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94 gesichtete, geschützte Fragmente: Plagiat

[1.] Ad/Fragment 015 03 - Diskussion
Bearbeitet: 8. July 2014, 17:44 Hindemith
Erstellt: 7. July 2014, 19:45 (Singulus)
Ad, Fragment, Gesichtet, KomplettPlagiat, Rohwer 2004, SMWFragment, Schutzlevel sysop

Typus
KomplettPlagiat
Bearbeiter
Singulus
Gesichtet
Yes.png
Untersuchte Arbeit:
Seite: 15, Zeilen: 3ff.
Quelle: Rohwer 2004
Seite(n): 26, Zeilen: 4ff
Sämtliche Immunmechanismen, aus denen sich nach heutigem Verständnis das klinische Bild einer Allergie entwickeln kann, finden im Rahmen physiologischer Prozesse ihre Entsprechung. Die Initiation der jeweiligen Immunmechanismen ist immer Bestandteil einer adaptiven Immunantwort, während die reaktiven, häufig inflammatorischen Prozesse eher dem angeborenen Ast des Immunsystems angehören. Immunmechanismen, die sich, entgegen ihrer eigentlichen Bestimmung, inadäquat, oft in überschießendem Maße gegen Antigene richten und so zur Erkrankung des Individuums führen, bezeichnet man daher als Allergien. Sie sind somit Hypersensibilitäts-oder Überempfindlichkeitsreaktionen. Die vom Immunsystem mit einer solchen überschießenden Reaktion beantworteten Antigene werden als „Allergene“ bezeichnet. Diese Allergene sind zumeist exogene Antigene, deren Herkunft pflanzlicher, tierischer oder, im Einzelfall anorganischer Natur sein kann. Wenn sich die Antwort des Immunsystems gegen körpereigene Antigene richtet, grenzt man die Allergie (exogene Antigene) gegen die Autoagression ab (endogene Antigene).

GELL und COOMBS. (1968) teilten die Allergien in vier Typen ein und unterschieden dabei grob Antikörper vermittelte Immunreaktionen (Typen I bis III) von Antikörper unabhängigen, Zell vermittelten (Typ IV). Diese Formen von Immunmechanismen haben primär wichtige physiologische Bedeutungen. Aus weitgehend noch unbekannten Gründen können diese lebens- und funktionserhaltenden Mechanismen „überschießend“ ausgeführt und so zu Pathomechanismen werden. Eine Typ V Allergie, deren Antikörper abhängiger Pathomechanismus sich deutlich von den anderen Typen unterscheidet, hat bisher noch keinen allgemein gültigen Eingang ins Schrifttum gefunden.

Typ I-Allergien sind die Allergien vom Soforttyp, bei denen die klinischen Symptome in der Regel sehr schnell, meist innerhalb von Minuten (selten Stunden) nach dem Allergenkontakt auftreten. Diesem Mechanismus können protektive, regulatorische aber auch überschießende immunologische Reaktionen zugeordnet werden (COSTA et al. 1997).

Im Rahmen der immunologischen Antwort eines Individuums gegen ein Antigen synthetisieren B-Zellen, unter Einfluss von TH2-Zellen und deren Signalmolekülen [(Interleukinen) allergenspezifisches IgE.]

Sämtliche Immunmechanismen, aus denen sich nach heutigem Verständnis das klinische Bild einer Allergie entwickeln kann, finden im Rahmen physiologischer Prozesse ihre Entsprechung. Die Initiation der jeweiligen Immunmechanismen ist immer Bestandteil einer adaptiven Immunantwort, während die reaktiven, häufig inflammatorischen Prozesse eher dem angeborenen Ast des Immunsystems angehören. Immunmechanismen, die sich, entgegen ihrer eigentlichen Bestimmung, inadäquat, oft in überschießendem Maße gegen Antigene richten und so zur Erkrankung des Individuums führen, bezeichnet man daher als Allergien. Sie sind somit Hypersensibilitäts-oder Überempfindlichkeitsreaktionen. Die vom Immunsystem mit einer solchen überschießenden Reaktion beantworteten Antigene werden als „Allergene“ bezeichnet. Diese Allergene sind zumeist exogene Antigene, deren Herkunft pflanzlicher, tierischer oder, im Einzelfall anorganischer Natur sein kann. Wenn sich die Antwort des Immunsystems gegen körpereigene Antigene richtet, grenzt man die Allergie (exogene Antigene) gegen die Autoagression ab (endogene Antigene).

GELL und COOMBS (1968) teilten die Allergien in vier Typen ein und unterschieden dabei grob Antikörper vermittelte Immunreaktionen (Typen I bis III) von Antikörper unabhängigen, Zell vermittelten (Typ IV). Diese Formen von Immunmechanismen haben primär wichtige physiologische Bedeutungen. Aus weitgehend noch unbekannten Gründen können diese lebens- und funktionserhaltenden Mechanismen „überschießend“ ausgeführt und so zu Pathomechanismen werden. Eine Typ V Allergie, deren Antikörper abhängiger Pathomechanismus sich deutlich von den anderen Typen unterscheidet, hat bisher noch keinen allgemein gültigen Eingang ins Schrifttum gefunden.

Typ I-Allergien sind die Allergien vom Soforttyp, bei denen die klinischen Symptome in der Regel sehr schnell, meist innerhalb von Minuten (selten Stunden) nach dem Allergenkontakt auftreten. Diesem Mechanismus können protektive, regulatorische aber auch überschießende immunologische Reaktionen zugeordnet werden (COSTA et al. 1997).

Im Rahmen der immunologischen Antwort eines Individuums gegen ein Antigen synthetisieren B-Zellen, unter Einfluss von TH2-Zellen und deren Signalmolekülen (Interleukinen) allergenspezifisches IgE.

Anmerkungen

Selbsterklärend.

Sichter
(SIngulus) Schumann

[2.] Ad/Fragment 016 01 - Diskussion
Bearbeitet: 8. July 2014, 17:44 Hindemith
Erstellt: 7. July 2014, 19:54 (Singulus)
Ad, Fragment, Gesichtet, Rohwer 2004, SMWFragment, Schutzlevel sysop, Verschleierung

Typus
Verschleierung
Bearbeiter
Singulus
Gesichtet
Yes.png
Untersuchte Arbeit:
Seite: 16, Zeilen: 1ff. (komplett)
Quelle: Rohwer 2004
Seite(n): 26-27, Zeilen: 26: 29ff - 27: 1ff
[Im Rahmen der immunologischen Antwort eines Individuums gegen ein Antigen synthetisieren B-Zellen, unter Einfluss von TH2-Zellen und deren Signalmolekülen] (Interleukinen) allergenspezifisches IgE. Dieses IgE wird, im Gegensatz zu anderen Immunglobulinen, schon in unkomplexierter Form über den hochaffinen Fcε-Rezeptor I (FcεRI) auf der Oberfläche von v.a. Mastzellen und basophilen Granulozyten gebunden. Diese zwei Zelltypen exprimieren diesen Rezeptor konstitutiv, während er auf einigen anderen Zellen induziert werden kann (FROESE 1984).

Freies Serum-IgE hat eine Halbwertszeit von Wenigen [sic] stunden [sic] bis Tagen. Ungebunden liegt IgE im Vergleich zu anderen Immunglobulin-Isotypen in sehr geringen Konzentrationen im Serum vor. Allerdings ergeben sich hier tierartliche Unterschiede in stärkerem Maße, als bisher vermutet (WAGNER et al. 2002) Ein wesentlicher Grund für den niedrigen IgE Spiegel ist die Bindung an FcεRI, denn frei verfügbares IgE steigert die Expression dieses Rezeptor (FURUICHI et al. 1985; KUBO et al.2001). Durch die Expression neuer Rezeptoren für IgE wird der Serumspiegel an IgE gesenkt.

In letzter Zeit konnten verschiedene Arbeitsgruppen zeigen, dass bereits die Bindung von freiem IgE an seinen Rezeptor eine Signaltransduktion hervorruft (CHARLES et al. 2004). Bereits diese Bindung trägt zur Aktivierung, der Rezeptorexpression sowie zum Überleben der TypI-allergischen Effektorzellen bei (KITAURA et al. 2003).

Dieser autokrine Verstärkungsmechanismus der FcεRI Expression ist initial nur vom Isotyp, also dem IgE abhängig. Eine fortgesetzte Präsenz des Antigens (Allergens) kann aber eine positive Rückkopplung des Typ I Immunmechanismus bewirken, indem allergenspezifische B-Zellen iterativ aktiviert werden. Die notwendigen Zytokine werden von Basophilen und/oder Mastzellen selbst zur Verfügung gestellt (GAUCHAT et al. 1993; YANAGIHARA et al. 1998). Als Folge dominieren jene IgE-Idiotypen den Serumpool, deren B-Zellen wiederholt oder dauerhaft aktiviert werden.

Kommt es im weiteren zu einem erneuten Kontakt des Individuums mit dem Allergen, so führt dessen Bindung an die spezifischen zellständigen IgE-Moleküle der sensibilisierten Mastzellen oder Basophilen zu einer Kreuzvernetzung dieser Immunglobuline, sofern sie auf der Zelloberfläche in ausreichender Dichte vorhanden sind. Die so herbeigeführte Zusammenlagerung der Fcε-Rezeptoren aktiviert die Zelle, die zum einen innerhalb von Sekunden mit Degranulation präformierter Entzündungsmediatoren (u.a. Histamin, Proteoglykane, Proteasen) aus zytoplasmatischen Granula reagiert (Sofortreaktion). Zudem werden Arachidonsäuremetaboliten, wie bestimmte Leukotriene (Lipoxygenasemetaboliten; v.a. LTC4, LTD4, LTE4) und Prostaglandine (Cyclooxygenasemetaboliten; v.a. PGD2), aber [auch Zytokine (u.a. IL4, TNFα) neu synthetisiert und ausgeschüttet.]

Im Rahmen der immunologischen Antwort eines Individuums gegen ein Antigen synthetisieren B-Zellen, unter Einfluss von TH2-Zellen und deren Signalmolekülen (Interleukinen) allergenspezifisches IgE. Dieses IgE wird, im Gegensatz zu anderen Immunglobulinen, schon in unkomplexierter Form über den hochaffinen Fcε-Rezeptor I

[Seite 27]

(FcεRI) auf der Oberfläche von v.a. Mastzellen und basophilen Granulozyten gebunden. Diese zwei Zelltypen exprimieren diesen Rezeptor obligatorisch, während er auf einigen anderen Zellen induziert werden kann (FROESE 1984).

Freies Serum-IgE hat eine Halbwertszeit von wenigen Tagen. Ungebunden liegt IgE im Vergleich zu anderen Immunglobulin-Isotypen in sehr geringen Konzentrationen im Serum vor. Allerdings ergeben sich hier tierartliche Unterschiede in stärkerem Maße, als bisher vermutet. (IgE Spiegel aus WAGNER et al. 2002) Ein wesentlicher Grund für den niedrigen IgE Spiegel ist die Bindung an FcεRI, denn frei verfügbares IgE induziert diesen Rezeptor (FURUICHI et al. 1985; KUBO et al. 2001). Durch die Expression neuer Rezeptoren für IgE wird der Serumspiegel an IgE gesenkt.

In letzter Zeit konnten verschiedene Arbeitsgruppen zeigen, dass bereits die Bindung von freiem IgE an seinen Rezeptor eine Signaltransduktion hervorruft (CHARLES et al. 2004). Bereits diese Bindung trägt zur Aktivierung, der Rezeptorexpression sowie zum Überleben der allergischen Effektorzellen bei (KITAURA et al. 2003).

Dieser autokrine Verstärkungsmechanismus der FcεRI Expression ist initial nur vom Isotyp, also dem IgE abhängig. Eine fortgesetzte Präsenz des Antigens (Allergens) kann aber eine positive Rückkopplung des Typ I Immunmechanismus bewirken, indem allergenspezifische B-Zellen iterativ aktiviert werden. Die notwendigen Zytokine werden von Basophilen und/oder Mastzellen selbst zur Verfügung gestellt (GAUCHAT et al. 1993; YANAGIHARA et al. 1998). Als Folge dominieren jene IgE-Idiotypen den Serumpool, deren B-Zellen wiederholt oder dauerhaft aktiviert werden.

Kommt es im weiteren zu einem erneuten Kontakt des Individuums mit dem Allergen, so führt dessen Bindung an die spezifischen zellständigen IgE-Moleküle der sensibilisierten Mastzellen oder Basophilen zu einer Kreuzvernetzung dieser Immunglobuline, sofern sie auf der Zelloberfläche in ausreichender Dichte vorhanden sind. Die so herbeigeführte Zusammenlagerung der Fcε-Rezeptoren aktiviert die Zelle, die zum einen innerhalb von Sekunden mit Degranulation präformierter Entzündungsmediatoren (u.a. Histamin, Proteoglykane, Proteasen) aus zytoplasmatischen Granula reagiert (Sofortreaktion). Zudem werden Arachidonsäuremetaboliten, wie bestimmte Leukotriene (Lipoxygenasemetaboliten; v.a. LTC4, LTD4, LTE4) und Prostaglandine (Cyclooxygenasemetaboliten; v.a. PGD2), aber auch Zytokine (u.a. IL4, TNFα) neu synthetisiert und ausgeschüttet.

Anmerkungen
Sichter
(SIngulus) Schumann

[3.] Ad/Fragment 017 01 - Diskussion
Bearbeitet: 8. July 2014, 17:44 Hindemith
Erstellt: 7. July 2014, 20:05 (Singulus)
Ad, Fragment, Gesichtet, Rohwer 2004, SMWFragment, Schutzlevel sysop, Verschleierung

Typus
Verschleierung
Bearbeiter
Singulus
Gesichtet
Yes.png
Untersuchte Arbeit:
Seite: 17, Zeilen: 1ff (komplett)
Quelle: Rohwer 2004
Seite(n): 27-28, Zeilen: 27: 28ff - 28: 1ff
[Zudem werden Arachidonsäuremetaboliten, wie bestimmte Leukotriene (Lipoxygenasemetaboliten; v.a. LTC4, LTD4, LTE4) und Prostaglandine (Cyclooxygenasemetaboliten; v.a. PGD2), aber] auch Zytokine (u.a. IL4, TNFα) neu synthetisiert und ausgeschüttet. Diese erhalten die Entzündungsreaktion über Stunden aufrecht (Spätreaktion).

Im gesunden Individuum besiedeln die Mastzellen die Lamina propria der Schleimhäute sowie das Korium der Haut. Wie auch der Basophile entstehen die Mastzellen im Knochenmark. Während ihres Aufenthaltes im peripheren Blut beladen sich die Zellen mit monomerem IgE und verlassen derart sensibilisiert die Blutbahn. Dementsprechend werden die Fcε Rezeptoren mit einem zum Zeitpunkt der Beladung repräsentativem Querschnitt aller aktuellen IgE - Idiotypen im Serum ausgestattet. Im Gewebe können diese Zellen dann bei erneutem Kontakt zu einem Antigen, gegen das sie spezifische Immunglobuline gebunden haben, degranulieren. Mastzellen stellen somit einen wesentlichen Anteil der „first line of defense“ dar. Die freigesetzten Mediatoren bewirken im Gewebe eine lokale Begrenzung der Antigenverteilung, indem sich der Blutfluss im irritierten Bereich verlangsamt und die Exsudation von Plasma sich erhöht. Es kommt zur Ödembildung. Im Folgenden werden weitere Leukozyten chemotaktisch angelockt. Es etabliert sich eine Entzündung.

Seine physiologische Bedeutung hat dieser Mechanismus v.a. im Zuge der Immunantwort auf parasitäre Infektionen (Helminthen). Er ist aber auch bei der Abwehr anderer Pathogene, inklusive bakterieller, beteiligt.

Kommt es zur Ausprägung pathologischer Hypersensibilitätsreaktionen unter diesem Mechanismus können diese lokal beschränkt, aber auch systemisch ablaufen. Beispiele für Typ I Allergien des Menschen sind die allergische Rhinitis (Heuschnupfen), das Asthma, aber auch die systemische Anaphylaxie bis hin zum allergischen Schock.

Eine Aktivierung der Zellen zur Mediatorfreisetzung ist allerdings nicht alleine auf eine IgE-Vermittlung beschränkt. Auch andere Substanzen sind über spezifische Rezeptoren, z.B. IgG über FcγRI, IIa und III, in der Lage, eine Degranulation sowie die Neusynthese der Mediatoren auszulösen.

Untersuchungen bei allergischen Reaktionen haben bei Maus und Mensch gezeigt, dass hier verschiedene IgG-Isotypen beteiligt sind. Entsprechende Fcγ-Rezeptoren, die die Bindung von IgG-Isotypen auf Mastzellen ermöglichen, konnten auf humanen Mastzellen nachgewiesen werden (OKAYAMA et al. 2000).Weitere [sic] Untersuchungen haben gezeigt, dass bei der Maus das IgG1 (DOMBROWICZ et al. 1997) und beim Mensch das IgG4 (KIEKENS et al. 2000) eine modulatorische Rolle bei der Aktivierung der Effektorzellen der Typ I Allergie (Mastzellen, basophile Granulozyten) und damit bei der Freisetzung der allergischen Symptome auslösenden Mediatoren wie z.B. dem Histamin spielt. Nachgewiesen werden [konnte dies im Mausmodell: Mäusen, denen das IGHE Gen fehlt und die somit nicht in der Lage sind, IgE zu produzieren, zeigten dennoch anaphylaktische Reaktionen und nachgewiesene Mediatorfreisetzung aus Mastzellen (OETTGEN et al. 1994).]

Zudem werden Arachidonsäuremetaboliten, wie bestimmte Leukotriene (Lipoxygenasemetaboliten; v.a. LTC4, LTD4, LTE4) und Prostaglandine (Cyclooxygenasemetaboliten; v.a. PGD2), aber auch Zytokine (u.a. IL4, TNFα) neu synthetisiert und ausgeschüttet. Diese erhalten die Entzündungsreaktion über Stunden aufrecht (Spätreaktion).

Im gesunden Individuum besiedeln die Mastzellen die Lamina propria der Schleimhäute sowie die Subcutis der Epidermis. Wie auch der Basophile entstehen die Mastzellen im Knochenmark. Während ihres Aufenthaltes im peripheren Blut beladen sich die Zellen mit

[Seite 28]

monomerem IgE und verlassen derart sensibilisiert die Blutbahn. Dementsprechend werden die Fcε Rezeptoren mit einem zum Zeitpunkt der Beladung repräsentativem Querschnitt aller IgE - Idiotypen im Serum ausgestattet .Im Gewebe können diese Zellen dann bei erneutem Kontakt zu einem Antigen, gegen das sie spezifische Immunglobuline gebunden haben, degranulieren. Mastzellen stellen somit einen wesentlichen Anteil der „first line of defense“ dar. Die freigesetzten Mediatoren bewirken im Gewebe eine lokale Begrenzung der Antigenverteilung, indem sich der Blutfluss im irritierten Bereich verlangsamt und die Exsudation von Plasma sich erhöht. Es kommt zur Ödembildung. Im Folgenden werden weitere Leukozyten chemotaktisch angelockt. Es etabliert sich eine Entzündung. Seine physiologische Bedeutung hat dieser Mechanismus v.a. im Zuge der Immunantwort auf parasitäre Infektionen (Helminthen). Er ist aber auch bei der Abwehr anderer Pathogene, inklusive bakterieller, beteiligt.

Kommt es zur Ausprägung pathologischer Hypersensibilitätsreaktionen unter diesem Mechanismus können diese lokal beschränkt, aber auch systemisch ablaufen. Beispiele für Typ I Allergien des Menschen sind die allergische Rhinitis (Heuschnupfen), das Asthma, aber auch die systemische Anaphylaxie bis hin zum allergischen Schock.

Eine Aktivierung der Zellen zur Mediatorfreisetzung ist allerdings nicht alleine auf eine IgE-Vermittlung beschränkt. Auch andere Substanzen sind über spezifische Rezeptoren, z.B. IgG über FcγRI, IIa und III, in der Lage, eine Degranulation sowie die Neusynthese der Mediatoren auszulösen.

Untersuchungen bei allergischen Reaktionen haben bei Maus und Mensch gezeigt, dass hier verschiedene IgG-Isotypen beteiligt sind. Entsprechende Fcγ-Rezeptoren, die die Bindung von IgG-Isotypen auf Mastzellen ermöglichen, konnten auf humanen Mastzellen nachgewiesen werden (OKAYAMA et al. 2000 & 2003). Weitere Untersuchungen haben gezeigt, dass bei der Maus das IgG1 (DOMBROWICZ et al. 1997) und beim Mensch das IgG4 (KIEKENS et al. 2000) eine modulatorische Rolle bei der Aktivierung der Effektorzellen der Typ I Allergie (Mastzellen, basophile Granulozyten) und damit bei der Freisetzung der allergischen Symptome auslösenden Mediatoren wie z.B. dem Histamin spielt. Nachgewiesen werden konnte dies im Mausmodell: Mäusen, denen das IGHE Gen fehlt und die somit nicht in der Lage sind, IgE zu produzieren, zeigten dennoch anaphylaktische Reaktionen und nachgewiesene Mediatorfreisetzung aus Mastzellen (OETTGEN et al. 1994).

Anmerkungen

Selbsterklärend.

Sichter
(SIngulus) Schumann

[4.] Ad/Fragment 018 01 - Diskussion
Bearbeitet: 8. July 2014, 17:50 Hindemith
Erstellt: 7. July 2014, 20:22 (Singulus)
Ad, Fragment, Gesichtet, KomplettPlagiat, Rohwer 2004, SMWFragment, Schutzlevel sysop

Typus
KomplettPlagiat
Bearbeiter
Singulus
Gesichtet
Yes.png
Untersuchte Arbeit:
Seite: 18, Zeilen: 1ff (komplett)
Quelle: Rohwer 2004
Seite(n): 28-29, Zeilen: 28: 29ff - 29: 1ff
[Nachgewiesen werden] konnte dies im Mausmodell: Mäusen, denen das IGHE Gen fehlt und die somit nicht in der Lage sind, IgE zu produzieren, zeigten dennoch anaphylaktische Reaktionen und nachgewiesene Mediatorfreisetzung aus Mastzellen (OETTGEN et al. 1994). Im Mausmodell ebenfalls nachgewiesen ist die inhibitorische Wirkung auf die IgE vermittelten allergischen Reaktionen durch FcγRIIb-Rezeptoren nach der Bindung von IgG (UJIKE et al. 1999; KATZ 2002).

