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Funktionelle und molekularbiologische Parameter zum Nachweis immunmodulatorischer Wirkungen: Dargestellt an unterschiedlichen Zellpopulationen von Pferden mit und ohne Sommerekzem

von Dr. Alexej Dronov

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Statistik und Sichtungsnachweis dieser Seite findet sich am Artikelende
[1.] Ad/Fragment 168 04 - Diskussion
Zuletzt bearbeitet: 2014-07-10 01:20:39 Hindemith
Ad, BauernOpfer, Fragment, Gesichtet, Krueger 2001, SMWFragment, Schutzlevel sysop

Typus
BauernOpfer
Bearbeiter
Graf Isolan
Gesichtet
Yes.png
Untersuchte Arbeit:
Seite: 168, Zeilen: 4-31
Quelle: Krueger 2001
Seite(n): 105-106, Zeilen: 105:29-32 - 106:1-19.23-35
5.1.3 Die Quantifizierung des Zelltodes

Wie beurteilt man am zuverlässigsten Vitalitäts-beeinflussende Effekte auf Zellen in vitro? Unterstellt man, dass in der überwiegenden Mehrzahl der Fälle die Apoptose von Zellen induziert oder gehemmt wird, so könnte der positive Nachweis apoptotischer Merkmale von Zellen ausreichend erscheinen. So wird in Untersuchungen anderer Arbeitsgruppen sehr häufig die Bindung von Fluorochrom-markiertem Annexin V an das Phosphatidylserin in der Membran apoptotischer Zellen verwendet (FADOK et al. 2000). Die Induktion der Apoptose wurde auch durch den Nachweis der Caspase-Aktivitäten mit Hilfe Fluorochrom-markierter Caspase-Substrate durchflußzytometrisch gemessen (ALAM et al. 1999). LUNDQVIST-GUSTAFSSON & BENGTSSON. (1999) identifizierten Apoptose in ihrer Arbeit anhand einer durchflußzytometrisch bestimmten Größenabnahme (geringerer FSC) der Zellen.

Der Grund, in dieser Arbeit von einem direkten Apoptose-Nachweis abzusehen, lag in der Beobachtung, dass apoptotische Zellen in vitro relativ schnell sekundär nekrotisch werden können (WALSH et al. 1998), was somit den Nachweis einer primären Apoptose-Induktion erschwert hätte. Zudem sind die Zeitfenster, in dem Unterschiede in der Apoptose in den verschiedenen Ansätzen in vitro nachweisbar sind, oft sehr kurz, und bergen (bei falscher Wahl der Meßzeitpunkte oder unterschiedlichen Apoptose-Kinetiken) die Gefahr von Fehlinterpretationen. Sekundär nekrotische Zellen stellen sich nach durchflußzytometrischer Analyse als Propidiumiodid-positiv dar. Solche noch als Zellen zu identifizierende Ereignisse desintegrieren jedoch sehr rasch (Membran-, Kernfragmente) (KRÜGER 2001), so dass auch dieser Parameter nur bedingt zum Nachweis eines induzierten Zelltodes geeignet schien.

Auf diesen Überlegungen basierte die Auswahl des dargestellten quantitativen durchflußzytometrischen Verfahrens zur Prüfung der Modulation der Zellvitalität. Prinzipiell wurden die, nach bestimmten Zeiten in vitro noch nachweisbaren, vitalen Zellen gezählt und als verläßlichster Parameter der Zellvitalität in vitro angesehen. Es kann aus den dargelegten Gründen nicht mit Bestimmtheit festgelegt werden, ob das im folgenden beschriebene beschleunigte Absterben auf der Induktion von Apoptose oder der Nekrose beruht, oder ob eventuell sogar beide Mechanismen des Zelltodes daran beteiligt sind. Allerdings wird für den spontanen und den induzierten Zelltod von PBL in vivo und in vitro generell die Induktion [der Apoptose verantwortlich gemacht (HASLETT et al. 1985, PAYNE et al. 1994, GASMI et al. 1996, WALZOG et al. 1997, HANNAH et al. 1998).]


