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Typus
KomplettPlagiat
Bearbeiter
SleepyHollow02
Gesichtet
Yes.png
Untersuchte Arbeit:
Seite: 63, Zeilen: 1 ff. (komplett)
Quelle: Bente 2003
Seite(n): 35, Zeilen: 1 ff.
2.16.4 Quantitative real-time Polymerasekettenreaktion (QRT-PCR)

Einleitung

Die quantitative real-time PCR ist eine relativ neue Technik, die zu Beginn der 1990er Jahre entwickelt wurde und seit ca. acht Jahren für den kommerziellen Markt verfügbar ist. Einen starken Anstieg der Nutzung dieser Methode gab es in den letzten drei Jahren. Während die Anzahl der Veröffentlichungen in der internationalen Datenbank Medline 1996 19, 1997 28 und 1998 52 betrug, stieg die Zahl 1999 auf 157, 2000 auf 409 und im Jahre 2001 sogar auf 551 (SCHMITTGEN 2001). Die Technologie kombiniert die DNA Amplifikation (PCR) mit der Detektion des Produktes in einem einzigen Reaktionsgefäß vom Ansatz bis zur Auswertung. Durch das Wegfallen der zeitaufwendigen Auswertung mittels Agarose- Gelelektrophorese bietet diese Methode ferner eine beachtliche Zeitersparnis. Bei der Entwicklung dieser Technik war die Grundidee der Versuch, die Amplifikation des PCR Produktes „live“ zu beobachten. Die ersten Ansätze bestanden darin, die PCR alle fünf Zyklen zu stoppen, ein Aliquot zu entnehmen und auszuwerten (GINZINGER 2001). Dieser Ansatz war, insbesondere bei hohem Probenaufkommen, sehr zeit- und arbeitsaufwendig und barg zudem ein hohes Kontaminationsrisko. Weiterführende Arbeiten beschäftigten sich mit der Markierung der DNA-Fragmente während der Reaktion. Anfang der 1990er wurde festgestellt, dass man über die 5` - 3`Exonuklease Aktivität der Taq-Polymerase eine indirekte Aussage über die Zunahme der Amplifikate während der PCR machen kann. Zu diesem Zweck wurden radioaktiv markierte Sonden verwendet, die mit den Amplifikaten hybridisierten und durch die Taq-Polymerase enzymatisch gespalten wurden (HOLLAND et al. 1991). Vier Jahre später konnten die radioaktiv markierten Sonden durch Fluorochrom-markierte Sonden ersetzt werden (LEE et al. 1995). Zur selben Zeit zeigte eine andere Forscher, dass auch eine direkte Messung der entstehenden Produkte während der PCR mittels Verwendung interkalierender Farbstoffe möglich ist (HIGUCHI et al.1992, 1993). Bei beiden Entwicklungen erfolgte die Auswertung durch Messung der Fluoreszenz vor und nach der PCR-Reaktion in einem separaten Gefäß. Durch die Kombination eines Thermocyclers mit einer Lichtquelle in Form einer Halogenlampe, eines Lasers oder LEDs (Licht emittierende Diode) sowie eines optischen Detektionsmoduls, konnte nur wenige Jahre später, die Fluoreszenz auch während der laufenden PCR gemessen werden. Eine Auswertung in [Echtzeit (engl.: real-time) war nun möglich (ISHIGURO et al. 1995; WITTWER et al.1997).]


SCHMITTGEN TD. (2001) : Real-time quantitative PCR. Methods ,253, 83-5

[...]

2.3 Quantitative real-time Polymerasekettenreaktion (QRT-PCR)

2.3.1 Einleitung

Die quantitative real-time PCR ist eine relativ neue Technik, die zu Beginn der 1990er Jahre entwickelt wurde und seit ca. sechs Jahren für den kommerziellen Markt verfügbar ist. Einen starken Anstieg der Nutzung dieser Methode gab es in den letzten drei Jahren. Während die Anzahl der Veröffentlichungen in der internationalen Datenbank Medline 1996 19, 1997 28 und 1998 52 betrug, stieg die Zahl 1999 auf 157, 2000 auf 409 und im Jahre 2001 sogar auf 551 (SCHMITTGEN 2002). Die Technologie kombiniert die DNA Amplifikation (PCR) mit der Detektion des Produktes in einem einzigen Reaktionsgefäß vom Ansatz bis zur Auswertung. Durch das Wegfallen der zeitaufwendigen Auswertung mittels Agarose- Gelelektrophorese bietet diese Methode ferner eine erhöhte Zeitersparnis. Bei der Entwicklung dieser Technik war die Grundidee der Versuch, die Amplifikation des PCR-Produktes „live“ zu beobachten. Die ersten Ansätze bestanden darin, die PCR alle fünf Zyklen zu stoppen, ein Aliquot zu entnehmen und auszuwerten (GINZINGER 2001). Dieser Ansatz war, insbesondere bei hohem Probenaufkommen, sehr zeit- und arbeitsaufwendig und barg zudem ein hohes Kontaminationsrisko. Weiterführende Arbeiten beschäftigten sich mit der Markierung der DNA-Fragmente während der Reaktion. Anfang der 1990er wurde festgestellt, dass man über die 5` - 3`Exonuklease Aktivität der Taq-Polymerase eine indirekte Aussage über die Zunahme der Amplifikate während der PCR machen kann. Zu die Zweck wurden radioaktiv markierte Sonden verwendet, die mit den Amplifikaten hybridisierten und durch die Taq-Polymerase enzymatisch gespalten wurden (HOLLAND et al. 1991). Vier Jahre später konnten die radioaktiv markierten Sonden durch Fluorochrom-markierte Sonden ersetzt werden (LEE et al. 1995). Zur selben Zeit zeigte eine andere Forschungsgruppe, dass auch eine direkte Messung der entstehenden Produkte während der PCR mittels Verwendung interkalierender Farbstoffe möglich ist (HIGUCHI et al. 1992, 1993). Bei beiden Entwicklungen erfolgte die Auswertung durch Messung der Fluoreszenz vor und nach der PCR-Reaktion in einem separaten Gefäß. Durch die Kombination eines Thermocyclers mit einer Lichtquelle in Form einer Halogenlampe, eines Lasers oder LEDs (Licht emittierende Diode) sowie eines optischen Detektionsmoduls, konnte nur wenige Jahre später, die Fluoreszenz auch während der laufenden PCR gemessen werden. Eine Auswertung in Echtzeit (engl.: real-time) war nun möglich (ISHIGURO et al. 1995; WITTWER et al. 1997).


SCHMITTGEN T. D. (2001): Real-time quantitative PCR. Methods, 25, 383-5.

Anmerkungen

Kein Hinweis auf die Quelle. Die Eigenleistung beschränkt sich auf eine Aktualisierung ("seit ca. 8 Jahren" statt "seit ca. sechs Jahren") und die Korrektur einer Quellenangabe.

Sichter
(SleepyHollow02), Hindemith

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