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| Untersuchte Arbeit: Seite: 102, Zeilen: 2-21 |
Quelle: Frank 2000 Seite(n): 55, Zeilen: 16-34 |
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| Diese Ansätze wurden anschließend für 45 Min im Brutschrank inkubiert (37°C, 5% CO2).
Nach Resuspension wurden die Wells einer 96-Loch-Rundbodenmikrotiterplatte (s. 3.2.1) mit je 50 μl dieser Mikrobensuspensionen beschickt. Diesen Ansätzen wurden je 150 μl einer Zellsuspension mit einer Dichte von 0,66 x 106 Leukozyten/ml PBS hinzugegeben. Somit lag ein Zellen zu mikrobiellen Partikel-Verhältnis von ca 1:100 vor. Die Probensuspensionen wurden 30 Sekunden auf dem Mikrotiterplattenrüttler durchmischt und dann für 30 Min in einer feuchten Kammer (s. 3.1) im Brutschrank bei 37°C und 5% CO2 inkubiert (s. 3.1). Nach erneuter Durchmischung auf dem Plattenrüttler, um optimale Zell-Mikroben-Kontakte zu gewährleisten, wurde die 30minütige Inkubation fortgesetzt. Abschließend wurde die Platte für 10 Min auf Eis gestellt, um die Reaktion zu stoppen. Die Proben wurden dann in 100 μl Sheath fluid-PJ-Gemisch (s.3.2.5) in Röhrchen für die Durchflusszytometrie überführt. Auswertung Pro Ansatz wurden 10.000 Partikel durchflusszytometrisch gemessen. Unter ihnen befanden sich neben Leukozyten auch Mikrobenaggregate, die mit gemessen wurden. Diese Bakterienaggregate werden bei der Auswertung mit dem Programm WinMDI© (TROTTER 1999) aufgrund ihrer hohen Fluoreszenzintensität in FL1 (Abbildung 9) und ihrer FSC-SSC Werte (Abbildung 9) erkannt und von der Auswertung ausgeschlossen. Es wurden nur PJ-negative Leukozyten bewertet. Es wurde ermittelt, welcher Prozentsatz der Zellen phagozytierte. |
Zur Opsonisierung wurden die Streptokokken für 15 min im Brutschrank (37°C, 5% CO2) inkubiert. Nach Resuspension wurden die Vertiefungen einer 96-Well-Rundboden-Mikrotiterplatte (s. 3.1.1) mit 100 μl dieser Bakteriensuspensionen beschickt. Diesen Ansätzen wurden 100 μl einer Zellsuspension mit einer Dichte von 2 x 106 Leukozyten/ml PBS hinzugegeben. Somit lag ein Zellen-Bakterien-Verhältnis von 1:100 vor. Die
Probensuspensionen wurden 30 Sekunden auf dem Mikrotiterplattenrüttler durchmischt und dann für 30 min in einer feuchten Kammer (s. 3.1.8.4) im Brutschrank bei 37°C und 5% CO2 inkubiert. Nach erneuter Durchmischung auf dem Plattenrüttler, um optimale Zell-Bakterien-Kontakte zu gewährleisten, wurde die 30minütige Inkubation wiederholt. Daraufhin wurde die Platte in Eiswasser gestellt, um die Reaktion zu stoppen. Die Proben wurden in 100 μl Sheath fluid mit 6 μg Propidiumjodid/ml (s. 3.1.9) aufgenommen. Auswertung Pro Ansatz wurden 5.000 Partikel durchflußzytometrisch gemessen. Unter ihnen befanden sich neben Leukozyten Bakterienaggregate, die im „lifegate“ (s. 3.2.2) mitgemessen wurden. Diese Bakterienaggregate werden aber bei der Auswertung mit dem Programm WinMDI (TROTTER 1998) aufgrund ihrer hohen Fluoreszenzintensität in FL 3 (s. 3.2.2) genauso wie Pj-positive Zellen erkannt und von der Auswertung ausgeschlossen. Es wurden nur Pj-negative Granulozyten bewertet. Zum einen wurde ermittelt, welcher Prozentsatz der Granulozyten phagozytierte (Abb. 5, Population B). TROTTLER, J. (1998): „WinMDI“ Auswertungsprogramm für Durchflußzytometerdaten, Version 2.4 (Freeware) |
Ohne Hinweis auf eine Übernahme. Im Literaturverzeichnis von Ad findet sich weder ein Verweis auf Trotter (1998) noch auf Trottler (1998). Korrekt wäre übrigens "Joe Trotter". |
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