Bei Typ II Mechanismen dagegen handelt es sich um durch Antikörper vom IgG- und IgM-Isotyp vermittelte Immunmechanismen. Auf der Oberfläche partikulärer Antigene gebundenes IgG (Antigen-Antikörper-Komplex) kann Phagozyten über deren Fc?-Rezeptoren dazu aktivieren, diese opsonisierten Antigene per Phagozytose zu eliminieren. Auf Zelloberflächen gebundenes IgG kann von NK-Zellen, die den FcγRIII exprimieren, erkannt werden, woraufhin diese die antikörpermarkierten Zielzellen zytotoxisch zerstören (antikörperabhängige zelluläre Zytotoxizität (ADCC)). Ein dritter IgG-vermittelter Mechanismus ist die Aktivierung des klassischen Weges der Komplementkaskade über die Bindung von antigengebundenem IgG, und effektiver noch IgM, an C1q, einem von drei Proteinen im C1-Komplex. Die Aktivierung von C1q durch IgG erfordert jedoch eine ausreichend hohe Epitop- und Immunglobulindichte auf dem Pathogen, da dieser Komplementfaktor hierzu an mindestens zwei aktivierten Fc-Teilen komplementbindender Immunglobulinmoleküle binden muss.

Im Rahmen dieser Allergie sind die Antikörper gegen zellassoziierte Antigene gerichtet und lösen entweder über Phagozyten und NK-Zellen oder über das Komplementsystem die charakteristischen Effektormechanismen aus. Ein Beispiel aus der Humanmedizin hierfür sind die Überempfindlichkeitsreaktionen gegen Penicillin, Methyldopa oder Chinidin. Diese Medikamente binden auf der Zelloberfläche von Erythrozyten oder Thrombozyten. Existieren spezifische Antikörper, die diese Medikamente erkennen, binden diese und lösen eine Komplementaktivierung aus, die zur Entfernung der betroffenen Blutzellen und somit zur immunhämolytischen Anämie bzw. Thrombozytopenie führt.

Antikörper können ebenso gegen körpereigene Zell- oder Matrixantigene gebildet werden und sind unter dem Typ II-Mechanismus so die Ursache für Autoimmunerkrankungen, wie die autoimmune hämolytische Anämie, thrombozytopenische Purpura, Goodpasture-Syndrom, oder Pemphigus vulgaris.

Nachgewiesen werden konnte dies im Mausmodell: Mäusen, denen das IGHE Gen fehlt und die somit nicht in der Lage sind, IgE zu produzieren, zeigten dennoch anaphylaktische Reaktionen und nachgewiesene Mediatorfreisetzung aus Mastzellen (OETTGEN et al. 1994). Im Mausmodell ebenfalls nachgewiesen, ist die inhibitorische Wirkung auf die IgE vermittelten allergischen Reaktionen durch bestimmte FcγRIIb-Rezeptoren nach der Bindung von IgG (UJIKE et al. 1999; KATZ et al. 2002).

[Seite 29]

Bei Typ II Mechanismen dagegen handelt es sich um durch Antikörper vom IgG- und IgM-Isotyp vermittelte Immunmechanismen. Auf der Oberfläche partikulärer Antigene gebundenes IgG (Antigen-Antikörper-Komplex) kann Phagozyten über deren Fcγ-Rezeptoren dazu aktivieren, diese opsonisierten Antigene per Phagozytose zu eliminieren. Auf Zelloberflächen gebundenes IgG kann von NK-Zellen, die den FcγRIII exprimieren, erkannt werden, woraufhin diese die antikörpermarkierten Zielzellen zytotoxisch zerstören (antikörperabhängige zelluläre Zytotoxizität (ADCC)). Ein dritter IgG-vermittelter Mechanismus ist die Aktivierung des klassischen Weges der Komplementkaskade über die Bindung von antigengebundenem IgG, und effektiver noch IgM, an C1q, einem von drei Proteinen im C1-Komplex. Die Aktivierung von C1q durch IgG erfordert jedoch eine ausreichend hohe Epitop- und Immunglobulindichte auf dem Pathogen, da dieser Komplementfaktor hierzu an mindestens zwei aktivierten Fc-Teilen komplementbindender Immunglobulinmoleküle binden muss.

Im Rahmen dieser Allergie sind die Antikörper gegen zellassoziierte Antigene gerichtet und lösen entweder über Phagozyten und NK-Zellen oder über das Komplementsystem die charakteristischen Effektormechanismen aus. Ein Beispiel aus der Humanmedizin hierfür sind die Überempfindlichkeitsreaktionen gegen Penicillin, Methyldopa oder Chinidin. Diese Medikamente binden auf der Zelloberfläche von Erythrozyten oder Thrombozyten. Existieren spezifische Antikörper, die diese Medikamente erkennen, binden diese und lösen eine Komplementaktivierung aus, die zur Entfernung der betroffenen Blutzellen und somit zur immunhämolytischen Anämie bzw. Thrombozytopenie führt.

Antikörper können ebenso gegen körpereigene Zell- oder Matrixantigene gebildet werden und sind unter dem Typ II-Mechanismus so die Ursache für Autoimmunerkrankungen, wie die autoimmune hämolytische Anämie, thrombozytopenische Purpura, Goodpasture-Syndrom, oder Pemphigus vulgaris.

Anmerkungen

Selbsterklärend.

Sichter
(SIngulus) Schumann

[5.] Ad/Fragment 019 01 - Diskussion
Bearbeitet: 8. July 2014, 17:44 Hindemith
Erstellt: 7. July 2014, 20:16 (Singulus)
Ad, Fragment, Gesichtet, KomplettPlagiat, Rohwer 2004, SMWFragment, Schutzlevel sysop

Typus
KomplettPlagiat
Bearbeiter
Singulus
Gesichtet
Yes.png
Untersuchte Arbeit:
Seite: 19, Zeilen: 1ff (komplett)
Quelle: Rohwer 2004
Seite(n): 29-30, Zeilen: 29: 26ff - 30: 1ff
Auch bei Immunmechanismen vom Typ III sind Antikörper beteiligt. Im Gegensatz zu Typ II-Mechanismen sind die Antikörper jedoch gegen lösliche Antigene gerichtet, mit denen sie primär lösliche Immunkomplexe bilden.

Die im Verlauf der physiologischen Immunreaktion gebildeten Antigen-Antikörper-Komplexe aktivieren – wenn komplementbindende Isotypen beteiligt sind -das Komplementsystem (klassischer Weg), werden mit dessen Hilfe über den Komplementfaktor C3b an Erythrozyten angelagert (Komplementrezeptor 1 (CR1)) und zur Milz und Leber transportiert, wo sie von Makrophagen phagozytiert werden.

Bei der Typ III-Allergie entstehen durch Antigenüberschuss relativ kleine Aggregate von Antigen-Antikörper-Komplexen. Durch diese wird das Komplementsystem schlechter aktiviert (mangels komplementbindender Antikörperisotypen) und deshalb werden diese Immunkomplexe schlechter oder gar nicht an Erythrozyten gebunden, da diese zwar den Komplementrezeptor CR1, jedoch keine Fc-Rezeptoren haben. Dies führt zu einem verminderten Abbau kleiner Immunkomplexe. Diese freien Komplexe neigen dazu, sich an den Basalmembranen kleiner Gefäße abzulagern. Mastzellen können solche Komplexe binden (über FcγRIII) und dadurch aktiviert werden. Die TNFα-Freisetzung durch so aktivierte Mastzellen gilt als Hauptursache für die nachfolgenden Entzündungsreaktionen (WATANABE et al. 1999; BAUMANN et al. 2001), da hierdurch Leukozyten in das Entzündungsgebiet gelockt werden. Über eine Verknüpfung von Fc-Rezeptoren und Komplementrezeptoren auf Leukozyten werden diese aktiviert und lösen im Folgenden eine Schädigung des umliegenden Gewebes aus.

Ein klassisches Beispiel für die Typ III-Allergie ist die so genannte „Serumkrankheit“, die heute noch bei der Anti-Venin-Behandlung eine Rolle spielt. Serum von Pferden, die zuvor mit Schlangengift immunisiert wurden, dient dabei als Quelle für neutralisierende Antikörper bei der Behandlung von Schlangenbissen beim Menschen. Injizierte Bestandteile, insbesondere die Antikörper aus dem Pferdeserum, lösen eine adaptive Immunantwort des Empfängers mit Bildung anti equiner Antikörper aus, die bei wiederholter Applikation eines solchen Serums zur Immunkomplexbildung mit den zirkulierenden Antigenen führt. Diese massive Bildung von Immunkomplexen führt zu deren Ablagerung in Gefäßen, Nieren und Gelenken und somit zu autoagressiven Vasculitiden, Glomerulonephritis und Arthritiden. Auch Autoimmunerkrankungen können nach diesem Mechanismus ablaufen, z.B. bei der gemischten essentiellen Kryoglobulinämie (Antikörper gegen körpereigene Immunglobuline) oder dem systemischen Lupus erythematodes mit Bildung von ANA´s (Anti Nukleäre [Antikörper: Antikörper gegen u.a. körpereigene Zellkernbestandteile wie DNS, Histonen oder anderen Nukleoproteinen).]

Auch bei Immunmechanismen vom Typ III sind Antikörper beteiligt. Im Gegensatz zu Typ II-Mechanismen sind die Antikörper jedoch gegen lösliche Antigene gerichtet, mit denen sie primär lösliche Immunkomplexe bilden.

Die im Verlauf der physiologischen Immunreaktion gebildeten Antigen-Antikörper-Komplexe aktivieren – wenn komplementbindende Isotypen beteiligt sind -das Komplementsystem (klassischer Weg), werden mit dessen Hilfe über den Komplementfaktor C3b an Erythrozyten angelagert (Komplementrezeptor 1) und zur Milz und Leber transportiert, wo sie von Makrophagen phagozytiert werden.

Bei der Typ III-Allergie entstehen durch Antigenüberschuss relativ kleine Aggregate von Antigen-Antikörper-Komplexen. Durch diese wird das Komplementsystem schlechter aktiviert (mangels komplementbindender Antikörperisotypen) und deshalb werden diese

[Seite 30]

Immunkomplexe schlechter oder gar nicht an Erythrozyten gebunden, da diese zwar den Komplementrezeptor CR1, jedoch keine Fc-Rezeptoren haben. Dies führt zu einem verminderten Abbau kleiner Immunkomplexe. Diese freien Komplexe neigen dazu, sich an den Basalmembranen kleiner Gefäße abzulagern. Mastzellen können solche Komplexe binden (über FcγRIII) und dadurch aktiviert werden. Die TNFα-Freisetzung durch so aktivierte Mastzellen gilt als Hauptursache für die folgenden Entzündungsreaktionen (WATANABE et al. 1999; BAUMANN et al. 2001), da hierdurch Leukozyten in das Entzündungsgebiet gelockt werden. Über eine Verknüpfung von Fc-Rezeptoren und Komplementrezeptoren auf Leukozyten werden diese aktiviert und lösen im Folgenden eine Schädigung des umliegenden Gewebes aus.

Ein klassisches Beispiel für die Typ III-Allergie ist die so genannte „Serumkrankheit“, die heute noch bei der Anti-Venin-Behandlung eine Rolle spielt. Serum von Pferden, die zuvor mit Schlangengift immunisiert wurden, dient dabei als Quelle für neutralisierende Antikörper bei der Behandlung von Schlangenbissen beim Menschen. Injizierte Bestandteile, insbesondere die Antikörper aus dem Pferdeserum, lösen eine adaptive Immunantwort des Empfängers mit Bildung anti equiner Antikörper aus, die bei wiederholter Applikation eines solchen Serums zur Immunkomplexbildung mit den zirkulierenden Antigenen führt. Diese massive Bildung von Immunkomplexen führt zu deren Ablagerung in Gefäßen, Nieren und Gelenken und somit zu autoagressiven Vasculitiden, Glomerulonephritis und Arthritiden. Auch Autoimmunerkrankungen können nach diesem Mechanismus ablaufen, z.B. bei der gemischten essentiellen Kryoglobulinämie (Antikörper gegen körpereigene Immunglobuline) oder dem systemischen Lupus erythematodes mit Bildung von ANA´s (Anti Nukleäre Antikörper: Antikörper gegen u.a. körpereigene Zellkernbestandteile wie DNS, Histonen oder anderen Nukleoproteinen).

Anmerkungen

Selbsterklärend.

Sichter
(SIngulus) Schumann

[6.] Ad/Fragment 020 01 - Diskussion
Bearbeitet: 8. July 2014, 17:50 Hindemith
Erstellt: 7. July 2014, 20:31 (Singulus)
Ad, Fragment, Gesichtet, KomplettPlagiat, Rohwer 2004, SMWFragment, Schutzlevel sysop

Typus
KomplettPlagiat
Bearbeiter
Singulus
Gesichtet
Yes.png
Untersuchte Arbeit:
Seite: 20, Zeilen: 1ff (komplett)
Quelle: Rohwer 2004
Seite(n): 30-31, Zeilen: 30: 20ff - 31: 1ff
[Auch Autoimmunerkrankungen können nach diesem Mechanismus ablaufen, z.B. bei der gemischten essentiellen Kryoglobulinämie (Antikörper gegen körpereigene Immunglobuline) oder dem systemischen Lupus erythematodes mit Bildung von ANA´s (Anti Nukleäre] Antikörper: Antikörper gegen u.a. körpereigene Zellkernbestandteile wie DNS, Histonen oder anderen Nukleoproteinen).

Letztlich besteht noch die Möglichkeit, dass Antikörper, ohne Beteiligung von Fcvermittelten Sekundärreaktionen allein durch ihre spezifische Bindung zur Erkrankung führen (Typ V-Reaktionen). Unter physiologischen Umständen erfüllen Antikörper neben ihrer vermittelnden Rolle im Rahmen der Opsonisierung und Komplementaktivierung auch ohne Beteiligung weiterer Faktoren, bestimmte Funktionen. So sind sie wichtig zur Neutralisation z.B. von Toxinen, oder beeinflussen über ihre Bindung an zellständige Rezeptoren z.B. die Produktion von weiteren Antikörpern.

Bei einer Typ V Allergie können die im Rahmen von Infektionen gebildeten Antikörper mit körpereigenen Strukturen, z.B. Rezeptoren kreuzreagieren und diese z.B. stimulieren (TSH-Rezeptoren bei Basedow-Krankheit) oder blockieren (Acetylcholinrezeptoren bei Myasthenia gravis).

Auch in der Zellvermittelten [sic] Immunantwort (Typ IV Immunmechanismus) kann es, ohne Beteiligung von Immunglobulinen, zu Störungen im Sinne von Allergie oder Autoaggression kommen. Wird ein Antigen von den antigenpräsentierenden Zellen hierbei über MHC-Klasse II an der Zelloberfläche gezeigt, werden dadurch CD-4-T-Zellen (T-Helferzellen) angesprochen. Pathogen- und milieuabhängig können sich die CD-4-Zellen daraufhin in mindestens zwei Richtungen, TH1 oder TH2, differenzieren und im Weiteren anhand der Sekretion charakteristischer Zytokine und Chemokine z.B. Makrophagen aktivieren und B-Zellen zur IgG-Produktion anregen (TH1) oder z.B. durch Einfluss auf die Differenzierung antigenaktivierter B-Zellen eine v.a. antikörpervermittelte Immunantwort auslösen (TH2).

Im Verlauf von Überempfindlichkeitsreaktionen vom Typ IV erfolgt die Differenzierung der T-Helferzellen zu TH1-Zellen, bei Typ I-Allergien zu TH2. Altbekanntes Beispiel einer T-Zell vermittelten Allergie ist die Tuberkulinreaktion, aber auch Kontaktallergien, z.B. auf Pentadecacatechol, einer Substanz aus den Blättern des Gift-Sumach oder Metallionen, wie Nickel und Chrom fallen unter diese Kategorie. Eine Autoimmunerkrankung, die diesem Mechanismus folgt ist z.B. die gegen das basische Myelinprotein (MBP) gerichtete autoaggressive Reaktion, die zur multiplen Sklerose führt.

Wird ein Antigen über MHC-Klasse I präsentiert, reagieren darauf CD-8-Zellen und differenzieren unter dem regulierenden Einfluss von T-Helferzellen zu zytotoxischen T-Zellen aus. Diese töten zum einen diese antigenpräsentierenden Zellen ab, können aber auch Zytokine sezernieren, die u.a. Makrophagen anlocken und aktivieren (IFNγ, TNFα, TNFβ).

Auch Autoimmunerkrankungen können nach diesem Mechanismus ablaufen, z.B. bei der gemischten essentiellen Kryoglobulinämie (Antikörper gegen körpereigene Immunglobuline) oder dem systemischen Lupus erythematodes mit Bildung von ANA´s (Anti Nukleäre Antikörper: Antikörper gegen u.a. körpereigene Zellkernbestandteile wie DNS, Histonen oder anderen Nukleoproteinen).

Letztlich besteht noch die Möglichkeit, dass Antikörper, ohne Beteiligung von Fcvermittelten Sekundärreaktionen allein durch ihre spezifische Bindung zur Erkrankung führen (Typ V-Reaktionen). Unter physiologischen Umständen erfüllen Antikörper neben ihrer vermittelnden Rolle im Rahmen der Opsonisierung und Komplementaktivierung auch ohne Beteiligung weiterer Faktoren, bestimmte Funktionen. So sind sie wichtig zur Neutralisation z.B. von Toxinen, oder beeinflussen über ihre Bindung an zellständige Rezeptoren z.B. die Produktion von weiteren Antikörpern.

Bei einer Typ V Allergie können die im Rahmen von Infektionen gebildeten Antikörper mit körpereigenen Strukturen, z.B. Rezeptoren kreuzreagieren und diese z.B. stimulieren (TSH-Rezeptoren bei Basedow-Krankheit) oder blockieren (Acetylcholinrezeptoren bei Myasthenia gravis).

[Seite 31]

Auch in der Zell vermittelten [sic] Immunantwort (Typ IV Immunmechanismus) kann es, ohne Beteiligung von Immunglobulinen, zu Störungen im Sinne von Allergie oder Autoaggression kommen. Wird ein Antigen von den antigenpräsentierenden Zellen hierbei über MHC-Klasse II an der Zelloberfläche gezeigt, werden dadurch CD-4-T-Zellen (T-Helferzellen) angesprochen. Pathogen- und milieuabhängig können sich die CD-4-Zellen daraufhin in mindestens zwei Richtungen, TH1 oder TH2, differenzieren und im Weiteren anhand der Sekretion charakteristischer Zytokine und Chemokine z.B. Makrophagen aktivieren und B-Zellen zur IgG-Produktion anregen (TH1) oder z.B. durch Einfluss auf die Differenzierung antigenaktivierter B-Zellen eine v.a. antikörpervermittelte Immunantwort auslösen (TH2).

Im Verlauf von Überempfindlichkeitsreaktionen vom Typ IV erfolgt die Differenzierung der T-Helferzellen zu TH1-Zellen, bei Typ I-Allergien zu TH2. Altbekanntes Beispiel einer T-Zell vermittelten Allergie ist die Tuberkulinreaktion, aber auch Kontaktallergien, z.B. auf Pentadecacatechol, einer Substanz aus den Blättern des Gift-Sumach oder Metallionen, wie Nickel und Chrom fallen unter diese Kategorie. Eine Autoimmunerkrankung, die diesem Mechanismus folgt ist z.B. die gegen das basische Myelinprotein (MBP) gerichtete autoaggressive Reaktion, die zur multiplen Sklerose führt.

Wird ein Antigen über MHC-Klasse I präsentiert, reagieren darauf CD-8-Zellen und differenzieren unter dem regulierenden Einfluss von T-Helferzellen zu zytotoxischen T-Zellen aus. Diese töten zum einen diese antigenpräsentierenden Zellen ab, können aber auch Zytokine sezernieren, die u.a. Makrophagen anlocken und aktivieren (IFNγ, TNFα, TNFβ).

Anmerkungen

Selbsterklärend.

Sichter
(SIngulus) Schumann

[7.] Ad/Fragment 021 01 - Diskussion
Bearbeitet: 8. July 2014, 17:49 Hindemith
Erstellt: 7. July 2014, 20:37 (Singulus)
Ad, Fragment, Gesichtet, Rohwer 2004, SMWFragment, Schutzlevel sysop, Verschleierung

Typus
Verschleierung
Bearbeiter
Singulus
Gesichtet
Yes.png
Untersuchte Arbeit:
Seite: 21, Zeilen: 1ff (komplett)
Quelle: Rohwer 2004
Seite(n): 31-32, Zeilen: 31: 22ff - 32: 1ff
Lipidlösliche Allergene, wie Pentadecacatechol können über diesen Weg eine Gewebsschädigung verursachen, da sie die Zellmembran durchqueren können und Proteine im Zellinneren verändern. Als Peptide gelangen diese dann über das endoplasmatische Reticulum und MHC-Klasse I-Moleküle an die Zelloberfläche, wo sie von CD-8-Zellen erkannt werden. (JANEWAY & TRAVERS 2002)

Diese hier beschriebene Klassifikation der Immunmechanismen (Typ I-V) wurde in die Veterinärmedizin übernommen, obwohl sie sich größtenteils auf Untersuchungen im humanen und murinen System stützt. In wie weit sich die zu Grunde liegenden Immunmechanismen auf andere Spezies, insbesondere auf das Pferd, in allen Einzelaspekten transponieren lassen, ist heute in weiten Teilen noch ungeklärt.