ALAM A, COHEN LY, AOUAD S & SÉKALY RP. (1999) :
Early activation of caspases during T lymphocyte stimulation results in selective substrate cleavage in nonapoptotic cells.
J. Exp. Med. ,190, 1879-90

FADOK VA, BRATTON DL, ROSE DM, PEARSON A, EZEKEWITZ RA, HENSON PM. (2000) :
A receptor for phosphatidylserine-specific clearance of apoptotic Cells.
Nature ,405, 85-90

GASMI L , MCLENNAN AG & EDWARDS SW. (1996) :
The diadenosine polyphosphates Ap3A and Ap4A and adenosine triphosphate interact with granulocyte-macrophage colony-stimulating factor to delay neutrophil apoptosis: implications for neutrophil: platelet interactions during inflammation.
Blood ,87, 3442-3449

HANNAH S, NADRA I, DRANSFIELD I, PRYDE JG, ROSSI AG & HASLET C. (1998) :
Constitutive neutrophil apoptosis in culture is modulated by cell density independently of beta2 integrin-mediated adhesion.
FEBS Lett. ,421, 141-146

HASLETT C, GUTHRIE LA, KOPANIAK RB JOHNSTON & HENSON PM. (1985) :
Modulation of multiple neutrophil functions by preparative methods or trace concentrations of bacterial lipopolysaccharide.
Am. J. Pathol., 119, 101-110

KRÜGER C. (2001) :
Funktionelle Charakterisierung der Interaktion zwischen bakteriellen Superantigenen und bovinen neutrophilen Granulozyten
Dissertation ,Tierärztliche Hochschule Hannover

LUNDQVIST-GUSTAFSSON H & BENGTSSON T. (1999) :
Activation of the granule pool of the NADPH oxidase accelerates apoptosis in human neutrophils.
J. Leukoc. Biol . ,65, 196-204

PAYNE CM, GLASSER L, TISCHLER ME, WYCKOFF D, CROMEY D, FIEDERLEIN E & BOHNERT O. (1994) :
Programmed cell death of the normal human neutrophil: an in vitro model of senescence.
Microsc. Res. Tech. ,28, 327-344

WALSH GM, DEWSON G, WARDLAW AJ, LEVI-SCHAFFER F & R MOQBEL. (1998) :
A comparative study of different methods for the assessment of apoptosis and necrosis in human eosinophils.
J. Immunol. Meth. ,217, 153-163

WALZOG B, JEBLONSKI F, ZAKRZEWICZ A & GAEHTGENS P. (1997) :
Beta2 integrins. (CD11/CD18) : promote apoptosis of human neutrophils.
FASEB J. ,11, 1177-1186

[Seite 105]

5.1.1 Methodischer Ansatz

Wie beurteilt man am zuverlässigsten Vitalitäts-mindernde Effekte von Toxinen, Superantigenen oder zellulären Mediatoren auf Zellen in vitro? Unterstellt man, daß in der überwiegenden Mehrzahl der Fälle die Apoptose von Zellen induziert oder gehemmt wird, so könnte der positive Nachweis apoptotischer Merkmale von Zellen (vgl. Abb. 1)

[Seite 106]

ausreichend erscheinen. So wird in Untersuchungen anderer Arbeitsgruppen sehr häufig die Bindung von Fluorochrom-markiertem Annexin V an das Phosphatidylserin in der Membran apoptotischer Zellen verwendet (s. 2.4.1, FADOK et al. 1992). Die Induktion der Apoptose wurde auch durch den Nachweis der Caspase-Aktivitäten mit Hilfe Fluorochrom-markierter Caspase-Substrate durchflußzytometrisch gemessen (ALAM et al. 1999). LUNDQVIST-GUSTAFSSON & BENGTSSON (1999) identifizierten Apoptose in ihrer Arbeit anhand einer durchflußzytometrisch bestimmten Größenabnahme (geringerer FSC) der Zellen.

Der Grund, in dieser Arbeit von einem direkten Apoptose-Nachweis abzusehen, lag in der Beobachtung, daß apoptotische Zellen in vitro relativ schnell sekundär nekrotisch werden können (WALSH et al. 1998), was somit den Nachweis einer primären Apoptose-Induktion erschwert hätte. Zudem sind die Zeitfenster, in dem Unterschiede in der Apoptose - in den verschiedenen Ansätzen - in vitro nachweisbar sind, oft sehr kurz, und bergen (bei falscher Wahl der Meßzeitpunkte oder unterschiedlichen Apoptose-Kinetiken) die Gefahr von Fehlinterpretationen. Sekundär nekrotische Zellen stellen sich nach durchflußzytometrischer Analyse als Propidiumiodid-positiv dar (vgl. auch Abb. 5). Solche, noch als Zellen zu identifizierende, Ereignisse desintegrieren jedoch sehr rasch (Membran-, Kernfragmente), so daß auch dieser Parameter nur bedingt zum Nachweis eines induzierten Zelltodes geeignet schien. [...]

