert. Der Durchfluss wurde verworfen. 700 μl Puffer RW1 wurden auf die RNeasy-Säule aufgebracht und bei 7.500 x g 15 sek zentrifugiert. Durchfluss und Auffanggefäß wurden verworfen und die RNeasy-Säule in ein neues Auffanggefäß gegeben. 500 μl Puffer RPE wurden zugegeben und bei 7.500 x g für 15 sek zentrifugiert. Der Durchfluss wurde verworfen. Es erfolgte eine erneute Zugabe von 500 μl Puffer RPE. Danach wurde 2 Min bei 17.000 x g. zentrifugiert, um den Puffer RPE vollständig zu entfernen. Die RNeasy-Säule wurde anschließend vorsichtig in ein steriles 1,5 ml Mikroreaktionsgefäß gegeben. 50 μl RNase-freies Wasser wurden auf die RNeasy-Säule pipettiert und 1 Min bei 10.000 g. zentrifugiert.


BOOM R, SOL CJA, SALIMANS MMM, JANSEN CL, WERTHEIM-VANDILLEN PME & VAN DER NOORDAA J. (1990) :
Rapid and Simple Method for Purification of Nucleic Acids.
J. Clin. Microbiol. ,28, 495-503

COLPAN M. (1992) :
Vorrichtung und Verfahren zur Isolierung und Reinigung von Nukleinsäuren.
Eur. Pat. Appl. ,17, 56-68

VOGELSTEIN B & GILLESPIE D. (1979) :
Preparative and analytical purification of DNA from agarose.
Proc. Natl. Acad. Sci. USA,76, 615-619

[Seite 66]

Das Kit basiert auf dem Prinzip, dass Nukleinsäuren im Gegenwart eines chaotropen Salzes an Glasoberflächen binden. Ein anschließender Waschvorgang entfernt die Verunreinigungen. (VOGELSTEIN u. GILLESPIE 1979; BOOM et al. 1990; COLPAN 1992).

In Anlehnung an die Originalanleitung des RNeasy Mini Kits wurde folgendermaßen RNA isoliert. 400 μl Puffer RLT und 4 μl ß-Mercaptoethanol wurden in ein 1,6 ml Reaktionsgefäß vorgelegt, 100 μl Probe zugegeben und durch mehrmaliges Auf- und Abpipettieren gemischt.

[Seite 67]

Danach wurden 400 μl 70 % Ethanol zur Probe hinzugefügt und alles durch starkes Schütteln mit einem elektrischen Schüttler gut gemischt. Die RNeasy-Säule wurde in ein 2 ml Auffanggefäß gegeben und mit 700 μl des Probenansatzes beladen. Es wurde bei 7500 x g 15 sek zentrifugiert. Der Durchfluß wurde verworfen. Anschließend wurde der verbliebene Rest an Probenansatz auf die RNeasy-Säule gegeben und wiederrum 15 sek bei 7500 x g zentrifugiert. Der Durchfluß wurde verworfen. 700 μl Puffer RW1 wurden auf die RNeasy- Säule aufgebracht und bei 7500 x g 15 sek zentrifugiert. Durchfluß und Auffanggefäß wurden verworfen und die RNeasy-Säule in ein neues Auffanggefäß gegeben. 500 μl Puffer RPE wurden zugegeben und bei 7500 x g 15 sek zentrifugiert. Der Durchfluß wurde verworfen. Es erfolgte eine erneute Zugabe von 500 μl Puffer RPE. Danach wurde 2 min bei Maximalgeschwindigkeit zentrifugiert, um den Puffer RPE vollständig zu entfernen. Die RNeasy-Säule wurde anschließend vorsichtig in ein steriles 1,5 ml Mikroreaktionsgefäß gegeben. 50 μl RNase-freies Wasser wurden auf die RNeasy-Säule pipettiert und 1 min bei Maximalgeschwindigkeit zentrifugiert.


BOOM, R., SOL, C.J.A., SALIMANS, M.M.M., JANSEN, C.L., WERTHEIM-VAN DILLEN, P.M.E. u. VAN DER NOORDAA, J. (1990):
Rapid and Simple Method for Purification of Nucleic Acids.
J Clin Microbiol, 28:495-503.

COLPAN, M. (1992):
Vorrichtung und Verfahren zur Isolierung und Reinigung von Nukleinsäuren.
Eur Pat Appl No 616639

VOGELSTEIN, B. u. GILLESPIE, D. (1979):
Preparative and analytical purification of DNA from agarose.
Proc Natl Acad Sci USA, 76:615-619

Anmerkungen

Ohne Hinweis auf eine Übernahme.

Sichter
(Graf Isolan), SleepyHollow02


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