2.2 Das Sommerekzem – eine Typ-I-Allergie des Pferdes

Das Interesse an der Typ I Allergie wuchs, als die Häufigkeit dieser Erkrankung beim Menschen zunahm. Lange bevor die immunologischen Grundlagen einer Typ I Allergie erkannt wurden, berichteten französische Pferdehalter um 1840 von einer saisonal auftretenden Dermatitis (Lecoq 1842/43, Ref. in UNKEL 1985). Zu dieser Zeit war das Sommerekzem in Indien ebenfalls bereits bekannt (DATTA, 1939, Ref. in UNKEL 1985). Mittlerweile liegen vergleichbare symptomatische Beschreibungen aus allen Teilen der Welt vor, wenn auch mit den verschiedensten Bezeichnungen versehen (sweet itch, queensland itch, ardeurs, dermite estivale recidivante, Kasen). Dabei wird von erkrankten Pferden der verschiedensten Rassen berichtet. Araber scheinen ebenso betroffen zu sein, wie z.B. Quarter Horse, englische Vollblüter, deutsches Kaltblut, Haflinger oder Islandpferde. Sogar bei Eseln und Maultieren wird das Sommerekzem beschrieben. Eine eindeutige Rassendisposition besteht dabei nicht. Islandpferde stellen jedoch in Deutschland eine der stärker betroffenen Rassen dar. Die Erkrankungshäufigkeit dieser Rasse wird in verschiedenen Untersuchungen zwischen 15% und 20%, für aus Island exportiere Tiere auf fast 25% geschätzt (UNKEL 1985). Andere berichten von bis zu 60-70% Erkrankungsrate exportierter Tiere (RÜSBÜLDT 1997) sowie persönliche Mitteilungen isländischer Pferdezüchter). Dies erklärt die enorme wirtschaftliche Bedeutung des Sommerekzems speziell für die isländische Landwirtschaft, deren Exportquoten seit Mitte der achtziger Jahre, nach bekannt werden dieser Zusammenhänge, dramatisch sanken. (UNKEL 1985).

Lipidlösliche Allergene, wie Pentadecacatechol können über diesen Weg eine Gewebsschädigung verursachen, da sie die Zellmembran durchqueren können und Proteine im Zellinneren verändern. Als Peptide gelangen diese dann über das endoplasmatische Reticulum und MHC-Klasse I-Moleküle an die Zelloberfläche, wo sie von CD-8-Zellen erkannt werden. (JANEWAY und TRAVERS 2002)

Diese hier beschriebene Klassifikation der Immunmechanismen (Typ I-V) wurde in die Veterinärmedizin übernommen, obwohl sie sich größtenteils auf Untersuchungen im humanen und murinen System stützt. In wie weit sich die zu Grunde liegenden Immunmechanismen auf andere Spezies, insbesondere auf das Pferd, in allen Einzelaspekten transponieren lassen, ist heute in weiten Teilen noch ungeklärt

[Seite 32]

2.2.2 Die saisonal rekurrierende atopische Dermatitis des Pferdes – das Sommerekzem

Das Interesse an der Typ I Allergie wuchs, als die Häufigkeit dieser Erkrankung beim Menschen zunahm. Lange bevor die immunologichen [sic] Grundlagen einer Typ I Allergie erkannt wurden, berichteten französische Pferdehalter um 1840 von einer saisonal auftretenden Dermatitis (Lecoq 1842/43, Ref. in: UNKEL 1985). Zu dieser Zeit war das Sommerekzem in Indien ebenfalls bereits bekannt (DATTA, 1939, Ref. in: UNKEL 1985). Mittlerweile liegen vergleichbare symptomatische Beschreibungen aus allen Teilen der Welt vor, wenn auch mit den verschiedensten Bezeichnungen versehen (sweet itch, queensland itch, ardeurs, dermite estivale recidivante, Kasen). Dabei wird von erkrankten Pferden der verschiedensten Rassen berichtet. Araber scheinen ebenso betroffen zu sein, wie z.B. Quarter Horse, englische Vollblüter, deutsches Kaltblut, Haflinger oder Islandpferde. Sogar bei Eseln und Maultieren wird das Sommerekzem beschrieben. Eine eindeutige Rassendisposition besteht dabei nicht. Islandpferde stellen jedoch in Deutschland eine der stärker betroffenen Rassen dar. Die Erkrankungshäufigkeit dieser Rasse wird in verschiedenen Untersuchungen zwischen 15% und 20%, für aus Island exportiere Tiere auf fast 25% geschätzt (UNKEL 1985). Andere berichten von bis zu 60-70% Erkrankungsrate exportierter Tiere (RÜSBÜLDT 2001 sowie persönliche Mitteilungen isländischer Pferdezüchter). Dies erklärt die enorme wirtschaftliche Bedeutung des Sommerekzems speziell für die isländische Landwirtschaft, deren Exportquoten seit Mitte der achtziger Jahre, nach bekannt werden dieser Zusammenhänge, dramatisch sanken. (UNKEL 1985, HECK 1991)

Anmerkungen

Kleine Änderungen bei den Literaturangaben

Sichter
(SIngulus) Schumann

[8.] Ad/Fragment 022 01 - Diskussion
Bearbeitet: 8. July 2014, 17:49 Hindemith
Erstellt: 7. July 2014, 20:44 (Singulus)
Ad, Fragment, Gesichtet, KomplettPlagiat, Rohwer 2004, SMWFragment, Schutzlevel sysop

Typus
KomplettPlagiat
Bearbeiter
Singulus
Gesichtet
Yes.png
Untersuchte Arbeit:
Seite: 22, Zeilen: 1ff (komplett)
Quelle: Rohwer 2004
Seite(n): 32-33, Zeilen: 43: 22ff - 33: 1ff
Durch eine Studie an Islandpferden im Rheinland konnte gezeigt werden, dass das Sommerekzem multifaktoriell vererbt wird. Dabei wird allerdings eine Heritabilität von nur etwa 10% angenommen, wobei der Einfluss der Stute hier unerklärlicherweise größer sein soll scheint, als der des Hengstes. Eine Disposition bezüglich Fellfarbe oder Geschlecht, wie von anderen Autoren vormals postuliert, konnte hier nicht nachgewiesen werden (UNKEL 1985). Dass es sich beim Sommerekzem um eine allergische Reaktion auf Stiche bestimmter blutsaugender Insekten handelt, wurde schon 1954 von RIECK aufgrund von Untersuchungen in Australien geschlossen. Heute gilt es als gesichert, dass insbesondere Culicoides spp. (Gnitzen) weltweit als die bevorzugten Auslöser anzusehen sind. Aber auch anderen Insektenarten wird eine gewisse Bedeutung zugewiesen, z.B. Stomoxis calcitrans und Simuliden spp. (HECK 1991). So wiesen BAKER und QUINN (1978) nach, dass auf die intradermale Applikation von Extrakten aus Culicoides, Stomoxis calcitrans bzw. Tabanidae alle sieben untersuchten Pferde bei Culicoides und drei der Tiere ebenfalls bei Stomoxis calcitrans mit einem subepidermalen Ödem und begrenzter Eosinophilie reagieren, ähnlich dem histopathologischen Bild des Sommerekzems. Der Versuch, die für das Sommerekzem verantwortlichen Allergene von Culicoides genauer zu identifizieren, indem aufgetrennte Fraktionen für intradermale Hauttests eingesetzt wurden, gelang nicht (MORROW et al. 1986). QUINN et al.. (1983) konnten die Reaktionsbereitschaft der Haut auf Culicoides Extrakte über das Serum erkrankter Tiere auf gesunde Pferde übertragen. Dies bestärkte den Verdacht, dass es sich beim Sommerekzem um eine Typ I Allergie handelt. Dies folgerten auch STROTHMANN-LÜERSSEN et al. (1992), die, in Übereinstimmung zur Flohbissallergie des Hundes und der saisonalen allergischen Dermatitis des Schafes, bei histologischen und biochemischen Untersuchungen von an Sommerekzem erkrankten Pferden sowohl eine Infiltration von eosinophilen Granulozyten, als auch einen Anstieg von entzündungs- und allergiespezifischen Leukotrienen in den veränderten Hautbereichen fanden. Die Ansammlung eosinophiler und neutrophiler Granulozyten und die Ödembildung nach intradermaler Applikation von Culicoides Extrakt kann zudem durch die Histamin-1Rezeptor Antagonisten Chlorphenamin und Mepyramin gehemmt werden (FOSTER et al. 1997) Zudem konnte in vitro gezeigt werden, dass auch bei Equiden eine phänotypische Differenzierung von TH1 und TH2 Zellen möglich ist, also entsprechend dem humanen System eine Immundeviation mittels Zytokinen auch in vivo als möglich gelten darf (AGGARWAL 1999). Durch eine Studie an Islandpferden im Rheinland konnte gezeigt werden, dass das Sommerekzem multifaktoriell vererbt wird. Dabei wird allerdings eine Heritabilität von nur etwa 10% angenommen, wobei der Einfluss der Stute hier unerklärlicherweise größer zu sein scheint, als der des Hengstes. Eine Disposition bezüglich Fellfarbe oder Geschlecht, wie von anderen Autoren vormals postuliert, konnte hier nicht nachgewiesen werden (UNKEL 1985).

Dass es sich beim Sommerekzem um eine allergische Reaktion auf Stiche bestimmter Blut saugender Insekten handelt, wurde schon 1954 von RIECK aufgrund von Untersuchungen in Australien geschlossen. Heute gilt es als gesichert, dass insbesondere Culicoides spp. (Gnitzen) weltweit als die bevorzugten Auslöser anzusehen sind. Aber auch anderen Insektenarten wird eine gewisse Bedeutung zugewiesen, z.B. Stomoxis calcitrans und Simuliden spp. (HECK 1991). So wiesen BAKER und QUINN (1978) nach, dass auf die intradermale Applikation von Extrakten aus Culicoides, Stomoxis calcitrans bzw. Tabanidae alle sieben untersuchten Pferde bei Culicoides und drei der Tiere ebenfalls bei Stomoxis

[Seite 33]

calcitrans mit einem subepidermalen Ödem und begrenzter Eosinophilie reagieren, ähnlich dem histopathologischen Bild des Sommerekzems. Der Versuch, die für das Sommerekzem verantwortlichen Allergene von Culicoides genauer zu identifizieren, indem aufgetrennte Fraktionen für intradermale Hauttests eingesetzt wurden, gelang nicht (MORROW et al. 1986). QUINN et al. (1983) konnten die Reaktionsbereitschaft der Haut auf Culicoides Extrakte über das Serum erkrankter Tiere auf gesunde Pferde übertragen. Dies bestärkte den Verdacht, dass es sich beim Sommerekzem um eine Typ I Allergie handelt. Dies folgerten auch STROTHMANN-LÜERSSEN et al. (1992), die, in Übereinstimmung zur Flohbissallergie des Hundes und der saisonalen allergischen Dermatitis des Schafes, bei histologischen und biochemischen Untersuchungen von an Sommerekzem erkrankten Pferden sowohl eine Infiltration von eosinophilen Granulozyten, als auch einen Anstieg von entzündungs- und allergiespezifischen Leukotrienen in den veränderten Hautbereichen fanden. Die Ansammlung eosinophiler und neutrophiler Granulozyten und die Ödembildung nach intradermaler Applikation von Culicoides Extrakt kann zudem durch die Histamin-1Rezeptor Antagonisten Chlorphenamin und Mepyramin gehemmt werden (FOSTER et al. 1997). Zudem konnte in vitro gezeigt werden, dass auch bei Equiden eine phänotypische Differenzierung von TH1 und TH2 Zellen möglich ist, also entsprechend dem humanen System eine Immundeviation mittels Zytokinen auch in vivo als möglich gelten darf (AGGARWAL & HOLMES 2000; AGGARWAL und HOLMES 1999).

Anmerkungen

Selbsterklärend.

Sichter
(SIngulus) Schumann

[9.] Ad/Fragment 023 01 - Diskussion
Bearbeitet: 8. July 2014, 17:49 Hindemith
Erstellt: 7. July 2014, 20:50 (Singulus)
Ad, Fragment, Gesichtet, KomplettPlagiat, Rohwer 2004, SMWFragment, Schutzlevel sysop

Typus
KomplettPlagiat
Bearbeiter
Singulus
Gesichtet
Yes.png
Untersuchte Arbeit:
Seite: 23, Zeilen: 1ff (komplett)
Quelle: Rohwer 2004
Seite(n): 33, 34, 35, Zeilen: 33: 33ff - 34: 1ff, 35: 1ff
Zur klinischen Ausprägung des Ekzems kommt es nach UNKEL (1985) bei über 80% der untersuchten Islandpferde innerhalb der ersten drei Lebensjahre, 94% der späteren Sommerekzemer entwickeln bis zur Vollendung ihres vierten Lebensjahres erstmals Symptome. Fohlen allerdings zeigen nahezu nie Anzeichen der Erkrankung, obwohl z.T. schon bei Fohlen und Jährlingen eine Sensibilisierung basophiler Granulozyten nachgewiesen werden konnte (KOBELT 2001). Bei isländischen Importpferden kommt es nach Untersuchungen aus Norwegen frühestens im zweiten Sommer nach Import, im Durchschnitt nach etwa vier Jahren, zu ersten klinischen Ausprägungen (HALLDORSDOTTIR & LARSEN 1991).

Eine kausale Therapie des Sommerekzems und damit der Typ I Allergie existiert bisher nicht. Versuche zur Hyposensibilisierung Culicoides-allergischer Pferde scheinen Erfolg versprechend (ANDERSON et al. 1996). Da das Allergen bisher nicht in aufgereinigter Form vorliegt und die Major Allergens erst bestimmt werden müssen, wird hierzu ein grober Gesamtextrakt der Mücke verwendet. Dieser birgt jedoch das Risiko, dass Immunreaktionen, insbesondere Allergien gegen andere als die spezifischen allergenen Bestandteile des Extraktes durch die Behandlung ausgelöst werden. Zieht man zudem in Betracht, dass ein großer Teil der Allergiker gegen mehr als nur ein Allergen sensibilisiert ist und somit prinzipiell gegen eine Reihe von Allergenen hyposensibilisiert werden müsste, werden die praktischen Grenzen dieser Therapieform deutlich.

Einen weiten Überblick über die von Tierärzten und Patientenbesitzern verwendeten (symptomatischen) Therapeutika gibt (RÜSBÜLDT 2001): So werden neben der äußerlichen Anwendung verschiedenster Fette und Öle und Insektenrepellents, u. a. Cortikoide oder Antihistaminika zur Immunsuppression eingesetzt, aber auch Homöopathika, Eigenblutbehandlungen und ihre Variationen, Bioresonanz oder biologisch aktive Peptide. BRÜNNLEIN (2001) konnte in ihren Untersuchungen zum Sommerekzem keinen dauerhaften und zuverlässigen Einfluss der weit verbreiteten Therapien mit Ökozon, Allergostop® I (Gegensensibilisierung nach Theurer) oder Insol® Dermatophyton auf die generelle oder Culicoides-spezifische Sensibilisierung nachweisen.

Erfolgversprechend bleibt bisher alleine eine möglichst weitreichende Allergenkarenz (Ekzemerdecken, Verbringen der Tiere in mückenfreie, bzw. arme Umgebung). Allerdings bedeutet auch dies keine Heilung der Allergie, sondern nur ein Verhindern der klinischen Symptome. Selbst nach bis zu fünfzehn Jahren Symptomfreiheit, erreicht durch Verbringen von sommerekzemkranken Tiere auf die Nordseeinsel Spiekeroog -die Gnitzen sind auf den [ostfriesischen Inseln auf Grund der ganzjährigen Westwinddrift nicht endemisch-, blieb die spezifische Sensibilisierung deutlich bestehen (KOBELT 2001).]

Zur klinischen Ausprägung des Ekzems kommt es nach UNKEL (1985) bei über 80% der untersuchten Islandpferde innerhalb der ersten drei Lebensjahre, 94% der späteren Sommerekzemer entwickeln bis zur Vollendung ihres vierten Lebensjahres erstmals Symptome. Fohlen allerdings zeigen nahezu nie Anzeichen der Erkrankung, obwohl z.T.

[Seite 34]

schon bei Fohlen und Jährlingen eine Sensibilisierung basophiler Granulozyten nachgewiesen werden konnte (KOBELT, 2001). Bei isländischen Importpferden kommt es nach Untersuchungen aus Norwegen frühestens im zweiten Sommer nach Import, im Durchschnitt nach etwa vier Jahren, zu ersten klinischen Ausprägungen (HALLDORSDOTTIR & LARSEN 1991).

[...]

Eine kausale Therapie des Sommerekzems und damit der Typ I Allergie existiert bisher nicht. Versuche zur Hyposensibilisierung Culicoides-allergischer Pferde scheinen Erfolg versprechend (ANDERSON et al. 1996). Da das Allergen bisher nicht in aufgereinigter Form vorliegt und die Major Allergens erst bestimmt werden müssen, wird hierzu ein grober Gesamtextrakt der Mücke verwendet. Dieser birgt jedoch das Risiko, dass Immunreaktionen,

[Seite 35]

insbesondere Allergien gegen andere als die spezifischen allergenen Bestandteile des Extraktes durch die Behandlung ausgelöst werden. Zieht man zudem in Betracht, dass ein großer Teil der Allergiker gegen mehr als nur ein Allergen sensibilisiert ist und somit prinzipiell gegen eine Reihe von Allergenen hyposensibilisiert werden müsste, werden die praktischen Grenzen dieser Therapieform deutlich.

Einen weiten Überblick über die von Tierärzten und Patientenbesitzern verwendeten (symptomatischen) Therapeutika gibt RÜSBÜLDT (2001): So werden neben der äußerlichen Anwendung verschiedenster Fette und Öle und Insektenrepellents, u. a. Cortikoide oder Antihistamininka zur Immunsuppression eingesetzt, aber auch Homöopathika, Eigenblutbehandlungen und ihre Variationen, Bioresonanz oder biologisch aktive Peptide. BRÜNNLEIN (2001) konnte in ihren Untersuchungen zum Sommerekzem keinen dauerhaften und zuverlässigen Einfluss der weit verbreiteten Therapien mit Ökozon, Allergostop® I (Gegensensibilisierung nach Theurer) oder Insol®Dermatophyton auf die generelle oder Culicoides-spezifische Sensibilisierung nachweisen.

Erfolg versprechend bleibt bisher alleine eine möglichst weitreichende Allergenkarenz (Ekzemerdecken, Verbringen der Tiere in mückenfreie, bzw. arme Umgebung). Allerdings bedeutet auch dies keine Heilung der Allergie, sondern nur ein Verhindern der klinischen Symptome. Selbst nach bis zu fünfzehn Jahren Symptomfreiheit, erreicht durch Verbringen von sommerekzemkranken Tiere auf die Nordseeinsel Spiekeroog -die Gnitzen sind auf den ostfriesischen Inseln auf Grund der ganzjährigen Westwinddrift nicht endemisch-, blieb die spezifische Sensibilisierung deutlich bestehen (KOBELT 2001).

Anmerkungen

Selbsterklärend.

Sichter
(SIngulus) Schumann

[10.] Ad/Fragment 024 01 - Diskussion
Bearbeitet: 8. July 2014, 17:49 Hindemith
Erstellt: 7. July 2014, 20:57 (Singulus)
Ad, Fragment, Gesichtet, KomplettPlagiat, Rohwer 2004, SMWFragment, Schutzlevel sysop

Typus
KomplettPlagiat
Bearbeiter
Singulus
Gesichtet
Yes.png
Untersuchte Arbeit:
Seite: 24, Zeilen: 1-4
Quelle: Rohwer 2004
Seite(n): 35, Zeilen: 18-23
[Selbst nach bis zu fünfzehn Jahren Symptomfreiheit, erreicht durch Verbringen von sommerekzemkranken Tiere auf die Nordseeinsel Spiekeroog -die Gnitzen sind auf den] ostfriesischen Inseln auf Grund der ganzjährigen Westwinddrift nicht endemisch-, blieb die spezifische Sensibilisierung deutlich bestehen (KOBELT 2001) Auch nach dieser langen Zeit hätte also ein erneuter Allergenkontakt den klinischen Ausbruch des Sommerekzems zur Folge. Selbst nach bis zu fünfzehn Jahren Symptomfreiheit, erreicht durch Verbringen von sommerekzemkranken Tiere auf die Nordseeinsel Spiekeroog -die Gnitzen sind auf den ostfriesischen Inseln auf Grund der ganzjährigen Westwinddrift nicht endemisch-, blieb die spezifische Sensibilisierung deutlich bestehen (KOBELT 2001). Auch nach dieser langen Zeit hätte also ein erneuter Allergenkontakt den klinischen Ausbruch des Sommerekzems zur Folge.
Anmerkungen

Selbsterklärend.

Sichter
(SIngulus) Schumann

[11.] Ad/Fragment 024 11 - Diskussion
Bearbeitet: 9. July 2014, 23:34 Hindemith
Erstellt: 6. July 2014, 19:29 (SleepyHollow02)
Ad, Fragment, Gesichtet, Kazak 2002, SMWFragment, Schutzlevel sysop, Verschleierung

Typus
Verschleierung
Bearbeiter
SleepyHollow02
Gesichtet
Yes.png
Untersuchte Arbeit:
Seite: 24, Zeilen: 11-31
Quelle: Kazak 2002
Seite(n): 21, Zeilen: 4 ff.
So beruht die Immunantwort gegen extrazelluläre Parasiten vor allem auf komplementbindenden Antikörpern, während intrazellulär vermehrende Viren oder Tuberkelbakterien durch eine T-Zell-Antwort bekämpft werden (PICHLER et al. 1996). Das Immunsystem hat folglich verschiedene Möglichkeiten zu reagieren. Dabei reagiert es normalerweise passend auf eine entsprechende Infektion, d.h. gegen einen intrazellulären Parasiten wird mit einer makrophagenaktivierenden Immunantwort reagiert und nicht mit einer (ineffektiven) Antikörperbildung. Nach und nach wird verständlich, daß gerade in der Wahl der Immunantwort Fehler auftreten können. Klinisch können diese Erkrankungen an einen Immundefekt erinnern, allerdings kann dennoch eine sehr starke, jedoch nicht passende und somit ineffiziente Immunantwort vorliegen. Krankheiten können somit Ausdruck einer nicht passenden Immunabwehr sein.

T-Lymphozyten können in verschiedene Subgruppen unterteilt werden: erstens basierend auf der Expression von unterschiedlichen Oberflächenmolekülen CD4 und CD8 (KUPFER & SINGER 1989), zweitens auf unterschiedlicher T-Zell-Rezeptoren (γδ-TCR oder β-TCR) (ALLISON & HAVRAN 1991), drittens auf unterschiedlicher Antigenerkennung/MHCRestriktion (KUPFER & SINGER 1989) und viertens auf unterschiedliche Zytokinsekretionsmuster (MOSMANN et al. 1986). Als T-Lymphozyten besitzen sie alle als gemeinsame Oberflächenstruktur das CD3.