Auf diesen Überlegungen basierte die Auswahl des dargestellten quantitativen durchflußzytometrischen Verfahrens zur Prüfung der Modulation der Zellvitalität. Prinzipiell wurden die, nach bestimmten Zeiten in vitro noch nachweisbaren, vitalen Zellen gezählt und als verläßlichster Parameter der Zellvitalität in vitro angesehen. Es kann aus den dargelegten Gründen nicht mit Bestimmtheit festgelegt werden, ob das im folgenden beschriebene beschleunigte Absterben der neutrophilen Granulozyten auf der Induktion von Apoptose oder der Nekrose beruht, oder ob eventuell sogar beide Mechanismen des Zelltodes daran beteiligt sind. Allerdings wird für den spontanen und den induzierten Zelltod polymorphkerniger Granulozyten in vivo und in vitro generell die Induktion der Apoptose verantwortlich gemacht (HASLETT et al. 1985, PAYNE et al. 1994, GASMI et al. 1996, WALZOG et al. 1997, HANNAH et al. 1998), obgleich über die einzelnen, regulierenden Kontrollmechanismen immer noch wenig bekannt ist (WALZOG et al. 1997, TSUCHIDA et al. 1995).


ALAM, A., L.Y. COHEN, S. AOUAD & R.-P. SÉKALY (1999)
Early activation of caspases during T lymphocyte stimulation results in selective substrate cleavage in nonapoptotic cells.
J. Exp. Med. 190, 1879-1890

FADOK, V.A., D.R. VOELKER, P.A. CAMPBELL, J.J. COHEN, D.L. BRATTON & P.M. HENSON (1992)
Exposure of phosphatidylserine on the surface of apoptotic lymphocytes triggers specific recognition and removal by macrophages.
J. Immunol. 148, 2207-2216

GASMI, L., A.G. MCLENNAN & S.W. EDWARDS (1996)
The diadenosine polyphosphates Ap3A and Ap4A and adenosine triphosphate interact with granulocyte-macrophage colony-stimulating factor to delay neutrophil apoptosis: implications for neutrophil: platelet interactions during inflammation.
Blood 87, 3442-3449

HANNAH, S., I. NADRA, I. DRANSFIELD, J.G. PRYDE, A.G. ROSSI & C. HASLETT (1998)
Constitutive neutrophil apoptosis in culture is modulated by cell density independently of beta2 integrin-mediated adhesion.
FEBS Lett. 421, 141-146

HASLETT, C., L.A. GUTHRIE, M.M.KOPANIAK, R.B. JOHNSTON & P.M. HENSON (1985)
Modulation of multiple neutrophil functions by preparative methods or trace concentrations of bacterial lipopolysaccharide.
Am. J. Pathol. 119, 101-110

LUNDQVIST-GUSTAFSSON, H., & T. BENGTSSON (1999)
Activation of the granule pool of the NADPH oxidase accelerates apoptosis in human neutrophils.
J. Leukoc. Biol. 65, 196-204

PAYNE, C.M., L. GLASSER, M.E. TISCHLER, D. WYCKOFF, D. CROMEY, R. FIEDERLEIN & O. BOHNERT (1994)
Programmed cell death of the normal human neutrophil: an in vitro model of senescence.
Microsc. Res. Tech. 28, 327-344

TSUCHIDA, H., Y. TAKEDA, H. TAKEI, H. SHINZAWA, T. TAKAHASHI & F. SENDO (1995)
In vivo regulation of rat neutrophil apoptosis occuring spontaneously or induced with TNF-α or Cycloheximide.
J. Immunol. 154, 2403-2412

WALSH, G.M., G. DEWSON, A.J. WARDLAW, F. LEVI-SCHAFFER & R. MOQBEL (1998)
A comparative study of different methods for the assessment of apoptosis and necrosis in human eosinophils.
J. Immunol. Meth. 217, 153-163

WALZOG, B., F. JEBLONSKI, A. ZAKRZEWICZ P. GAEHTGENS (1997)
Beta2 integrins (CD11/CD18) promote apoptosis of human neutrophils.
FASEB J. 11, 1177-1186

Anmerkungen

Ohne Hinweis auf eine Übernahme, die Quelle ist in der Mitte des wörtlich übernommenen Texts genannt.

Sichter
(Graf Isolan), Hindemith


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Letzte Bearbeitung dieser Seite: durch Benutzer:Hindemith, Zeitstempel: 20140710012101

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