Aktivierte T-Lymphozyten setzen zur Regulierung der Immunantwort eine Reihe von Zytokinen frei. Angesichts der großen Anzahl verschiedener Zytokine könnte man, je nach Dominanz des einen oder anderen Zytokins, viele unterschiedliche T-Lymphozyten[Subpopulationen (Th1, Th2, Th3, Th4) postulieren.]

So beruht die Immunantwort gegen extrazelluläre Parasiten vor allem auf komplementbindenden Antikörpern, während intrazellulär vermehrende Viren oder Tuberkelbakterien durch eine T-Zell-Antwort bekämpft werden (78). Das Immunsystem hat folglich verschiedene Möglichkeiten zu reagieren. Dabei reagiert es normalerweise passend auf eine entsprechende Infektion, d.h. gegen einen intrazellulären Parasiten wird mit einer makrophagenaktivierenden Immunantwort reagiert und nicht mit einer (ineffektiven) Antikörperbildung. Nach und nach wird verständlich, daß gerade in der Wahl der Immunantwort Fehler auftreten können. Klinisch können diese Erkrankungen an einen Immundefekt erinnern, allerdings kann dennoch eine sehr starke, jedoch nicht passende und somit ineffiziente Immunantwort vorliegen. Krankheiten können somit Ausdruck einer nicht passenden Immunabwehr sein.

T-Lymphozyten können in verschiedene Subgruppen unterteilt werden: erstens basierend auf der Expression von unterschiedlichen Oberflächenmolekülen CD4 und CD8 (79), zweitens auf unterschiedlicher T-Zell-Rezeptoren (gd-TCR oder ab-TCR) (80), drittens auf unterschiedlicher Antigenerkennung/MHC-Restriktion (79) und viertens auf unterschiedlicher Zytokinsekretionsmuster (81). Als T-Lymphozyten besitzen sie alle als gemeinsame Oberflächenstruktur das CD3.

[...]

Aktivierte T-Lymphozyten setzen zur Regulierung der Immunantwort eine Reihe von Zytokinen frei. Angesichts der großen Anzahl verschiedener Zytokine könnte man, je nach Dominanz des einen oder anderen Zytokins, viele unterschiedliche T-Lymphozyten- Subpopulationen (Th1, Th2, Th3, Th4) postulieren.


78. Pichler, W. J., Peter, H. H., and hänsch, M: Prinzipien des Immunsystems. Klinische Immunologie. Urban und Schwarzenberg (1996), S. 3-54

79. Kupfer, A. and Singer, S. J.: Cell biology of cytotoxic and helper T cell functions: immunofluorescence microscopic studies of single cells and cell couples. Annu.Rev.Immunol. 7:309-37 (1989), S. 309-337

80. Allison, J. P. and Havran, W. L.: The immunobiology of T cells with invariant gamma delta antigen receptors. Annu.Rev.Immunol. 9:679-705 (1991), S. 679-705

81. Mosmann, T. R. and Coffman, R. L.: Heterogeneity of cytokine secretion patterns and functions of helper T cells. Adv.Immunol. 46:111-47 (1989), S. 111-147

Anmerkungen

Kein Hinweis auf die Quelle. Referenzen werden mitübernommen.

Sichter
(SleepyHollow02), Hindemith

[12.] Ad/Fragment 025 01 - Diskussion
Bearbeitet: 9. July 2014, 23:40 Hindemith
Erstellt: 6. July 2014, 19:59 (SleepyHollow02)
Ad, Fragment, Gesichtet, Kazak 2002, SMWFragment, Schutzlevel sysop, Verschleierung

Typus
Verschleierung
Bearbeiter
SleepyHollow02
Gesichtet
Yes.png
Untersuchte Arbeit:
Seite: 25, Zeilen: 1 ff. (komplett)
Quelle: Kazak 2002
Seite(n): 21 f., Zeilen: 21: 22ff; 22: 1 ff.
[Angesichts der großen Anzahl verschiedener Zytokine könnte man, je nach Dominanz des einen oder anderen Zytokins, viele unterschiedliche T-Lymphozyten] Subpopulationen (Th1, Th2, Th3, Th4) postulieren. Gut nachgewiesen sind allerdings nur Th1- und Th2-Lymphozyten. Diese Dichotomie der T-Helfer-Zellen wurde zuerst bei der Maus (MOSMANN et al. 1986) später beim Menschen (ROMAGNANI 1996) und Pferd (AGGARWAL & HOLMES 1999) entdeckt. Dies trifft sowohl für CD4+- als auch für CD8+-T-Lymphozyten zu, ist aber bei CD4+-T-Zellen besser untersucht. Im Wesentlichen werden, wenn man Th0-Zellen als eigenständige Subpopulation betrachtet, 3 Subtypen unterschieden.

2.3.1 Th1-/Th2- Zellen

Chronische Stimulationen bewirken bei kürzlich aktivierten, unbeteiligten Vorläufer-CD4+-T- Helfer-Lymphozyten (pTh) ein Ausreifen dieser zu T-Zellen, welche ein eingeschränktes Zytokinmuster sezernieren. Diese weiter differenzierten T-Lymphozyten können nach Aktivierung in der Regel hohe Konzentrationen bestimmter Zytokine sezernieren.

Werden kürzlich aktivierte, unbeteiligte Vorläufer-CD4+-T-Helfer-Lymphozyten (pTh) mit IL-12, IFNγ oder TGFβ (Transforming growth factor) inkubiert, resultieren Th1-Zellen, die viel IFN□ [sic], IL-12, IL-2, TNF-β und TGF-β freisetzen, aber nur wenig bis kein IL-4, IL-5 (MAGGI et al. 1992, PARRONCHI et al. 1992). Werden kürzlich aktivierte, unbeteiligte Vorläufer-CD4+-T-Helfer- Lymphozyten (pTh) dagegen mit IL-4 inkubiert, entwickeln sich Th2-Zellen, die mehr IL-4, IL-6 und wenig bis kein IL-2, IL-12 synthetisieren (MAGGI et al. 1992; PARRONCHI et al 1992; ABEHSIRA-AMAR et al. 1992; MANETTI et al. 1993; HSIEH et al. 1993). Bei Kostimulation mit IL-4 und IL-12 dominiert die Wirkung des IL-4 (PEREZ et al. 1995; SCHMITT et al. 1994). Ähnlich ist es beim Th2-Zytokin IL-6, das in hohen Konzentrationen trotz Vorhandensein von IL-12 die Generierung von Th1-Zellen aus naiven T-Zellen verhindert (RINCON et al. 1997). Mäuse, die ein genetisches Expressionsdefizit für IL-12- oder IL-12Rβ1-Ketten haben, generieren keine Th1-Zellen (MAGRAM et al. 1996; WU et al. 1997). Ebenso bilden sich keine Th2-Zellen bei Mäusen, die keine IL-4- oder IL-4R-Ketten exprimieren können (KUHN et al. 1991; KOPF et al. 1993). Eine Zusammenfassung des Th1-/Th2-Konzepts ist in Abbildung 1 dargestellt.

Wichtig ist, dass die gebildeten Zytokine wie IL-4 oder IL-12 nicht nur das eigene Milieu stimulieren und amplifizieren (LICHTMAN et al. 1987), sondern auch die Entwicklung des anderen Milieus (Th1 bzw. Th2) unterdrücken. So hemmt die Zugabe von IL-4 die Ausreifung zu Th1 oder die Zugabe von IL-12 die Reifung von Vorläufer-CD4+-T-Helfer-Lymphozyten zu Th2 (MAGGI et al. 1992; PARRONCHI et al 1992; MANETTI et al. 1993; [HSIEH et al. 1993).]

Angesichts der großen Anzahl verschiedener Zytokine könnte man, je nach Dominanz des einen oder anderen Zytokins, viele unterschiedliche T-Lymphozyten-Subpopulationen (Th1, Th2, Th3, Th4) postulieren. Gut nachgewiesen sind allerdings nur Th1- und Th2-Lymphozyten. Diese Dichotomie der T-Helfer-Zellen wurde zuerst bei der Maus (82) und später beim Menschen entdeckt (21). Dies trifft sowohl für CD4+- als auch für

[Seite 22:]

CD8+-T-Lymphozyten zu, ist aber bei CD4+-T-Zellen besser untersucht. Im wesentlichen werden, wenn man Th0-Zellen als eigenständige Subpopulation betrachtet, 3 Subtypen unterschieden.

1.2.1 Th1- / Th2-Zellen

Chronische Stimulationen bewirken bei kürzlich aktivierten, unbeteiligten Vorläufer-CD4+-THelfer-Lymphozyten (pTh) ein Ausreifen dieser zu T-Zellen, welche ein mehr eingeschränktes Zytokinmuster sezernieren. Diese weiter differenzierten T-Lymphozyten können nach Aktivierung in der Regel hohe Konzentrationen bestimmter Zytokine sezernieren. Werden kürzlich aktivierte, unbeteiligte Vorläufer-CD4+-T-Helfer-Lymphozyten (pTh) mit IL- 12, IFNg oder TGFb (Transforming growth factor) inkubiert, resultieren Th1-Zellen, die viel IFNg, IL-12, IL-2, TNF-b und TGF-b (auch LT-a genannt) freisetzen, aber nur wenig bis kein IL-4, IL-5 (83, 84). Werden kürzlich aktivierte, unbeteiligte Vorläufer-CD4+-T-Helfer-Lymphozyten (pTh) dagegen mit IL-4 inkubiert, entwickeln sich Th2-Zellen, die mehr IL-4, IL-5 und IL-6 und wenig bis kein IL-2, IL-12 synthetisieren (84-87). Bei Kostimulation mit IL-4 und IL-12 dominiert die Wirkung des IL-4 (88, 89). Ähnlich ist es beim Th2-Zytokin IL-6, das in hohen Konzentrationen trotz Vorhandensein von IL-12 die Generierung von Th1-Zellen aus naiven T-Zellen verhindert (90). Mäuse, die ein genetisches Expressionsdefizit für IL-12- oder IL-12Rb1-Ketten haben, generieren keine Th1-Zellen (91, 92). Ebenso bilden sich keine Th2-Zellen bei Mäusen, die keine IL-4- oder IL-4Ra-Ketten exprimieren können (93, 94). Eine Zusammenfassung des Th1-/Th2-Konzepts ist in Abbildung 3 dargestellt.

Wichtig ist, daß die gebildeten Zytokine wie IL-4 oder IL-12 nicht nur das eigene Milieu stimulieren und amplifieren (95), sondern auch die Entwicklung des anderen Milieus (Th1 bzw. Th2) unterdrücken. So hemmt die Zugabe von IL-4 die Ausreifung zu Th1 oder die Zugabe von IL-12 die Reifung von Vorläufer-CD4+-T-Helfer-Lymphozyten zu Th2 (83, 84, 86, 87).


21. Romagnani, S.: Human Th1 and Th2 cells. Allergologie 19 (1996), S. 175-179

82. Mosmann, T. R., Cherwinski, H., Bond, M. W., Giedlin, M. A., and Coffman, R. L.: Two types of murine helper T cell clone. I. Definition according to profiles of lymphokine activities and secreted proteins. J.Immunol. 136 (7) (1986), S. 2348-2357

83. Maggi, E., Parronchi, P., Manetti, R., Simonelli, C., Piccinni, M. P., Rugiu, F. S. , DeCarli, M., Ricci, M., and Romagnani, S.: Reciprocal regulatory effects of IFNgamma and IL-4 on the in vitro development of human Th1 and Th2 clones. J.Immunol. 148 (7) (1992), S. 2142-2147

84. Parronchi, P., De Carli, M., Manetti, R., Simonelli, C., Sampognaro, S., Piccinni, M. P., Macchia, D., Maggi, E., Del Prete, G., and Romagnani, S.: IL-4 and IFN (alpha and gamma) exert opposite regulatory effects on the development of cytolytic potential by Th1 or Th2 human T cell clones. J.Immunol. 149 (9) (1992), S. 2977- 2983

85. Abehsira-Amar, O., Gibert, M., Joliy, M., Theze, J., and Jankovic, D. L.: IL-4 plays a dominant role in the differential development of Tho into Th1 and Th2 cells. J.Immunol. 148 (12) (1992), S. 3820-3829

86. Manetti, R., Parronchi, P., Giudizi, M. G., Piccinni, M. P., Maggi, E., Trinchieri, G., and Romagnani, S.: Natural killer cell stimulatory factor (interleukin 12 [IL-12]) induces T helper type 1 (Th1)-specific immune responses and inhibits the development of IL-4-producing Th cells. J.Exp.Med. 177 (4) (1993), S. 1199-1204

87. Hsieh, C. S., Macatonia, S. E., Tripp, C. S., Wolf, S. F., O'Garra, A., and Murphy, K. M.: Development of TH1 CD4+ T cells through IL-12 produced by Listeriainduced macrophages [see comments]. Science 260 (5107) (1993), S. 547-549

88. Perez, V. L., Lederer, J. A., Lichtman, A. H., and Abbas, A. K.: Stability of Th1 and Th2 populations. Int.Immunol. 7 (5) (1995), S. 869-875

89. Schmitt, E., Hoehn, P., Germann, T., and Rude, E. : Differential effects of interleukin-12 on the development of naive mouse CD4+ T cells. Eur.J.Immunol. 24 (2) (1994), S. 343-347

90. Rincon, M., Anguita, J., Nakamura, T., Fikrig, E. , and Flavell, R. A.: Interleukin (IL)-6 directs the differentiation of IL-4-producing CD4+ T cells. J.Exp.Med. 185 (3) (1997), S. 461-469

91. Magram, J., Connaughton, S. E., Warrier, R. R., Carvajal, D. M., Wu, C. Y., Ferrante, J., Stewart, C., Sarmiento, U., Faherty, D. A., and Gately, M. K.: IL-12-deficient mice are defective in IFN gamma production and type 1 cytokine responses. Immunity. 4 (5) (1996), S. 471-481

92. Wu, C., Ferrante, J., Gately, M. K., and Magram, J.: Characterization of IL-12 receptor beta1 chain (IL-12Rbeta1)-deficient mice: IL-12Rbeta1 is an essential component of the functional mouse IL- 12 receptor. J.Immunol. 159 (4) (1997), S. 1658-1665

93. Kuhn, R., Rajewsky, K., and Muller, W.: Generation and analysis of interleukin-4 deficient mice. Science 254 (5032) (1991), S. 707-710

94. Kopf, M., Le Gros, G., Bachmann, M., Lamers, M. C., Bluethmann, H., and Kohler, G.: Disruption of the murine IL-4 gene blocks Th2 cytokine responses. Nature 362 (6417) (1993), S. 245-248

95. Lichtman, A. H., Kurt-Jones, E. A., and Abbas, A. K.: B-cell stimulatory factor 1 and not interleukin 2 is the autocrine growth factor for some helper T lymphocytes. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 84 (3) (1987), S. 824-827

Anmerkungen

Kein Hinweis auf die Quelle. Referenzen werden mitübernommen.

Sichter
(SleepyHollow02), Hindemith

[13.] Ad/Fragment 026 01 - Diskussion
Bearbeitet: 9. July 2014, 19:39 Hindemith
Erstellt: 7. July 2014, 06:37 (SleepyHollow02)
Ad, Fragment, Gesichtet, Kazak 2002, SMWFragment, Schutzlevel sysop, Verschleierung

Typus
Verschleierung
Bearbeiter
SleepyHollow02
Gesichtet
Yes.png
Untersuchte Arbeit:
Seite: 26, Zeilen: 1-8, 13-31
Quelle: Kazak 2002
Seite(n): 22, 23, Zeilen: 22: 26ff; 23: 1 ff.
Insofern sind entsprechende Zytokine bzw. zytokinproduzierende Zellen suppressiv für die Entwicklung der anderen Art der Immunreaktion.

Dieser Grundsatz ist jedoch nicht einfach auf bereits polarisierte Th2-Zell-Klone übertragbar, da man durch IL-12 bei diesen T-Zellen in vitro eine Steigerung der IL-4-Produktion herbeiführen kann (SCHMITT et al. 1994; JEANNIN et al. 1995). IL-12 während einer Inokulation von Leishmania-Parasiten gegeben, bewirkt in Balb/c-Mäusen eine IFN-γ-Produktion und hemmt die IL-4-Bildung. Gibt man IL-12 jedoch zwei Wochen nach der Infektion, so kommt es zu einer erhöhten IL-4- Produktion (WANG et al. 1994).

[...]

2.3.2 Effektor-Funktionen der Th-Zellen-Subtypen

Insgesamt sollte man sich vergegenwärtigen, daß die Unterscheidung Th1/Th2 nicht immer ganz strikt ist und oft eher ein tendenzieller denn absoluter Unterschied der Zytokinproduktion zu messen ist. Besonders bei Menschen wird deshalb häufig der Begriff Th1- oder Th2-ähnlich (engl. Th1-like, Th2-like) verwendet. Dennoch ist diese Unterteilung konzeptionell sehr wertvoll, da sie unterschiedliche Immunreaktionen und somit unterschiedliche Krankheitsmanifestationen erklärt. Die klassische Einteilung in humorale und zellulär-vermittelte Immunität findet sich auf der Th-Zellebene in Th2- bzw. Th1-vermittelter Antworten wieder (MOSMANN et al. 1996; ABBAS et al. 1996).

Th1-Zellen repräsentieren die „zellvermittelte Immunität“. IFNγ, als Haupteffektorzytokin der Th1-Zellen, aktiviert Makrophagen und steigert deren mikrobioziden Angriff, stimuliert die Produktion von komplementbindendem und Phagozyten Fc-Rezeptor-bindendem IgG (ABBAS et al. 1994). Zusätzlich fördern Th1-spezifische Zytokine die Differenzierung von CD8+-Lymphozyten zu zytotoxischen Zellen und aktivieren Neutrophile und natürliche Killerzellen (NK-Zellen), d.h. sie sind für die Vernichtung von Bakterien (TRINCHIERI 1995), die Elimination von intrazellulären Erregern wie Bakterien, Viren und Parasiten (ABBAS et al. 1996) zuständig. Th2-Zellen vermitteln in erster Linie humorale Immunantworten. IL-4 und IL-5 fördern die Produktion von IgE und die Differenzierung und Aktivierung von eosinophilen Granulozyten (ABBAS et al. 1994). Außerdem verhelfen Th2-[Zellen B-Lymphozyten zur Produktion von großen Mengen an IgM und nichtkomplementbindenden IgG-Isotypen.]

Insofern sind entsprechend Zytokine bzw. zytokinproduzierende Zellen suppressiv für die Entwicklung der anderen Art der Immunreaktion.

Dieser Grundsatz ist jedoch nicht einfach auf bereits polarisierte Th2-Zell-Klone übertragbar, da man durch IL-12 bei diesen T-Zellen in vitro eine Steigerung der IL-4-Produktion herbeiführen kann (89, 96). IL-12 während einer Inokulation von Leishmania-Parasiten gegeben, bewirkt in Balb/c-Mäusen eine IFN-g-Produktion und hemmt die IL-4-Bildung. Gibt man IL-12 jedoch zwei Wochen nach der Infektion, so kommt es zu einer erhöhten IL-4-Produktion (97).

[Seite 23]

1.2.2 Effektor-Funktionen der Th-Zell-Subtypen

Insgesamt sollte man sich vergegenwärtigen, daß die Unterscheidung Th1/Th2 nicht immer ganz strikt ist und oft eher ein tendenzieller denn absoluter Unterschied der Zytokinproduktion zu messen ist. Besonders bei Menschen wird deshalb häufig der Begriff Th1- oder Th2-ähnlich (engl. Th1-like, Th2-like) verwendet. Dennoch ist diese Unterteilung konzeptionell sehr wertvoll, da sie unterschiedliche Immunreaktionen und somit unterschiedliche Krankheitsmanifestationen erklärt. Die klassische Einteilung in humorale und zellulär-vermittelte Immunität findet sich auf der Th-Zellebene in Th2- bzw. Th1- mediierter Antworten wieder (98, 99).

Th1-Zellen repräsentieren die zellvermittelte Immunität. IFNg, als Haupteffektorzytokin der Th1-Zellen, aktiviert Makrophagen und steigert deren mikrobiziden Angriff, stimuliert die Produktion von komplementbindendem und phagozyten-Fc-Rezeptor-bindendem IgG (100). Zusätzlich fördern Th1-spezifische Zytokine die Differenzierung von CD8+-Lymphozyten zu zytotoxischen Zellen und aktivieren Neutrophile und natürliche Killerzellen (NK-Zellen), d.h. sie sind für die Vernichtung von Bakterien (101), die Elimination von intrazellulären Erregern wie Bakterien, Viren und Parasiten (102) zuständig. Th2-Zellen vermitteln in erster Linie humorale Immunantworten. IL-4 und IL-5 fördern die Produktion von IgE und die Differenzierung und Aktivierung von eosinophilen Granulozyten (100). Außerdem verhelfen Th2-Zellen B-Lymphozyten zur Produktion von großen Mengen an IgM und nichtkomplementbindenden IgG-Isotypen.


89. Schmitt, E., Hoehn, P., Germann, T., and Rude, E. : Differential effects of interleukin-12 on the development of naive mouse CD4+ T cells. Eur.J.Immunol. 24 (2) (1994), S. 343-347

96. Jeannin, P., Delneste, Y., Life, P., Gauchat, J. F., Kaiserlian, D., and Bonnefoy, J. Y.: Interleukin-12 increases interleukin-4 production by established human Th0 and Th2-like T cell clones. Eur.J.Immunol. 25 (8) (1995), S. 2247-2252

97. Wang, Z. E., Zheng, S., Corry, D. B., Dalton, D. K., Seder, R. A., Reiner, S. L., and Locksley, R. M.: Interferon gamma-independent effects of interleukin 12 administered during acute or established infection due to Leishmania major. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 91 (26) (1994), S. 12932-12936

98. Mosmann, T. R. and Sad, S.: The expanding universe of T-cell subsets: Th1, Th2 and more. Immunol.Today 17 (3) (1996), S. 138-146

99. Abbas, A. K., Murphy, K. M., and Sher, A.: Functional diversity of helper T lymphocytes. Nature 383 (6603) (1996), S. 787-793 100. Abbas, A. K., Lichtmann, A. H. T, and Pober, J. S.: Cytokines. Cellular and molecular immunology. 2nd Saunders (1994),

101. Trinchieri, G.: Interleukin-12: a proinflammatory cytokine with immunoregulatory functions that bridge innate resistance and antigen-specific adaptive immunity. Annu.Rev.Immunol. 13:251-76 (1995), S. 251-276

102. Sher, A. and Coffman, R. L.: Regulation of immunity to parasites by T cells and T cell-derived cytokines. Annu.Rev.Immunol. 10:385-409 (1992), S. 385-409

Anmerkungen

Kein Hinweis auf die Quelle. Referenzen werden mitübernommen.

Sichter
(SleepyHollow02) Schumann, Hindemith

[14.] Ad/Fragment 027 01 - Diskussion
Bearbeitet: 9. July 2014, 19:40 Hindemith
Erstellt: 7. July 2014, 07:59 (SleepyHollow02)
Ad, Fragment, Gesichtet, Kazak 2002, SMWFragment, Schutzlevel sysop, Verschleierung

Typus
Verschleierung
Bearbeiter
SleepyHollow02
Gesichtet
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Untersuchte Arbeit:
Seite: 27, Zeilen: 1 ff. (kpl.)
Quelle: Kazak 2002
Seite(n): 23, 24, Zeilen: 23: 18ff - 24: 1ff
[Außerdem verhelfen Th2-]Zellen B-Lymphozyten zur Produktion von großen Mengen an IgM und nichtkomplementbindenden IgG-Isotypen. Eine wichtige Rolle der Th2-Zellen scheint in der Regulation der zellvermittelten Immunantwort zu liegen. IL-4 und IL-13 antagonisieren die makrophagenaktivierende Wirkung von IFNγ.

Im Mausmodell konnte gezeigt werden, daß Th1-Zytokine wie IFNγ, IL-12 und IL-2 und die Generierung einer CD8+-zytotoxischen T-Zell-Antwort für die Bekämpfung einer Virusinfektion nötig sind (KARUPIAH 1998). Das Th2-Zytokin IL-4 wird dabei ebenfalls produziert, um wahrscheinlich zusätzlich die humorale Immunantwort über Antikörper in Wege zu leiten (KARUPIAH 1998).

Th1-Zellen triggern DTH-Reaktionen (Delayed-Type-Hypersensitivity) und bewirken bei der Maus einen Immunglobulinklassen-Switch zu IgG2a, während Th2-Zellen Hypersensitivitätsreaktionen vom Typ I triggern und einen Immunglobulinklassen-Switch zu IgG1 bewirken (ABBAS et al. 1996).

Neuere Publikationen zeigen eine unterschiedliche Gewebemigrationsfähigkeit von Th1- bzw. Th2-Zellen. Diese unterschiedliche Gewebemigrationsfähigkeit beruht auf einer unterschiedlichen Expression von Zelloberflächenrezeptoren. Th1-Zellen von Mäusen, aber nicht Th2-Zellen, können an P- und E-Selektin binden (AUSTRUP et al. 1997) und somit in inflammatorisches Gewebe eindringen und dort eine DTH-Reaktionen (Delayed-Type-Hypersensitivity) auslösen. Die Migration von Th1-Zellen in inflammatorisches Gewebe kann durch Antikörper gegen P- und E-Selektin blockiert werden. Humane Th2-Zellen exprimieren für das Chemokin Eotaxin einen Eotaxin-Rezeptor, genannt CCR3, der ursprünglich auf Eosinophilen und Basophilen beschrieben wurde (SALLUSTO et al. 1997). Somit können CCR3-exprimierende Th2-Zellen in allergisch entzündliches Gewebe eindringen und durch die Produktion von IL-4 und IL-5 Basophile und Eosinophile aktivieren.aktivieren. [sic]

2.4 Entwicklung von Th1- und Th2-Subtypen.

2.4.1 Entwicklung von Th1-Subtypen

Neuere Arbeiten haben zu einem besseren Verständnis der Entwicklung naiver CD4+-TLymphozyten zu Th1- und Th2-Subtypen geführt. Th1- bzw. Th2-Zellen entwickeln sich von einer Vorläuferzelle, nämlich dem naiven CD4+-T-Lymphozyten (HSIEH et al. 1992; [SEDER, R. A. & PAUL, W. E. 1994).]

Außerdem verhelfen Th2-Zellen B-Lymphozyten zur Produktion von großen Mengen an IgM und nichtkomplementbindenden IgG-Isotypen. Eine wichtige Rolle der Th2-Zellen scheint in der Regulation der zellvermittelten Immunantwort zu liegen. IL-4 und IL-13 antagonisieren die makrophagenaktivierende Wirkung von IFNg.

Im Maus-Model konnte gezeigt werden, daß Th1-Zytokine wie IFNg, IL-12 und IL-2 und die Generierung einer CD8+-zytotoxischen T-Zell-Antwort für die Bekämpfung einer Virusinfektion nötig sind (30). Das Th2-Zytokin IL-4 wird dabei ebenfalls produziert, um wahrscheinlich zusätzlich die humorale Immunantwort über Antikörper in Wege zu leiten (30).

Th1-Zellen triggern DTH-Reaktionen (Delayed-Type-Heypersensitivity) [sic] und bewirken einen Immunglobulinklassen-Switch zu IgG2a, während Th2-Zellen Hypersensitivitätsreaktionen vom Typ I triggern und einen Immunglobulinklassen-Switch zu IgG1 bewirken (99).

Neuere Publikationen zeigen eine unterschiedliche Gewebemigrationsfähigkeit von Th1- bzw. Th2-Zellen. Diese unterschiedliche Gewebemigrationsfähigkeit beruht auf einer unterschiedlichen Expression Zelloberflächenrezeptoren. Th1-Zellen von Mäusen, aber nicht

[Seite 24]

Th2-Zellen, können an P- und E-Selektin binden (103) und somit in inflammatorisches Gewebe eindringen und dort eine DTH-Reaktionen (Delayed-Type-Heypersensitivity) [sic] auslösen. Die Migration von Th1-Zellen in inflammatorisches Gewebe kann durch Antikörper gegen P- und E-Selektin blockiert werden. Humane Th2-Zellen exprimieren für das Chemokin Eotaxin einen Eotaxin-Rezeptor, genannt CCR3, der ursprünglich auf Eosinophilen und Basophilen beschrieben wurde (104). Somit können CCR-exprimierende Th2-Zellen in allergisch entzündliches Gewebe eindringen und durch die Produktion von IL-4 und IL-5 Basophile und Eosinophile aktivieren.

1.2.3 Entwicklung von Th1- und Th2-Subtypen'

1.2.3.1 Entwicklung von Th1-Subtypen

Neuere Arbeiten haben zu einem besseren Verständnis der Entwicklung naiver CD4+-TLymphozyten zu Th1- und Th2-Subtypen geführt. Th1- bzw. Th2-Zellen entwickeln sich von einer Vorläuferzelle, nämlich dem naiven CD4+-T-Lymphozyten (105, 106).


30. Karupiah, G.: Type 1 and type 2 cytokines in antiviral defense. Vet.Immunol.Immunopathol. 63 (1-2) (1998), S. 105-109

99. Abbas, A. K., Murphy, K. M., and Sher, A.: Functional diversity of helper T lymphocytes. Nature 383 (6603) (1996), S. 787-793

100. Abbas, A. K., Lichtmann, A. H. T, and Pober, J. S.: Cytokines. Cellular and molecular immunology. 2nd Saunders (1994),

101. Trinchieri, G.: Interleukin-12: a proinflammatory cytokine with immunoregulatory functions that bridge innate resistance and antigen-specific adaptive immunity. Annu.Rev.Immunol. 13:251-76 (1995), S. 251-276

102. Sher, A. and Coffman, R. L.: Regulation of immunity to parasites by T cells and T cell-derived cytokines. Annu.Rev.Immunol. 10:385-409 (1992), S. 385-409

103. Austrup, F., Vestweber, D., Borges, E., Lohning, M., Brauer, R., Herz, U., Renz, H., Hallmann, R., Scheffold, A., Radbruch, A., and Hamann, A.: P- and E-selectin mediate recruitment of T-helper-1 but not T-helper-2 cells into inflammed tissues. Nature 385 (6611) (1997), S. 81-83

104. Sallusto, F., Mackay, C. R., and Lanzavecchia, A.: Selective expression of the eotaxin receptor CCR3 by human T helper 2 cells. Science 277 (5334) (1997), S. 2005-2007

105. Hsieh, C. S., Heimberger, A. B., Gold, J. S., O'Garra, A., and Murphy, K. M.: Differential regulation of T helper phenotype development by interleukins 4 and 10 in an alpha beta T-cell-receptor transgenic system. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 89 (13) (1992), S. 6065-6069

106. Seder, R. A. and Paul, W. E.: Acquisition of lymphokine-producing phenotype by CD4+ T cells. Annu.Rev.Immunol. 12:635-73 (1994), S. 635-673

Anmerkungen

KeinHinweis auf die Quelle. Referenzen werden mitübernommen.

Sichter
(SleepyHollow02) Schumann

[15.] Ad/Fragment 028 01 - Diskussion
Bearbeitet: 9. July 2014, 19:51 Hindemith
Erstellt: 7. July 2014, 08:56 (SleepyHollow02)
Ad, Fragment, Gesichtet, Kazak 2002, SMWFragment, Schutzlevel sysop, Verschleierung

Typus
Verschleierung
Bearbeiter
SleepyHollow02
Gesichtet
Yes.png
Untersuchte Arbeit:
Seite: 28, Zeilen: 1 ff. (kpl.)
Quelle: Kazak 2002
Seite(n): 24, 25, Zeilen: 24:13 ff - 25: 1 ff.
Während ihrer Begegnung mit Antigenen produzieren naive CD4+-T-Lymphozyten (entspricht Th0-Zellen) initial geringe Mengen IL-2, IL-4 und IFN-γ (NAKAMURA et al. 1997). Die Entscheidung, in welchen Th-Subtypen sie sich entwickeln, scheint in hohem Maße von Zytokinen abzuhängen, denen sie bei der primären Aktivierung auf der Ebene der TCR-Bindung ausgesetzt sind (ABBAS et al. 1996; SEDER R. A. & PAUL W. E. 1994).

IL-12, rasch nach dem Kontakt von aktivierten Makrophagen mit mikrobiellen Produkten, Lipopolysacchariden, Viruskomponenten, intrazellulären Bakterien (Listeria monocytogenes und Mykobakterien) und Protozoen (TRINCHIERI 1997) und dem Kontakt mit antigenpräsentierenden Zellen (=APC, z.b. dendritischen Zellen) (MACATONIA et al. 1995) produziert, ist das bedeutendste Th1-induzierende Zytokin, während IL-4 (SWAIN et al. 1990) das wichtigste Th2-induzierende Zytokin zu sein scheint (Abb.1)

Ad 28a diss.png

Abbildung 1: Differenzierung von CD4+-T-Helfer-Subtypen zu Th1- bzw. Th2-Zellen (APC=antigenpräsentierende Zelle) (Modifiziert nach MURAILLE & LEO 1998; PICHLER 1997)

Mikroorganismen, wie z.B. Listerien und Mykobakterien, die Makrophagen und NK-Zellen aktivieren, stimulieren die Produktion von IL-12 und IFNγ (HSIEH et al. 1993; TRINCHIERI 1995; GAZZINELLI et al. 1993). IL-12 aktiviert zudem auch bei NK-Zellen die IFN-γ-Produktion (GAZZINELLI et al. 1993). IFN-γ wiederum bewirkt eine erhöhte Ausschüttung von IL-12 bei Makrophagen. Kürzlich aktivierte, unbeteiligte CD4+-Vorläufer- Lymphozyten [(pTh) bilden Rezeptoren für IL-12 und bekommen eine erhöhte Ansprechbarkeit auf IL-12 (WENNER et al. 1996), da IFN-γ eine Aufregulation der β2-Untereinheit des IL-12-Rezeptors bewirkt (ROGGE et al. 1997).]

Während ihrer Begegnung mit Antigenen produzieren naive CD4+-T-Lymphozyten (entspricht Th0-Zellen) initial geringe Mengen IL-2, IL-4 und IFN-g (107). Die Entscheidung, in welchen Th-Subtypen sie sich entwickeln, scheint in hohem Maße von Zytokinen abzuhängen, denen sie bei der primären Aktivierung auf der Ebene der TCR-Bindung ausgesetzt sind (99, 106). IL-12, rasch nach dem Kontakt von aktivierten Makrophagen mit mikrobiellen Produkten, Lipopolysacchariden, Viruskomponenten, intrazellulären Bakterien (Listeria monocytogenes und Mykobakterien) und Protozoen (108) und dem Kontakt mit antigen-präsentierende Zellen (=APC, z.B. dendritischen Zellen) (109) produziert, ist das bedeutendste Th1-induzierende Zytokin, während IL-4 (110) das wichtigste Th2-induzierende Zytokin zu sein scheint (Abbildung 3).

[Seite 25]

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Abbildung 3: Differenzierung von CD4+-T-Helfer-Subtypen zu Th1- bzw. Th2-Zellen (APC = antigenpräsentierende Zelle) (111, 112)

Mikroorganismen, wie z.B. Listerien und Mykobakterien, die Makrophagen und NK-Zellen aktivieren, stimulieren die Produktion von IL-12 und IFNg (87, 101, 113). IL-12 aktiviert zudem auch bei NK-Zellen die IFN-g-Produktion (113). IFN-g wiederum bewirkt eine erhöhte Ausschüttung von IL-12 bei Makrophagen. Kürzlich aktivierte, unbeteiligte CD4+-Vorläufer-Lymphozyten (pTh) bilden Rezeptoren für IL-12 und bekommen eine erhöhte Ansprechbarkeit auf IL-12 (114), da IFN-g eine Upregulation der b2-Untereinheit des IL-12-Rezeptors bewirkt (115).


87. Hsieh, C. S., Macatonia, S. E., Tripp, C. S., Wolf, S. F., O'Garra, A., and Murphy, K. M.: Development of TH1 CD4+ T cells through IL-12 produced by Listeriainduced macrophages [see comments]. Science 260 (5107) (1993), S. 547-549

99. Abbas, A. K., Murphy, K. M., and Sher, A.: Functional diversity of helper T lymphocytes. Nature 383 (6603) (1996), S. 787-793

107. Nakamura, T., Kamogawa, Y., Bottomly, K., and Flavell, R. A.: Polarization of IL-4- and IFN-gamma-producing CD4+ T cells following activation of naive CD4+ T cells. J.Immunol. 158 (3) (1997), S. 1085-1094

108. Trinchieri, G.: Cytokines acting on or secreted by macrophages during intracellular infection (IL-10, IL-12, IFN-gamma). Curr.Opin.Immunol. 9 (1) (1997), S. 17-23

109. Macatonia, S. E., Hosken, N. A., Litton, M., Vieira, P., Hsieh, C. S., Culpepper, J. A., Wysocka, M., Trinchieri, G., Murphy, K. M., and O'Garra, A.: Dendritic cells produce IL-12 and direct the development of Th1 cells from naive CD4+ T cells. J.Immunol. 154 (10) (1995), S. 5071-5079

110. Swain, S. L., Weinberg, A. D., English, M., and Huston, G.: IL-4 directs the development of Th2-like helper effectors. J.Immunol. 145 (11) (1990), S. 3796-3806

111. Muraille, E. and Leo, O.: Revisiting the Th1/Th2 paradigm. Scand.J.Immunol. 47 (1) (1998), S. 1-9

112. Pichler, W. J.: [Regulation of the immune response: the TH1/TH2 concept]. Schweiz.Med.Wochenschr. 127 (9) (1997), S. 341-348

113. Gazzinelli, R. T., Hieny, S., Wynn, T. A., Wolf, S., and Sher, A.: Interleukin 12 is required for the T-lymphocyte-independent induction of interferon gamma by an intracellular parasite and induces resistance in T-cell-deficient hosts. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 90 (13) (1993), S. 6115-6119

Anmerkungen

Kein Hinweis auf die Quelle. Referenzen werden mitübernommen.

Sichter
(SleepyHollow02), (Hindemith) Schumann

[16.] Ad/Fragment 029 01 - Diskussion
Bearbeitet: 9. July 2014, 19:52 Hindemith
Erstellt: 7. July 2014, 09:09 (SleepyHollow02)
Ad, Fragment, Gesichtet, Kazak 2002, SMWFragment, Schutzlevel sysop, Verschleierung

Typus
Verschleierung
Bearbeiter
SleepyHollow02
Gesichtet
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Untersuchte Arbeit:
Seite: 29, Zeilen: 1 ff. (kpl.)
Quelle: Kazak 2002
Seite(n): 25 f., Zeilen: 25: 3 ff. - 26: 1 ff.
[IFN-γ wiederum bewirkt eine erhöhte Ausschüttung von IL-12 bei Makrophagen. Kürzlich aktivierte, unbeteiligte CD4+-Vorläufer- Lymphozyten] (pTh) bilden Rezeptoren für IL-12 und bekommen eine erhöhte Ansprechbarkeit auf IL-12 (WENNER et al. 1996), da IFN-γ eine Aufregulation der β2-Untereinheit des IL-12- Rezeptors bewirkt (ROGGE et al. 1997).

Der IL-12-Rezeptor besteht aus einer β1- und einer β2-Kette. Während die β1-Kette von Th1- und Th2-Zellen gebildet werden kann, wird die signalweitergebende β2-Kette nicht von Th2-Zellen exprimiert (SZABO et al. 1997).

Bindet sich IL-12 an diesen Rezeptor, so werden mehrere Transkriptionsfaktoren, einschließlich STAT1, STAT2 und STAT4, aktiviert. Dabei ist von den drei aufgezählten STAT4 der wichtigste Transkriptionsfaktor, der zur Produktion von IFNγ führt (JACOBSON et al. 1995). In Tierversuchen mit genetisch veränderten Mäusen, die kein STAT4 (KAPLAN et al. 1996; THIERFELDER et al. 1996) oder IL-12 (MAGRAM et al. 1996) exprimieren können, findet keine Th1-Entwicklung statt. IFNγ fördert im Anschluß daran die Th1-Differenzierung, indem die IL-12-Sekretion durch Makrophagen gesteigert wird und zusätzlich die IL-12-Rezeptor-Expression auf den T-Zellen beibehalten wird (TRINCHIERI 1995; SZABO et al. 1997). IL-12 und IFNγ wirken zusammen auf Makrophagen und Lymphozyten im Sinne der Generierung einer Th1-Population

2.4.2 Entwicklung von Th-2 Subtypen

Die Effekte von IL-4 bei der Induktion der Th2-Entwicklung dominieren über Th1-polarisierenden Zytokine (HSIEH et al. 1993; SEDER RA & PAUL WE 1994), so dass sich bei Erreichen einer bestimmten IL-4- Schwelle bei Beginn der Immunantwort Th2-Zellen differenzieren und hohe Mengen an IL-4 produzieren.

IL-4, als Anstoß für die Entwicklung des Th2-Musters, kann nicht nur von differenzierten THelfer- Zellen, sondern, in der frühen Immunantwort auch von einigen anderen Zellen gebildet werden. Dazu gehören Nicht-T- bzw. Nicht-B-Zellen aus dem Knochenmark, die der Mastzell- bzw. Basophilenabstammung angehören (PICCINNI et al. 1991), Mastzellen (BRADDING et al. 1992), Basophile (BRUNNER et al. 1993) und Eosinophile (MOQBEL et al. 1995). Kürzlich wurde auch gezeigt, daß wahrscheinlich von APC (antigenpräsentierende Zellen) stammendes IL-6 in der Lage ist, CD4+-T-Zellen zur initialen Produktion von IL-4 zu bewegen, so dass naive CD4+-T-Zellen sich zu Th2-Zellen entwickeln können (RINCON et al. 1997).

IFN-g wiederum bewirkt eine erhöhte Ausschüttung von IL-12 bei Makrophagen. Kürzlich aktivierte, unbeteiligte CD4+-Vorläufer- Lymphozyten (pTh) bilden Rezeptoren für IL-12 und bekommen eine erhöhte Ansprechbarkeit auf IL-12 (114), da IFN-g eine Upregulation der b2-Untereinheit des IL-12- Rezeptors bewirkt (115).

Der IL-12-Rezeptor besteht aus der b1- und b2-Kette. Während die b1-Kette von Th1- und Th2-Zellen gebildet werden kann, wird die signalweitergebende b2-Kette nicht von Th2-Zellen exprimiert (116).

Bindet sich IL-12 an diesen Rezeptor, so werden mehrere Transkriptionsfaktoren, einschließlich STAT1, STAT2 und STAT4, aktiviert. Dabei ist von den drei aufgezählten STAT4 der wichtigste Transkriptionsfaktor, der zur Produktion von IFNg führt (117). In Tierversuchen mit genetisch veränderten Mäusen, die kein STAT4 (118, 119) oder IL-12 (91) exprimieren können, findet keine Th1-Entwicklung statt. IFNg fördert im Anschluß daran die

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Th1-Differenzierung, indem die IL-12-Sekretion durch Makrophagen gesteigert wird und zusätzlich die IL-12-Rezeptor-Expression auf den T-Zellen beibehalten wird (101, 116). IL-12 und IFNg wirken zusammen auf Makrophagen und Lymphozyten im Sinne der Generierung einer Th1-Population.

1.2.3.2 Entwicklung von Th2-Subtypen

Die Effekte von IL-4 bei der Induktion der Th2-Entwicklung dominieren über Th1- polarisierenden Zytokine (87, 106), so daß sich bei Erreichen einer bestimmten IL-4- Schwelle bei Beginn der Immunantwort Th2-Zellen differenzieren und hohe Mengen an IL-4 produzieren.

IL-4, als Anstoß für die Entwicklung des Th2-Musters, kann nicht nur von differenzierten THelfer-Zellen, sondern, wie man neuerdings herausgefunden hat, in der frühen Immunantwort auch von einigen anderen Zellen gebildet werden. Dazu gehören Nicht-Tbzw. Nicht-B-Zellen aus dem menschlichen Knochenmark, die der Mastzell- bzw. Basophilenabstammung angehören (120), Mastzellen (121), Basophile (122) und Eosinophile (123). Kürzlich wurde auch gezeigt, daß wahrscheinlich von APC (antigenpräsentierende Zellen) stammendes IL-6 in der Lage ist, CD4+-T-Zellen zur initialen Produktion von IL-4 zu bewegen, so daß naive CD4+-T-Zellen sich zu Th2-Zellen entwickeln können (90).


90. Rincon, M., Anguita, J., Nakamura, T., Fikrig, E. , and Flavell, R. A.: Interleukin (IL)-6 directs the differentiation of IL-4-producing CD4+ T cells. J.Exp.Med. 185 (3) (1997), S. 461-469

91. Magram, J., Connaughton, S. E., Warrier, R. R., Carvajal, D. M., Wu, C. Y., Ferrante, J., Stewart, C., Sarmiento, U., Faherty, D. A., and Gately, M. K.: IL-12-deficient mice are defective in IFN gamma production and type 1 cytokine responses. Immunity. 4 (5) (1996), S. 471-481

114. Wenner, C. A., Guler, M. L., Macatonia, S. E., O'Garra, A., and Murphy, K. M.: Roles of IFN-gamma and IFN-alpha in IL-12-induced T helper cell-1 development. J.Immunol. 156 (4) (1996), S. 1442-1447

115. Rogge, L., Barberis-Maino, L., Biffi, M., Passini, N., Presky, D. H., Gubler, U., and Sinigaglia, F.: Selective expression of an interleukin-12 receptor component by human T helper 1 cells. J.Exp.Med. 185 (5) (1997), S. 825-831

116. Szabo, S. J., Dighe, A. S., Gubler, U., and Murphy, K. M.: Regulation of the interleukin (IL)-12R beta 2 subunit expression in developing T helper 1 (Th1) and Th2 cells. J.Exp.Med. 185 (5) (1997), S. 817-824

117. Jacobson, N. G., Szabo, S. J., Weber-Nordt, R. M., Zhong, Z., Schreiber, R. D., Darnell, J. E. Jr, and Murphy, K. M.: Interleukin 12 signaling in T helper type 1 (Th1) cells involves tyrosine phosphorylation of signal transducer and activator of transcription (Stat)3 and Stat4. J.Exp.Med. 181 (5) (1995), S. 1755-1762

118. Kaplan, M. H., Sun, Y. L., Hoey, T., and Grusby, M. J.: Impaired IL-12 responses and enhanced development of Th2 cells in Stat4- deficient mice. Nature 382 (6587) (1996), S. 174-177

119. Thierfelder, W. E., van Deursen, J. M., Yamamoto, K., Tripp, R. A., Sarawar, S. R., Carson, R. T., Sangster, M. Y., Vignali, D. A., Doherty, P. C., Grosveld, G. C., and Ihle, J. N.: Requirement for Stat4 in interleukin-12-mediated responses of natural killer and T cells. Nature 382 (6587) (1996), S. 171-174

120. Piccinni, M. P., Macchia, D., Parronchi, P., Giudizi, M. G., Bani, D., Alterini, R., Grossi, A., Ricci, M., Maggi, E., and Romagnani, S.: Human bone marrow non-B, non-T cells produce interleukin 4 in response to cross-linkage of Fc epsilon and Fc gamma receptors. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 88 (19) (1991), S. 8656-8660

121. Bradding, P., Feather, I. H., Howarth, P. H., Mueller, R., Roberts, J. A., Britten, K., Bews, J. P., Hunt, T. C., Okayama, Y., and Heusser, C. H.: Interleukin 4 is localized to and released by human mast cells. J.Exp.Med. 176 (5) (1992), S. 1381-1386

122. Brunner, T., Heusser, C. H., and Dahinden, C. A.: Human peripheral blood basophils primed by interleukin 3 (IL-3) produce IL-4 in response to immunoglobulin E receptor stimulation. J.Exp.Med. 177 (3) (1993), S. 605-611

123. Moqbel, R., Ying, S., Barkans, J., Newman, T. M. , Kimmitt, P., Wakelin, M., Taborda-Barata, L., Meng, Q., Corrigan, C. J., and Durham, S. R.: Identification of messenger RNA for IL-4 in human eosinophils with granule localization and release of the translated product. J.Immunol. 155 (10) (1995), S. 4939-4947

Anmerkungen

Kein Hinweis auf die Quelle. Referenzen werden mitübernommen.

Sichter
(SleepyHollow02) Schumann

[17.] Ad/Fragment 030 01 - Diskussion
Bearbeitet: 9. July 2014, 19:52 Hindemith
Erstellt: 7. July 2014, 10:03 (SleepyHollow02)
Ad, Fragment, Gesichtet, Kazak 2002, SMWFragment, Schutzlevel sysop, Verschleierung

Typus
Verschleierung
Bearbeiter
SleepyHollow02
Gesichtet
Yes.png
Untersuchte Arbeit:
Seite: 30, Zeilen: 1 ff. (kpl.)
Quelle: Kazak 2002
Seite(n): 26, 27, Zeilen: 26: 18 ff. - 27: 1 ff.
Bindet IL-4 an seinen Rezeptor an kürzlich aktivierten unbeteiligten CD4+-Lymphozyten, so wird über STAT6 die Produktion von mehr IL-4 angeregt, was dann in autokriner Weise auf die Lymphozyten wirken kann (SEDER & PAUL 1994; SHIMODA et al. 2003). In genetisch veränderten Mäusen, die kein STAT6 (KAPLAN et al. 1996; SHIMODA et al. 2003) oder IL-4 (KUHN et al. 1991; LICHTMAN et al. 1987) exprimieren, findet keine Generierung einer Th2-Antwort statt, was wiederum zeigt, dass IL-4 selbst für die Th2-Entwicklung nötig ist.

Neuere Untersuchungen zeigen, bei sich gerade entwickelnden Th2-Zellen, die mit IL-4 behandelt wurden, einen Verlust der Ansprechbarkeit auf IL-12 durch negative Regulation der β2-Kette des IL-12-Rezeptors, wobei jedoch viel von der β1-Kette des IL-12-Rezeptors exprimiert wird, um eine gewisse Empfindlichkeit für IL-12 beizubehalten (SZABO et al. 1997). Durch die Runterregulation der β2-Kette wird bei einer Kostimulation mit IL-4 und IL- 12 das Th2- Zellmuster bevorzugt. Eine IFNγ-Behandlung bei sich gerade entwickelnden Th2-Zellen führt zu einem Weiterbestehen der Expression der IL-12-Rezeptor-β2-Untereinheit (SZABO et al. 1997).

2.5 Th1-/Th2- Switch

Eine generierte Th-Zell-Population kann sich bedingt in die andere Th-Zell-Population umwandeln. Dies wurde gezeigt, indem Populationen, die in Zellkulturen bereits in Richtung eines bestimmten Th-Subtyps stimuliert worden waren, anschließend in Richtung des anderen Th-Subtyps stimuliert werden konnten und in denen nach einigen Tagen die Zytokinproduktion gemessen wurde. Es zeigte sich, dass Th1-Zellen, stimuliert mit IL-4, sich in Th2-Zellen umwandeln lassen können, während umgekehrt durch Stimulierung von Th2-Zellen mit IL-12 der Switch nicht erfolgte (PEREZ et al. 1995; NAKAMURA et al. 1997). Dies läßt sich wie bereits erwähnt durch den Verlust der Ansprechbarkeit auf IL-12 durch Herabregulation der β2-Kette des IL-12- Rezeptors erklären (SZABO et al. 1997). Stimuliert man jedoch Th2-Zellen mit IFNγ und IL-12, so ist ein Switch zu Th1-Zellen möglich (NAKAMURA et al. 1997), da IFNγ das IL-4-Signal antagonisiert.

Nach einer Langzeitstimulation von bereits polarisierten Th1-Populationen mit IL-4 und Th2- Populationen mit IL-12 konnten MURPHY et al. (1996) keine Reversibilität in die eine oder in die andere Richtung mehr beobachten.

Die Beobachtung, dass IL-12 bei bereits polarisierten Th2-Zell-Klonen sogar in vitro zu einer Steigerung der IL-4-Produktion führt(SCHMITT et al. 1994; JEANNIN et al. 1995). Diese [Beobachtung wurde durch in vivo Versuche bestätigt (BLISS et al. 1996).]

Bindet IL-4 an seinen Rezeptor an kürzlich aktivierten unbeteiligten CD4+-Lymphozyten, so wird über STAT6 die Produktion von mehr IL-4 angeregt, was dann in autokriner Weise auf die Lymphozyten wirken kann (106, 124, 125). In genetisch veränderten Mäusen, die kein STAT6 (124, 125) oder IL-4 (93, 94) exprimieren, findet keine Generierung einer Th2-Antwort statt, was wiederum zeigt, daß IL-4 selbst für die Th2-Entwicklung nötig ist.

Neuere Untersuchungen zeigen, bei sich gerade entwickelnden Th2-Zellen, die mit IL-4 behandelt wurden, einen Verlust der Ansprechbarkeit auf IL-12 durch Downregulation der b2-Kette des IL-12-Rezeptors, wobei jedoch viel von der b1-Kette des IL-12-Rezeptors exprimiert wird, um eine gewisse Empfindlichkeit für IL-12 beizubehalten (116). Durch die Downregulation der b2-Kette wird bei einer Kostimulation mit IL-4 und IL-12 das Th2-Zellmuster bevorzugt. Eine IFNg-Behandlung bei sich gerade entwickelnden Th2-Zellen führt zu einem Weiterbestehen der Expression der IL-12-Rezeptor-b2-Untereinheit (116).

[Seite 27]

1.2.4 Th1-/Th2-Switch

Eine generierte Th-Zell-Population kann sich bedingt in die andere Th-Zell-Population umwandeln. Dies wurde gezeigt, indem Populationen, die in Zellkulturen bereits in Richtung eines bestimmten Th-Subtyps stimuliert worden waren, anschließend in Richtung des anderen Th-Subtyps stimuliert wurden und in denen nach einigen Tagen die Zytokinproduktion gemessen wurde. Es zeigte sich, daß Th1-Zellen, stimuliert mit IL-4, sich in Th2-Zellen umwandeln lassen können, während umgekehrt durch Stimulierung von Th2-Zellen mit IL-12 der Switch nicht erfolgte (88, 126). Dies läßt sich wie bereits erwähnt durch den Verlust der Ansprechbarkeit auf IL-12 durch Downregulation der b2-Kette des IL-12- Rezeptors erklären (116). Stimuliert man jedoch Th2-Zellen mit IFNg und IL-12, so ist ein Switch zu Th1-Zellen möglich (126), da IFNg das IL-4-Signal antagonisiert. Nach einer Langzeitstimulation von bereits polarisierten Th1-Populationen mit IL-4 und Th2- Populationen mit IL-12 konnten Murphy et al. (127) keine Reversibilität in die eine oder in die andere Richtung mehr beobachten. Wie bereits schon erwähnt, führt IL-12 bei bereits polarisierten Th2-Zell-Klonen sogar in vitro zu einer Steigerung der IL-4-Produktion (89, 96). Diese Beobachtung wurden durch in vivo Versuche bestätigt (128).


93. Kuhn, R., Rajewsky, K., and Muller, W.: Generation and analysis of interleukin-4 deficient mice. Science 254 (5032) (1991), S. 707-710

94. Kopf, M., Le Gros, G., Bachmann, M., Lamers, M. C., Bluethmann, H., and Kohler, G.: Disruption of the murine IL-4 gene blocks Th2 cytokine responses. Nature 362 (6417) (1993), S. 245-248

106. Seder, R. A. and Paul, W. E.: Acquisition of lymphokine-producing phenotype by CD4+ T cells. Annu.Rev.Immunol. 12:635-73 (1994), S. 635-673

116. Szabo, S. J., Dighe, A. S., Gubler, U., and Murphy, K. M.: Regulation of the interleukin (IL)-12R beta 2 subunit expression in developing T helper 1 (Th1) and Th2 cells. J.Exp.Med. 185 (5) (1997), S. 817-824

124. Kaplan, M. H., Schindler, U., Smiley, S. T., and Grusby, M. J.: Stat6 is required for mediating responses to IL-4 and for development of Th2 cells. Immunity. 4 (3) (1996), S. 313-319

125. Shimoda, K., van Deursen, J., Sangster, M. Y., Sarawar, S. R., Carson, R. T., Tripp, R. A., Chu, C., Quelle, F. W., Nosaka, T., Vignali, D. A., Doherty, P. C., Grosveld, G., Paul, W. E., and Ihle, J. N.: Lack of IL-4-induced Th2 response and IgE class switching in mice with disrupted Stat6 gene. Nature 380 (6575) (1996), S. 630- 633

126. Nakamura, T., Lee, R. K., Nam, S. Y., Podack, E. R., Bottomly, K., and Flavell, R. A.: Roles of IL-4 and IFN-gamma in stabilizing the T helper cell type 1 and 2 phenotype. J.Immunol. 158 (6) (1997), S. 2648-2653

127. Murphy, E., Shibuya, K., Hosken, N., Openshaw, P., Maino, V., Davis, K., Murphy, K., and O'Garra, A.: Reversibility of T helper 1 and 2 populations is lost after longterm stimulation. J.Exp.Med. 183 (3) (1996), S. 901-913

128. Bliss, J., Van Cleave, V., Murray, K., Wiencis, A., Ketchum, M., Maylor, R., Haire, T., Resmini, C., Abbas, A. K., and Wolf, S. F.: IL-12, as an adjuvant, promotes a T helper 1 cell, but does not suppress a T helper 2 cell recall response. J.Immunol. 156 (3) (1996), S. 887-894

Anmerkungen

Kein Hinweis auf die Quelle. Referenzen werden mitübernommen.

Sichter
(SleepyHollow02) Schumann

[18.] Ad/Fragment 031 01 - Diskussion
Bearbeitet: 9. July 2014, 19:53 Hindemith
Erstellt: 7. July 2014, 10:11 (SleepyHollow02)
Ad, Fragment, Gesichtet, Kazak 2002, SMWFragment, Schutzlevel sysop, Verschleierung

Typus
Verschleierung
Bearbeiter
SleepyHollow02
Gesichtet
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Untersuchte Arbeit:
Seite: 31, Zeilen: 1 ff. (kpl.)
Quelle: Kazak 2002
Seite(n): 27, 28., Zeilen: 27: 16 ff. - 28: 1 ff.
[Diese] Beobachtung wurde durch in vivo Versuche bestätigt (BLISS et al. 1996). Wie auch in Abb. 1 zu sehen ist, kann demnach ein vorhandenes Th1-Zellmuster über die Produktion von IL-12 bereits polarisierte Th2-Zell- Klone (auch wenn es verhältnismäßig wenige sind) zur Steigerung der IL-4-Produktion anregen, wodurch eine Limitierung des Th1-Zellmusters erfolgt (IL-4 hemmt das Th1- Muster). Ein vorhandenes Th2-Zellmuster kann nach bisherigem Wissen sich selbst zu Gunsten des Th1-Zellmusters nicht limitieren. In den Fällen, wo das Th1-Muster nicht schnell und effektiv genug bestimmte Krankheitserreger eliminieren kann, kann es zu einem Switch zum Th2-Zellmuster kommen. Dies würde die mögliche entzündliche Gewebsschädigung durch das Th1-Zellmuster verringern, aber auch eine Erregerpersistenz unterstützen. Das Persistieren eines Erregers wiederum kann, möglicherweise über die antigenpräsentierenden Zellen (APC), die über eine IL-12-Produktion ein chronisches Bestehen des Th1-Zellmusters bewirken können, eine entzündliche Gewebsschädigung unterhalten.

Zwei Arbeitsgruppen haben beschrieben, daß Th2-Klone nach Stimulation mit IL-12 vorübergehend IFNγ bilden können, ohne jedoch dabei die Expression ihres typischen Th2-Zytokin-Profils aufzugeben (MANETTI et al. 1993; YSSEL et al. 1994).

2.6 Th1- oder Th2- beeinflussende Faktoren

Ob sich eine Th1- oder Th2-Antwort entwickelt, hängt von verschiedenen Faktoren ab, die zur Zeit der beginnenden Immunantwort vorherrschen. Dazu gehören die Antigendosis (HOSKEN et al. 1995), die Natur des Immunogens, die Zytokine, die während der Antigen-Präsentation vorhanden sind, die Kostimulation der T-Zellen (Review in KELLY et al. 1998), der Typ der antigenpräsentierenden Zellen (APC), der Weg des Antigeneintritts (MEEUSEN 1998), das Vorhandensein bestimmte Hormone und auch bisher undefinierte individuelle Faktoren wie der genetische Hintergrund des Wirts (ABBAS et al. 1996; HSIEH et al. 1995; CONSTANT & BOTTOMLY 1997). Diese Faktoren können die Produktion oder die Präsenz von IL-12 und IL-4 während der primären Stimulation von naiven CD4+-T-Zellen beeinflussen.

Viele anti-inflammatorische Substanzen wirken über die Induktion der IL-10-Produktion und/oder Hemmung der IL-12-Produktion immunsuppressiv und können Einfluß auf das Th1- Th2-Zellmuster nehmen. Dazu gehören Substanzen, die die intrazelluläre cAMPKonzentration erhöhen, wie Prostaglandine (PGE2) (VAN DER POUW KRAAN et al. 1995), [β2-Rezeptor-Agonisten (PANINA-BORDIGNON et al. 1997) und Phosphodiesterase-Inhibitoren (z.B. Pentoxyfillin) (MOLLER et al. 1997).]

Diese Beobachtung wurden [sic] durch in vivo Versuche bestätigt (128). Wie auch in Abbildung 3 zu sehen ist, kann demnach ein vorhandenes Th1-Zellmuster über die Produktion von IL-12 bereits polarisierte Th2-Zell-Klone (auch wenn es verhältnismäßig wenige sind) zur Steigerung der IL-4-Produktion anregen, wodurch eine Limitierung des Th1-Zellmusters erfolgt (IL-4 hemmt das Th1- Muster). Ein vorhandenes Th2-Zellmuster kann nach bisherigem Wissen sich selbst zu Gunsten des Th1-Zellmusters nicht limitieren. In den Fällen, wo das Th1-Muster nicht schnell und effektiv genug bestimmte Krankheitserreger eliminieren kann, kann es zu einem Switch zum Th2-Zellmuster kommen. Dies würde die mögliche entzündliche Gewebsschädigung durch das Th1-Zellmuster verringern, aber auch eine Erregerpersistenz unterstützen. Das Persistieren eines Erregers wiederum kann, möglicherweise über die antigenpräsentierenden Zellen (APC), die über eine IL-12-Produktion ein chronisches Bestehen des Th1-Zellmusters bewirken können, eine entzündliche Gewebsschädigung unterhalten.

Zwei Arbeitsgruppen haben beschrieben, daß Th2-Klone nach Stimulation mit IL-12 vorübergehend IFNg bilden können, ohne jedoch dabei die Expression ihres typischen Th2-Zytokin-Profils aufzugeben (129, 130).

[Seite 28]

1.2.5 Th1- oder Th2 beeinflussende Faktoren

Ob sich eine Th1- oder Th2-Antwort entwickelt, hängt von verschiedenen Faktoren ab, die zur Zeit der beginnenden Immunantwort vorherrschen. Dazu gehören Umgebungsfaktoren wie die Antigendosis (131), die Natur des Immunogens, die Zytokine, die während der Antigen-Präsentation vorhanden sind, die Kostimulation der T-Zellen (Review (132)), der Typ der antigenpräsentierenden Zellen (APC), der Weg des Antigeneintritts (133), das Vorhandensein von bestimmten Hormonen und aber auch bisher undefinierte individuelle Faktoren wie der genetische Hintergrund des Wirts (99, 134, 135). Diese Faktoren können die Produktion oder die Präsenz von IL-12 und IL-4 während der primären Stimulation von naiven CD4+-T-Zellen beeinflussen.

Viele anti-inflammatorische Substanzen wirken über die Induktion der IL-10-Produktion und/oder Hemmung der IL-12-Produktion immunosuppressiv und können Einfluß auf das Th1-Th2-Zellmuster nehmen. Dazu gehören Substanzen, die die intrazelluläre cAMPKonzentration erhöhen, wie Prostaglandine (PGE2) (136), b2-Rezeptor-Agonisten (137) und Phosphodiesterase-Inhibitoren (z.B. Pentoxyfillin) (138).


128. Bliss, J., Van Cleave, V., Murray, K., Wiencis, A., Ketchum, M., Maylor, R., Haire, T., Resmini, C., Abbas, A. K., and Wolf, S. F.: IL-12, as an adjuvant, promotes a T helper 1 cell, but does not suppress a T helper 2 cell recall response. J.Immunol. 156 (3) (1996), S. 887-894

129. Manetti, R., Gerosa, F., Giudizi, M. G., Biagiotti, R., Parronchi, P., Piccinni, M. P., Sampognaro, S., Maggi, E., Romagnani, S., and Trinchieri, G.: Interleukin 12 induces stable priming for interferon gamma (IFN-gamma) production during differentiation of human T helper (Th) cells and transient IFN-gamma production in established Th2 cell clones. J.Exp.Med. 179 (4) (1994), S. 1273-1283

130. Yssel, H., Fasler, S., De Vries, J. E., and de Waal, Malefyt: IL-12 transiently induces IFN-gamma transcription and protein synthesis in human CD4+ allergen-specific Th2 T cell clones. Int.Immunol. 6 (7) (1994), S. 1091-1096

131. Hosken, N. A., Shibuya, K., Heath, A. W., Murphy, K. M., and O'Garra, A.: The effect of antigen dose on CD4+ T helper cell phenotype development in a T cell receptor-alpha beta-transgenic model. J.Exp.Med. 182 (5) (1995), S. 1579-1584

132. Kelly, C. J., Frishberg, Y., and Gold, D. P.: An appraisal of T cell subsets and the potential for autoimmune injury. Kidney Int. 53 (6) (1998), S. 1574-1584

133. Meeusen, E. N.: Differential migration of Th1 and Th2 cells--implications for vaccine and infection studies. Vet.Immunol.Immunopathol. 63 (1-2) (1998), S. 157-166

134. Hsieh, C. S., Macatonia, S. E., O'Garra, A., and Murphy, K. M.: T cell genetic background determines default T helper phenotype development in vitro. J.Exp.Med. 181 (2) (1995), S. 713-721

135. Constant, S. L. and Bottomly, K.: Induction of Th1 and Th2 CD4+ T cell responses: the alternative approaches. Annu.Rev.Immunol. 15:297-322 (1997), S. 297-322

136. van der Pouw Kraan TC, Boeije, L. C., Smeenk, R. J., Wijdenes, J., and Aarden, L. A.: Prostaglandin-E2 is a potent inhibitor of human interleukin 12 production. J.Exp.Med. 181 (2) (1995), S. 775-779

137. Panina-Bordignon, P., Mazzeo, D., Lucia, P. D., D'Ambrosio, D., Lang, R., Fabbri, L. , Self, C., and Sinigaglia, F.: Beta2-agonists prevent Th1 development by selective inhibition of interleukin 12. J.Clin.Invest. 100 (6) (1997), S. 1513-1519

138. Moller, D. R., Wysocka, M., Greenlee, B. M., Ma, X., Wahl, L., Trinchieri, G., and Karp, C. L.: Inhibition of human interleukin-12 production by pentoxifylline. Immunology 91 (2) (1997), S. 197-203

Anmerkungen

Kein Hinweis auf die Quelle. Referenzen werden mitübernommen.

Sichter
(SleepyHollow02) Schumann

[19.] Ad/Fragment 032 01 - Diskussion
Bearbeitet: 9. July 2014, 19:54 Hindemith
Erstellt: 7. July 2014, 12:21 (SleepyHollow02)
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Quelle: Kazak 2002
Seite(n): 28, Zeilen: 13 ff.
[Dazu gehören Substanzen, die die intrazelluläre cAMPKonzentration erhöhen, wie Prostaglandine (PGE2) (VAN DER POUW KRAAN et al. 1995),] β2-Rezeptor-Agonisten (PANINA-BORDIGNON et al. 1997) und Phosphodiesterase-Inhibitoren (z.B. Pentoxyfillin) (MOLLER et al. 1997). Prostaglandin E2 (PGE2) inhibiert zusätzlich die IFNγ-Produktion mitogenstimulierter peripherer Blutlymphozyten. Unbeeinflußt bleibt dabei die IL-4-Produktion (SNIJDEWINT et al. 1993). UV-Strahlen regen in Keratinozyten die Produktion von IL-10 an (ULLRICH 1994).

Dehydroepiandrosteronsulfat verstärkt die Th1-Antwort, während Glukokortikosteroide, Progesteron und 1,25(OH)2Vitamin D3 die Th2-Aktivität intensivieren (ROMAGNANI 1996).

Antigen-präsentierenden Zellen (APC) kommt bei der Th-Zelldifferenzierung ebenfalls eine Funktion zu: Normale, ruhende T-Lymphozyten differenzieren in IL-2- und in IFNγ-sezernierende Zellen, wenn das Antigen von Makrophagen präsentiert wird. Fungieren BZellen als APC, entwickeln sich IL-2-produzierende T-Lymphozyten, die nach Restimulation ein Th2-Muster entwickeln können (SCHMITZ et al. 1993).

Die Zytokinproduktion im humanen Blut scheint einen tageszeitlichen Rhythmus zu zeigen. Ein Peak in der Produktion von pro-inflammatorischen Zytokinen wie IFNγ, TNFα, IL-1 und IL-12 wird zur Nachtzeit sowie am frühen Morgen erreicht. Dieser Rhythmus scheint im Zusammenhang mit der rhythmischen Ausschüttung von körpereigenem Kortisol zu stehen (PETROVSKY & HARRISON 1998).

Dazu gehören Substanzen, die die intrazelluläre cAMPKonzentration erhöhen, wie Prostaglandine (PGE2) (136), b2-Rezeptor-Agonisten (137) und Phosphodiesterase-Inhibitoren (z.B. Pentoxyfillin) (138). Prostaglandin E2 (PGE2) inhibiert zusätzlich die IFNg-Produktion mitogenstimulierter peripherer Blutlymphozyten. Unbeeinflußt bleibt dabei die IL-4-Produktion (139). Glucokortikoide wie Dexamethason fördern indirekt über die Hemmung der IL-12-Produktion in antigen-präsentierenden Zellen (APC) die Entwicklung von Th2-Zellen (140). UV-Strahlen regen in Keratinozyten die Produktion von IL-10 an (141).

Dehydroepiandrosteronsulfat verstärkt die Th1-Antwort, während Glukokortikosteroide, Progesteron und 1,25(OH)2Vitamin D3 die Th2-Aktivität intensivieren (21).

Antigen-präsentierenden Zellen (APC) kommt bei der Th-Zelldifferenzierung ebenfalls eine Funktion zu. Normale, ruhende T-Lymphozyten differenzieren in IL-2- und in IFNg-sezernierende Zellen, wenn das Antigen von Makrophagen präsentiert wird. Fungieren BZellen als APC, entwickeln sich IL-2-produzierende Lymphozyten, die nach Restimulation ein Th2-Muster entwickeln können (142).

Die Zytokinproduktion im humanen Blut scheint einen tageszeitlichen Rhythmus zu zeigen. Ein Peak in der Produktion von pro-inflammatorischen Zytokinen wie IFNg, TNFa, IL-1 und IL-12 wird zur Nachtzeit sowie am frühem Morgen erreicht. Dieser Rhythmus scheint im Verhältnis zur rhythmischen Ausschüttung von körpereigenem Kortisol zu stehen (143).


138. Moller, D. R., Wysocka, M., Greenlee, B. M., Ma, X., Wahl, L., Trinchieri, G., and Karp, C. L.: Inhibition of human interleukin-12 production by pentoxifylline. Immunology 91 (2) (1997), S. 197-203

139. Snijdewint, F. G., Kalinski, P., Wierenga, E. A., Bos, J. D., and Kapsenberg, M. L.: Prostaglandin E2 differentially modulates cytokine secretion profiles of human T helper lymphocytes. J.Immunol. 150 (12) (1993), S. 5321-5329

140. DeKruyff, R. H., Fang, Y., and Umetsu, D. T.: Corticosteroids enhance the capacity of macrophages to induce Th2 cytokine synthesis in CD4+lymphocytes by inhibiting IL-12 production. J.Immunol. 160 (5) (1998), S. 2231-2237

141. Ullrich, S. E.: Mechanism involved in the systemic suppression of antigenpresenting cell function by UV irradiation. Keratinocyte-derived IL-10 modulates antigen-presenting cell function of splenic adherent cells. J.Immunol. 152 (7) (1994), S. 3410-3416

142. Schmitz, J., Assenmacher, M., and Radbruch, A.: Regulation of T helper cell cytokine expression: functional dichotomy of antigen-presenting cells. Eur.J.Immunol. 23 (1) (1993), S. 191-199

143. Petrovsky, N. and Harrison, L. C.: The chronobiology of human cytokine production. Int.Rev.Immunol. 16 (5-6) (1998), S. 635-649

Anmerkungen

Kein Hinweis auf die Quelle. Referenzen werden mitübernommen.

Sichter
(SleepyHollow02) Schumann

[20.] Ad/Fragment 033 01 - Diskussion
Bearbeitet: 7. July 2014, 14:25 Hindemith
Erstellt: 7. July 2014, 12:28 (SleepyHollow02)
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SleepyHollow02
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Untersuchte Arbeit:
Seite: 33, Zeilen: 1 ff. (kpl.)
Quelle: Kazak 2002
Seite(n): 29, Zeilen: 8 ff.
2.7 Klinische Beispiele für Th1- oder Th2- Muster bei humanen Erkrankungen

Bei einer großen Anzahl von Krankheiten kann man eine physiologische bzw. pathophysiologische Th1- oder Th2-Immunantwort beobachten (Tabelle 2).

Ad 33a diss.png

1.2.7 Klinische Beispiele für Th1- oder Th2-Muster bei humanen Erkrankungen

Bei einer großen Anzahl von Krankheiten kann man eine physiologische bzw. pathophysiologische Th1- oder Th2-Immunantwort beobachten (Tabelle 4).

Ad 33a source.png

Tabelle 4: Das Überwiegen des Th1- oder Th2-Musters bei humanen Erkrankungen


147. D'Elios, M. M., Manghetti, M., De Carli, M., Costa, F., Baldari, C. T., Burroni, D., Telford, J. L., Romagnani, S. , and Del Prete, G.: T helper 1 effector cells specific for Helicobacter pylori in the gastric antrum of patients with peptic ulcer disease. J.Immunol. 158 (2) (1997), S. 962-967

148. Yssel, H., Shanafelt, M. C., Soderberg, C., Schneider, P. V., Anzola, J., and Peltz, G.: Borrelia burgdorferi activates a T helper type 1-like T cell subset in Lyme arthritis. J.Exp.Med. 174 (3) (1991), S. 593-601

149. Parronchi, P., Romagnani, P., Annunziato, F., Sampognaro, S., Becchio, A., Giannarini, L., Maggi, E., Pupilli, C., Tonelli, F., and Romagnani, S.: Type 1 T-helper cell predominance and interleukin-12 expression in the gut of patients with Crohn's disease. Am.J.Pathol. 150 (3) (1997), S. 823-832

150. D'Elios, M. M., Josien, R., Manghetti, M., Amedei, A., De Carli, M., Cuturi, M. C., Blancho, G., Buzelin, F., Del Prete, G., and Soulillou, J. P.: Predominant Th1 cell infiltration in acute rejection episodes of human kidney grafts. Kidney Int. 51 (6) (1997), S. 1876-1884

151. Voskuhl, R. R., Martin, R., Bergman, C., Dalal, M., Ruddle, N. H., and McFarland, H. F.: T helper 1 (Th1) functional phenotype of human myelin basic proteinspecific T lymphocytes. Autoimmunity. 15 (2) (1993), S. 137-143

152. Zipris, D.: Evidence that Th1 lymphocytes predominate in islet inflammation and thyroiditis in the BioBreeding (BB) rat. J.Autoimmun. 9 (3) (1996), S. 315-319

153. Del Prete, G. F., Tiri, A., De Carli, M., Mariotti, S., Pinchera, A., Chretien, I. , Romagnani, S., and Ricci, M.: High potential to tumor necrosis factor alpha (TNFalpha) production of thyroid infiltrating T lymphocytes in Hashimoto's thyroiditis: a peculiar feature of destructive thyroid autoimmunity. Autoimmunity. 4 (4) (1989), S. 267-276

154. Piccinni, M. P. and Romagnani, S.: Regulation of fetal allograft survival by a hormone-controlled Th1- and Th2-type cytokines. Immunol.Res. 15 (2) (1996), S. 141-150

155. Sarih, M., Bouchrit, N., and Benslimane, A.: Different cytokine profiles of peripheral blood mononuclear cells from patients with persistent and selflimited hepatitis C virus infection. Immunol.Lett. 74 (2) (2000), S. 117-120

156. Fan, X. G., Liu, W. E., Li, C. Z., Wang, Z. C., Luo, L. X., Tan, D. M., Hu, G. L., and Zhang, Z.: Circulating Th1 and Th2 cytokines in patients with hepatitis C virus infection. Mediators.Inflamm. 7 (4) (1998), S. 295-297

157. Penna, A., Del Prete, G., Cavalli, A., Bertoletti, A., D'Elios, M. M., Sorrentino, R., D'Amato, M., Boni, C., Pilli, M., Fiaccadori, F., and Ferrari, C.: Predominant Thelper 1 cytokine profile of hepatitis B virus nucleocapsid-specific T cells in acute self-limited hepatitis B. Hepatology 25 (4) (1997), S. 1022-1027

158. De Carli, M., D'Elios, M. M., Mariotti, S., Marcocci, C., Pinchera, A., Ricci, M., Romagnani, S., and Del Prete, G.: Cytolytic T cells with Th1-like cytokine profile predominate in retroorbital lymphocytic infiltrates of Graves' ophthalmopathy. J.Clin.Endocrinol.Metab. 77 ( 5) (1993), S. 1120-1124

159. Dolhain, R. J., van der Heiden, A. N., ter Haar, N. T., Breedveld, F. C., and Miltenburg, A. M.: Shift toward T lymphocytes with a T helper 1 cytokinesecretion profile in the joints of patients with rheumatoid arthritis. Arthritis Rheum. 39 (12) (1996), S. 1961-1969

160. Clerici, M. and Shearer, G. M.: A TH1-->TH2 switch is a critical step in the etiology of HIV infection. Immunol.Today 14 (3) (1993), S. 107-111

161. Caligaris-Cappio, F., Bertero, M. T., Converso, M., Stacchini, A., Vinante, F., Romagnani, S., and Pizzolo, G.: Circulating levels of soluble CD30, a marker of cells producing Th2- type cytokines, are increased in patients with systemic lupus erythematosus and correlate with disease activity. Clin.Exp.Rheumatol. 13 (3) (1995), S. 339-343

162. Cogan, E., Schandene, L., Crusiaux, A., Cochaux, P., Velu, T., and Goldman, M.: Brief report: clonal proliferation of type 2 helper T cells in a man with the hypereosinophilic syndrome. N.Engl.J.Med. 330 (8) (1994), S. 535-538

163. Maggi, E., Biswas, P., Del Prete, G., Parronchi, P., Macchia, D., Simonelli, C., Emmi, L., De Carli, M., Tiri, A., and Ricci, M.: Accumulation of Th-2-like helper T cells in the conjunctiva of patients with vernal conjunctivitis. J.Immunol. 146 (4) (1991), S. 1169-1174

164. Robinson, D. S. and Kay, A. B.: Role of Th1 and Th2 cells in human allergic disorders. Chem.Immunol. 63:187-203 (1996), S. 187-203

165. Scott, P. and Kaufmann, S. H.: The role of T-cell subsets and cytokines in the regulation of infection. Immunol.Today 12 (10) (1991), S. 346-348

Anmerkungen

Kein Hinweis auf die Quelle.

Sichter
(SleepyHollow02), Hindemith

[21.] Ad/Fragment 034 01 - Diskussion
Bearbeitet: 9. July 2014, 23:49 Hindemith
Erstellt: 7. July 2014, 12:33 (SleepyHollow02)
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Typus
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Bearbeiter
SleepyHollow02
Gesichtet
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Untersuchte Arbeit:
Seite: 34, Zeilen: 1-27
Quelle: Kazak 2002
Seite(n): 29 f., Zeilen: 29: 11ff; 30: 1 ff.
[...]

Das Th1-Muster scheint bei der Entstehung von organspezifischen Autoimmunerkrankungen wie z.B. des insulin-abhängigen Diabetes mellitus eine dominierende Rolle zu spielen (ZIPRIS 1996). Die nasale Gabe von Glutamat-Decarboxylase induziert eine Th2-Antwort und verhindert bei Mäusen einen insulin-abhängigen Diabetes mellitus (TIAN et al. 1996). Ebenso läuft bei Patienten mit Autoimmunthyreoiditis (DEL PRETE et al. 1989), Multipler Sklerose (VOSKUHL et al. 1993) die Immunantwort im Sinne eines überwiegenden Th1-Zytokinmusters ab. Ein Überwiegen des Th1-Zellmusters mit einer IL-12-Expression konnte auch im Darm von Patienten mit Morbus Crohn nachgewiesen werden (PARRONCHI et al. 1997). Ebenso sind spezifische Th1-Zellen im Antrum von Patienten mit peptischem Geschwür gefunden worden (DELIOS et al. 1997b). Eine akute Hepatitis-C-Infektion, mit Kontrolle der Virusreplikation, geht mit einem Th1-Zytokinmuster (IFNγ) einher, während eine Persistenz des Virus mit Ausbildung einer chronischen Hepatitis-C-Infektion mit einem Überwiegen des Th2-Zytokinmusters assoziiert ist (SARIH et al. 2000; FAN et al. 1998; PENNA et al. 1997). Bei der rheumatischen Arthritis kann man in der Synovialflüssigkeit eine Imbalanz zwischen Th1- und Th2-Zytokinen zugunsten des Th1-Zytokinmusters finden (DOLHAIN et al. 1996). Das Th1/Th2-Zellmuster spielt auch eine wichtige Rolle bei der Entwicklung von allogene Toleranz und von Abstoßungsreaktionen. Bei der akuten Abstoßungsreaktion von transplantierten Nieren konnte eine Rekrutierung und Aktivierung von Allotransplantat spezifischen und nichtspezifischen Th1-Zellen mit einer hohen IFN-γ-Produktion gezeigt werden (DELIOS et al. 1997a).

In ähnlicher Weise nimmt das Th1/Th2-Zytokinmusters bei der Schwangerschaft eine wichtige Rolle ein. Eine Abstoßung fetalen Gewebes wird lokal an der materno-fetalen Grenzfläche über einen Switch zur Th2-Dominanz und eine Inhibierung von Th1-Antworten verhindert. Bei Frauen mit habituellen Aborten wurden in der Dezidua höhere Proportionen von Th1-Produzierenden Zellen gefunden (PICCINNI & ROMAGNANI 1996). Im Sinne der Aufrechterhaltung einer Schwangerschaft bewirkt Progesteron bevorzugt die Entwicklung eines Th2-Zellmusters, während Relaxin (ein Hormon des Corpus luteum) die Entwicklung [Th1-Zytokin-produzierender T-Zellen begünstigt (PICCINNI & ROMAGNANI 1996; PICCINNI et al. 1995).]

Das Th1-Muster scheint bei der Entstehung von organspezifischen Autoimmunerkrankungen wie z.B. des insulin-abhängigen Diabetes mellitus eine Rolle zu spielen (152). Die nasale Gabe von Glutamat-Decarboxylase (GAD65) induziert eine Th2-Antwort und verhindert bei Mäusen einen insulin-abhängigen Diabetes mellitus (166). Ebenso läuft bei Patienten mit Autoimmunthyreoditis (153), Multipler Sklerose (151) und Graves Ophthalmopathy (158) die Immunantwort im Sinne eines Th1-Zellmusters ab.

[Seite 30:]

Ein Überwiegen des Th1-Zellmusters mit einer IL-12-Expression konnte im Darm von Patienten mit Morbus Crohn nachgewiesen werden (149). Ebenso sind helicobacter-pylorispezifische Th1-Zellen im Antrum von Patienten mit peptischem Geschwür gefunden worden (147). Eine akute Hepatitis-C-Infektion, mit Kontrolle der Virusreplikation, geht mit einem Th1-Zytokinmuster (IFNg) einher, während eine Persistenz des Virus mit Ausbildung einer chronischen Hepatitis-C-Infektion mit einem Überwiegen des Th2-Zytokinmusters assoziiert ist (155-157). Bei der rheumatischen Arthritis kann man in der Synovialflüssigkeit eine Imbalanz zwischen Th1- und Th2-Zytokinen zugunsten des Th1-Zytokinmusters finden (159). Das Th1/Th2-Zellmuster spielt auch eine wichtige Rolle bei der Entwicklung von allograft Toleranz und Abstoßungsreaktionen. Bei der akuten Abstoßungsreaktion von transplantierten Nieren konnte eine Rekrutierung und Aktivierung von allospezifischen und nichtspezifischen Th1-Zellen mit einer hohen IFN-g-Produktion gezeigt werden (150).

In ähnlicher Weise nimmt das Th1/Th2-Zellmuster bei der Schwangerschaft eine wichtige Rolle ein. Eine Abstoßung fetalen Gewebes wird lokal auf der Ebene der materno-fetalen Einheit über einen Switch zum Th2-Zelltyp und eine Inhibierung einer Th1-Antwort verhindert. Bei Frauen mit habituellen Aborten wurden in der Dezidua höhere Proportionen von Th1-Klonen gefunden (154). In Sinne der Aufrechterhaltung einer Schwangerschaft bewirkt Progesteron bevorzugt die Entwicklung eines Th2-Zellmusters, während Relaxin (ein Hormon des Corpus luteum) die Entwicklung Th1-Zytokin-produzierender T-Zellen begünstigt (154, 167).


147. D'Elios, M. M., Manghetti, M., De Carli, M., Costa, F., Baldari, C. T., Burroni, D., Telford, J. L., Romagnani, S. , and Del Prete, G.: T helper 1 effector cells specific for Helicobacter pylori in the gastric antrum of patients with peptic ulcer disease. J.Immunol. 158 (2) (1997), S. 962-967

149. Parronchi, P., Romagnani, P., Annunziato, F., Sampognaro, S., Becchio, A., Giannarini, L., Maggi, E., Pupilli, C., Tonelli, F., and Romagnani, S.: Type 1 T-helper cell predominance and interleukin-12 expression in the gut of patients with Crohn's disease. Am.J.Pathol. 150 (3) (1997), S. 823-832

150. D'Elios, M. M., Josien, R., Manghetti, M., Amedei, A., De Carli, M., Cuturi, M. C., Blancho, G., Buzelin, F., Del Prete, G., and Soulillou, J. P.: Predominant Th1 cell infiltration in acute rejection episodes of human kidney grafts. Kidney Int. 51 (6) (1997), S. 1876-1884

151. Voskuhl, R. R., Martin, R., Bergman, C., Dalal, M., Ruddle, N. H., and McFarland, H. F.: T helper 1 (Th1) functional phenotype of human myelin basic proteinspecific T lymphocytes. Autoimmunity. 15 (2) (1993), S. 137-143

152. Zipris, D.: Evidence that Th1 lymphocytes predominate in islet inflammation and thyroiditis in the BioBreeding (BB) rat. J.Autoimmun. 9 (3) (1996), S. 315-319

153. Del Prete, G. F., Tiri, A., De Carli, M., Mariotti, S., Pinchera, A., Chretien, I. , Romagnani, S., and Ricci, M.: High potential to tumor necrosis factor alpha (TNFalpha) production of thyroid infiltrating T lymphocytes in Hashimoto's thyroiditis: a peculiar feature of destructive thyroid autoimmunity. Autoimmunity. 4 (4) (1989), S. 267-276

154. Piccinni, M. P. and Romagnani, S.: Regulation of fetal allograft survival by a hormone-controlled Th1- and Th2-type cytokines. Immunol.Res. 15 (2) (1996), S. 141-150

155. Sarih, M., Bouchrit, N., and Benslimane, A.: Different cytokine profiles of peripheral blood mononuclear cells from patients with persistent and selflimited hepatitis C virus infection. Immunol.Lett. 74 (2) (2000), S. 117-120

156. Fan, X. G., Liu, W. E., Li, C. Z., Wang, Z. C., Luo, L. X., Tan, D. M., Hu, G. L., and Zhang, Z.: Circulating Th1 and Th2 cytokines in patients with hepatitis C virus infection. Mediators.Inflamm. 7 (4) (1998), S. 295-297

157. Penna, A., Del Prete, G., Cavalli, A., Bertoletti, A., D'Elios, M. M., Sorrentino, R., D'Amato, M., Boni, C., Pilli, M., Fiaccadori, F., and Ferrari, C.: Predominant Thelper 1 cytokine profile of hepatitis B virus nucleocapsid-specific T cells in acute self-limited hepatitis B. Hepatology 25 (4) (1997), S. 1022-1027

158. De Carli, M., D'Elios, M. M., Mariotti, S., Marcocci, C., Pinchera, A., Ricci, M., Romagnani, S., and Del Prete, G.: Cytolytic T cells with Th1-like cytokine profile predominate in retroorbital lymphocytic infiltrates of Graves' ophthalmopathy. J.Clin.Endocrinol.Metab. 77 ( 5) (1993), S. 1120-1124

159. Dolhain, R. J., van der Heiden, A. N., ter Haar, N. T., Breedveld, F. C., and Miltenburg, A. M.: Shift toward T lymphocytes with a T helper 1 cytokinesecretion profile in the joints of patients with rheumatoid arthritis. Arthritis Rheum. 39 (12) (1996), S. 1961-1969

166. Tian, J., Atkinson, M. A., Clare-Salzler, M., Herschenfeld, A., Forsthuber, T., Lehmann, P. V., and Kaufman, D. L.: Nasal administration of glutamate decarboxylase (GAD65) peptides induces Th2 responses and prevents murine insulin-dependent diabetes. J.Exp.Med. 183 (4) (1996), S. 1561-1567

167. Piccinni, M. P., Giudizi, M. G., Biagiotti, R., Beloni, L., Giannarini, L., Sampognaro, S., Parronchi, P., Manetti, R. , Annunziato, F., and Livi, C.: Progesterone favors the development of human T helper cells producing Th2-type cytokines and promotes both IL-4 production and membrane CD30 expression in established Th1 cell clones. J.Immunol. 155 (1) (1995), S. 128-133

Anmerkungen

Kein Hinweis auf die Quelle. Referenzen werden mitübernommen. Zu Beginn de Seite steht eine Tabellenunterschrift, die auf der Vorseite dokumentiert ist: Ad/Fragment 033 01

Sichter
(SleepyHollow02), Hindemith

[22.] Ad/Fragment 035 04 - Diskussion
Bearbeitet: 10. July 2014, 01:08 Hindemith
Erstellt: 8. July 2014, 14:55 (SleepyHollow02)
Ad, Fragment, Gesichtet, KomplettPlagiat, Rohwer 2004, SMWFragment, Schutzlevel sysop

Typus
KomplettPlagiat
Bearbeiter
SleepyHollow02
Gesichtet
Yes.png
Untersuchte Arbeit:
Seite: 35, Zeilen: 4-27
Quelle: Rohwer 2004
Seite(n): 37, Zeilen: 1 ff.
2.8.1 Definitionen und Einsatzmöglichkeiten

Das Konzept der Immunstimulation erstellte Dr. William B. Coley 1907. Er bemerkte spontane Tumorregressionen bei einigen seiner Patienten nach Septikämie. Aus dieser Beobachtung heraus entwickelte er ein Gemisch von Bakterientoxinen (Coley´s Toxin), welches er zur Krebstherapie einsetzte (RUSH 2001).

A. MAYR (ROLLE & MAYER 1993) führte den Begriff der „Paramunisierung“ ein. Damit bezeichnete er zunächst begleitende, Antigen unspezifische Wirkungen von Schutzimpfungen, deren funktionelle Mechanismen er fast durchweg den angeborenen Immunmechanismen (Phagozytose, ADCC, Bildung von Interferon, Aktivierung des Komplementsystems, hormonelle Interaktionen) zurechnete. Die „Paramunisierung“ sei allerdings auf die „noch vorhandene Funktionsfähigkeit des Immunsystems und seiner Zellen angewiesen“. Es soll durch die Paramunität ein schnell einsetzender (wenige Stunden), aber nur kurz anhaltender (einige Tage) Schutz des Individuums erreicht werden; ein Boostereffekt soll nicht zustande kommen.

TIZARD (1993) definiert Immunstimulanzien durch ihre Fähigkeit, nicht-antigenspezifische humorale und auch zellvermittelte Abwehrmechanismen zu fördern. Dies wird seiner Ansicht nach durch Makrophagen vermittelt, die durch die Phagozytose der Immunstimulanspartikel aktiviert werden und daraufhin bestimmte Zytokine (Interferon, Interleukin 1, Tumornekrosefaktor und/oder Interleukin 6 freisetzen und so zu einer Steigerung der Phagozytoseaktivität, der Antikörperproduktion und der Zytotoxizität führen.

RUSH (2001) postuliert, dass immunstimulatorische Therapien v.a. bei chronischen oder rezidivierenden Infektionen wirken, da hier eine Immunsuppression oder –toleranz vorläge. Für wenig sinnvoll hält er ihren Einsatz bei akuten Infektionen, da dort das Immunsystem schon maximal stimuliert sei.

2.3.1 Definitionen und Einsatzmöglichkeiten

Das Konzept der Immunstimulation erstellte Dr. William B. Coley 1907. Er bemerkte spontane Tumorregressionen bei einigen seiner Patienten nach Septikämie. Aus dieser Beobachtung heraus entwickelte er ein Gemisch von Bakterientoxinen (Coley´s Toxin), welches er zur Krebstherapie einsetzte. (RUSH 2001)

A. MAYR (ROLLE & MAYER 1993) führte den Begriff der „Paramunisierung“ ein. Damit bezeichnete er zunächst begleitende, Antigen unspezifische Wirkungen von Schutzimpfungen, deren funktionelle Mechanismen er fast durchweg den angeborenen Immunmechanismen (Phagozytose, ADCC, Bildung von Interferon, Aktivierung des Komplementsystems, hormonelle Interaktionen) zurechnete. Die „Paramunisierung“ sei allerdings auf die „noch vorhandene Funktionsfähigkeit des Immunsystems und seiner Zellen angewiesen“. Es soll durch die Paramunität ein schnell einsetzender (wenige Stunden), aber nur kurz anhaltender (einige Tage) Schutz des Individuums erreicht werden; ein Boostereffekt soll nicht zustande kommen.

TIZARD (1993) definiert Immunstimulantien durch ihre Fähigkeit, nicht-antigenspezifische humorale und auch zellvermittelte Abwehrmechanismen zu fördern. Dies wird seiner Ansicht nach durch Makrophagen vermittelt, die durch die Phagozytose der Immunstimulanspartikel aktiviert werden und daraufhin bestimmte Zytokine (Interferon, Interleukin 1, Tumornekrosefaktor und/oder Interleukin 6) freisetzten und so zu einer Steigerung der Phagozytoseaktivität, der Antikörperproduktion und der Zytotoxizität führen.

RUSH (2001) postuliert, dass immunstimulatorische Therapien v.a. bei chronischen oder rezidivierenden Infektionen wirken, da hier eine Immunsuppression oder –toleranz vorläge. Für wenig sinnvoll hält er ihren Einsatz bei akuten Infektionen, da dort das Immunsystem schon maximal stimuliert sei.

Anmerkungen

Kein Hinweis auf die Quelle.

Sichter
(SleepyHollow02), Hindemith

[23.] Ad/Fragment 038 03 - Diskussion
Bearbeitet: 10. July 2014, 00:40 Hindemith
Erstellt: 8. July 2014, 09:39 (SleepyHollow02)
Ad, Fragment, Gesichtet, SMWFragment, Schmidmaier 2002, Schutzlevel sysop, Verschleierung

Typus
Verschleierung
Bearbeiter
SleepyHollow02
Gesichtet
Yes.png
Untersuchte Arbeit:
Seite: 38, Zeilen: 1ff (komplett)
Quelle: Schmidmaier 2002
Seite(n): 13, 14, Zeilen: 13: 16 ff.; 14: 1 ff.
2.10 Mitogene und mitogene Stimulation

Lektine (legere: nehmen) (LIS & SHARON 1998; SHARON 1983) sind Proteine, die mit unterschiedlicher Selektivität reversibel Mono- und Oligosaccharide binden, sowie Polysaccharide und Glykoproteine präzipitieren können. Zellen, die „passende“ Zuckerreste an ihrer Oberfläche Tragen, können duch Lektine Agglutiniert und auch aktiviert werden. Die agglutinierenden und präzipitierenden Eigenschaften ähneln denen von Antikörpern. Wichtiger Unterschied zwischen Antikörpern und Lektinen ist, dass Lektine leicht durch Antagonisierung mit Zuckern wieder ablösbar sind, und die Zellen volle Funktion behalten. Zudem werden Lektine nicht nur durch menschliche und tierische, sondern durch Zellen von allen Klassen lebender Organismen produziert. Biologische Aufgaben der Lektine sind die Entfernung von Glykoproteinen aus der Zirkulation, die Adhäsion infektiöser Agentien, die Rekrutierung von Leukozyten und die Zell-Zell-Interaktion im Immunsystem. Lektine stimulieren etwa 70-80% der peripheren Lymphozyten unabhängig von der Antigenspezifität (Antigene stimulieren etwa 0,02%). Nach der Entdeckung der Lektine 1888 wurde das Hauptaugenmerk auf deren Fähigkeit zur Bindung und damit zur Klassifizierung von Blutgruppenantigenen gerichtet. 1960 berichtete Nowell (NOWELL 1960) erstmals über die mitogenen Eigenschaften von PHA und zeigte, dass ruhende Lymphozyten keine enddifferenzierten Zellen, sondern sehr wohl proliferationsfähig sind. 1976 entdeckte Gallo Interleukin-2 im Kulturmedium PHA-stimulierter Lymphozyten (CRUSE & LEWIS 1995). SHARON nutzte Lektinrezeptoren als Lymphozyten Oberflächenmarker (SHARON 1983). Lektine sind oligomere Proteine. Die größte und am besten untersuchte Familie ist die der Leguminose-Lektine, zu der Concanavalin A (ConA; aus der Jackbean (Canavalia ensiformis)), Phytohämagglutinin (PHA; aus der Kidney Bean (Phaseolus vulgaris)), sowie Lektine der Sojabohne (SBA) und der Erdnuss (PNA) gehören. Leguminose-Lektine bestehen aus zwei oder vier identischen 25-30 kD-Untereinheiten, von denen jede eine eigene Kohlenhydratbindungsstelle identischer Spezifität besitzt. Prominente Ausnahme ist das PHA, welches aus fünf tetrameren Glykoproteinen besteht mit Zusammensetzung jedes Glykoproteins aus 2 verschiedenen Untereinheiten: E oder L. E4 (E-PHA) ist ein potentes Hämagglutinin, L4 (L-PHA) ein Leukoagglutinin mit mitogenen Eigenschaften. Die gemischten Formen (z.B. L2E2) sind weniger wirksam. PHA-P ist die Proteinform des Lektins vor Auftrennung in L- und E-Formen. Lektine werden nach ihrer Spezifität für verschiedene Kohlenhydrate klassifiziert: Mannose, Galaktose, N- Acetylglucosamin, L[Fucose, N-Acteyl-Neuraminsäure.]

1.4 Lektine

Lektine (legere: nehmen) (117, 180) sind Zellen agglutinierende Proteine nicht-immunologischer Herkunft, die mit hoher Spezifität und reversibel Mono- und Oligosaccharide binden, sowie Polysaccharide und Glykoproteine präzipitieren können. Die agglutinierenden und präzipitierenden Eigenschaften ähneln denen von Antikörpern. Wichtiger Unterschied zwischen Antikörpern und Lektinen ist, dass Lektine leicht durch Antagonisierung mit Zuckern wieder ablösbar sind, und die Zellen volle Funktion behalten. Zudem werden Lektine nicht nur durch menschliche und tierische, sondern durch Zellen von allen Klassen lebender Organismen produziert. Biologische Aufgaben der Lektine sind die Entfernung von Glykoproteinen aus der Zirkulation, die Adhäsion infektiöser Agentien, die Rekrutierung von Leukozyten und die Zell-Zell-Interaktion im Immunsystem. Lektine stimulieren etwa 70-80% der peripheren Lymphozyten unabhängig von der Antigenspezifität (Antigene stimulieren etwa 0,02%). Nach der Entdeckung der Lektine 1888 wurde das Hauptaugenmerk auf deren Fähigkeit zur Bindung und damit zur Klassifizierung von Blutgruppenantigenen gerichtet. 1960 berichtete Nowell (140) erstmals über die mitogenen Eigenschaften von PHA und zeigte, dass ruhende Lymphozyten keine enddifferenzierten Zellen, sondern sehr wohl proliferationsfähig sind. 1976 entdeckte Gallo Interleukin-2 im Kulturmedium PHA-stimulierter Lymphozyten (41). Sharon nutzte Lektinrezeptoren als Lymphozyten-Oberflächenmarker. Lektine sind oligomere Proteine. Die größte und am besten untersuchte Familie ist die der Leguminose-Lektine, zu der Concanavalin A (ConA; aus der Jackbean (Canavalia Problemstellung vor dem Hintergrund

[Seite 14:]

aktueller Erkenntnisse ensiformis)), Phytohämagglutinin (PHA; aus der Kidney Bean (Phaseolus vulgaris)), sowie Lektine der Sojabohne (SBA) und der Erdnuss (PNA) gehören. Leguminose-Lektine bestehen aus zwei oder vier identischen 25-30 kD-Untereinheiten, von denen jede eine eigene Kohlenhydratbindungsstelle identischer Spezifität besitzt. Prominente Ausnahme ist das PHA, welches aus fünf tetrameren Glykoproteinen besteht mit Zusammensetzung jedes Glykoproteins aus 2 verschiedenen Untereinheiten: E oder L. E4 (E-PHA) ist ein potentes Hämagglutinin, L4 (L-PHA) ein Leukoagglutinin mit mitogenen Eigenschaften. Die gemischten Formen (z.B. L2E2) sind weniger wirksam. PHA-P ist die Proteinform des Lektins vor Auftrennung in L- und E-Formen. Lektine werden nach ihrer Spezifität für verschiedene Kohlenhydrate klassifiziert: Mannose, Galaktose, NAcetylglucosamin, L-Fucose, N-Acteyl-Neuraminsäure.


41. Cruse, J.M., Lewis, R.E., "Illustrated Dictionary of Immunology", CRC Press, Boca Raton, 1995, S. 76 und 234.

117. Lis, H., Sharon, N., Lectins, In: "Encyclopedia of Immunology", Delves, P.J., Roitt, I.M. (Editors), Academic Press, San Diego, London, 1998, 2nd edition, 1335-1341.

140. Nowell, P.C., Phytohemagglutinin: An Initiator ofMitosis in Culrures of Normal Human Leucocytes., Cancer Res 20 (1960): 462-466

180. Sharon, N., Lectin Receptors as Lymphocyte Surface Markers., Adv Immunol 34 (1983): 213-298.

Anmerkungen

Kein Hinweis auf die Quelle. Referenzen werden mitübernommen.

Sichter
(SleepyHollow02), Hindemith

[24.] Ad/Fragment 039 01 - Diskussion
Bearbeitet: 8. July 2014, 17:49 Hindemith
Erstellt: 8. July 2014, 09:53 (SleepyHollow02)
Ad, Fragment, Gesichtet, KomplettPlagiat, SMWFragment, Schmidmaier 2002, Schutzlevel sysop

Typus
KomplettPlagiat
Bearbeiter
SleepyHollow02
Gesichtet
Yes.png
Untersuchte Arbeit:
Seite: 39, Zeilen: 1 ff. (kpl.)
Quelle: Schmidmaier 2002
Seite(n): 14, 15, Zeilen: 14: 10 ff. - 15: 1 ff.
Die Lektine innerhalb einer Gruppe können sich beträchtlich bezüglich ihrer Spezifität unterscheiden (verschiedene Zuckerderivate, Monosaccharide versus Di-, Tri-, Tetrasaccharide). Die Bindung zwischen den Lektin-Proteinen und den Zuckern erfolgt durch Wasserstoffbrückenbindungen und hydrophobe Wechselwirkungen, sowie wahrscheinlich über Koordination mit Metallionen. Innerhalb einer Familie sind die Bindungen strukturell einheitlich, so in der Leguminose-Familie (unabhängig von der Spezifität) durch drei Bindungsstellen, ein Aspartatrest, ein Asparaginrest und eine aromatische Aminosäure. Im Gegensatz zu PWM (pokeweed mitogen, das B- und T-Zellen stimuliert) gelten PHA und ConA als spezielle T-Zellstimulatoren. Mitogene Lektine sind polyklonale Aktivatoren, die Lymphozyten, inklusive Gedächtniszellen, unabhängig von der Antigenspezifität stimulieren. Die T-Zellen proliferieren aber nur, wenn gleichzeitig Monozyten als akzessorische Zellen anwesend sind. B- Zellen proliferieren nicht (ARALACHAVES et al. 1978; CRUSE & LEWIS 1995). PHA bindet an einen Bestandteil des CD3-Komplex und an CD2. Weitere Bindungsstellen existieren, sind aber nicht bekannt.

Wahrscheinlich ist es ein "cross-linking" zwischen CD3 und anderen T-Zellmarkern (CD2, CD4, CD8, CD11a/CD18, MHC-I), welches für die Aktivierung speziell der T-Zellen verantwortlich ist. Die Rolle der notwendigen akzessorischen Zellen ist unklar. Einerseits könnte es zum "cross-link" zwischen Monozyt und T-Zelle kommen, wodurch die T-Zellen im Microenvironment des Makrophagen (IL1, TNFα) wären. Andererseits ist anzunehmen, dass Mechanismen wie bei Antikörpern, nämlich die Bildung einer Art zellulären Matrix, eine Rolle spielen. In Anwesenheit mitogener Lektine sind CTL in der Lage, eine Großzahl antigenetisch unterschiedlicher Zielzellen zu lysieren, was als lektinabhängige Zytotoxizität bezeichnet wird (analog zur antigenabhängigen Zytotoxizität). Zu diesem Phänomen gehört auch die Tumorzell-Lyse durch Makrophagen. ConA-aktivierte, nicht jedoch PHA-aktivierte, CD4+ T-Zellen supprimieren die Ig-Bildung durch B-Zellen (SLEASMAN et al. 1991), dies jedoch nicht direkt, sondern nur in Anwesenheit von CD8+ T-Zellen. Bei ConA-Aktivierung entstehen also CD4+ Suppressor-Inducer- Zellen, die CD8+ Suppressor-Effektor-Zellen induzieren können, welche wiederum die Ig-Bildung autologer B-Zellen hemmen. Dennoch haben die ConA-aktivierten CD4+ T-Zellen auch potente Helferaktivität für autologe B-Lymphozyten.

Somit findet man in der Population der ConA- aktivierten T-Zellen mindestens zwei Subpopulationen; die Suppressor-Inducer-Zellen und die Helper-Inducer-Zellen, welche sich auch phänotypisch unterscheiden (CD45RA bzw. CDw29) (CRUSE & LEWIS 1995). Hilfe und Suppression beziehen sich dabei auf die Fähigkeit zur Modulation einer [Zellantwort. ConA stimuliert vorwiegend die CD45RA-Expression auf CD4-Lymphozyten und verschiebt damit das Gleichgewicht zwischen CD45RA- und CDw29-Expression zugunsten der Suppressor-Inducer- Zellen.]

´Die Lektine innerhalb einer Gruppe können sich beträchtlich bezüglich ihrer Spezifität unterscheiden (verschiedene Zuckerderivate, Monosaccharide versus Di-, Tri-, Tetrasaccharide). Die Bindung zwischen den Lektin-Proteinen und den Zuckern erfolgt durch Wasserstoffbrückenbindungen und hydrophobe Wechselwirkungen, sowie wahrscheinlich über Koordination mit Metallionen. Innerhalb einer Familie sind die Bindungen strukturell einheitlich, so in der Leguminose-Familie (unabhängig von der Spezifität) durch drei Bindungsstellen, ein Aspartatrest, ein Asparaginrest und eine aromatische Aminosäure.

Im Gegensatz zu PWN (pokeweed mitogen, das B- und T-Zellen stimuliert) gelten PHA und ConA als spezielle T-Zellstimulatoren. Mitogene Lektine sind polyklonale Aktivatoren, die Lymphozyten, inklusive Gedächtniszellen, unabhängig von der Antigenspezifität stimulieren. Die T-Zellen proliferieren aber nur, wenn gleichzeitig Monozyten als akzessorische Zellen anwesend sind. B-Zellen proliferieren nicht (8, 41, 59). PHA bindet an einen Bestandteil des CD3-Komplex und an CD2 (Schafserythrozytenrezeptor). Weitere Bindungsstellen existieren, sind aber nicht bekannt. Wahrscheinlich ist es ein "cross-linking" zwischen CD3 und anderen T-Zellmarkern (CD2, CD4, CD8, CD11a/CD18, MHC-I), welcher für die Aktivierung speziell der T-Zellen verantwortlich ist.

Die Rolle der notwendigen akzessorischen Zellen ist unklar. Einerseits könnte es zum "cross-link" zwischen Monozyt und T-Zelle kommen, wodurch die T-Zellen im Microenvironment des Makrophagen (Il-1, TNFα) wären. Andererseits ist anzunehmen, dass Mechanismen wie bei Antikörpern, nämlich die Bildung einer Art zellulären Matrix, eine Rolle spielen. In Anwesenheit mitogener Lektine sind CTL in der Lage, eine Großzahl antigenetisch unterschiedlicher Zielzellen zu lysieren, was als lektinabhängige Zytotoxizität bezeichnet wird (analog zur antigenabhängigen Zytotoxizität). Zu diesem Phänomen gehört auch die Tumorzell-Lyse durch Makrophagen (auch induzierbar durch Antikörper). ConA-aktivierte, nicht jedoch PHA-aktivierte, CD4+ T-Zellen supprimieren die Ig-Bildung durch B-Zellen (185), dies jedoch nicht direkt, sondern nur in Anwesenheit von CD8+ T-Zellen. Bei ConA-Aktivierung entstehen also CD4+ Suppressor-Inducer-Zellen, die CD8+ Suppressor-Effektor-Zellen induzieren können, welche wiederum die Ig-Bildung

[Seite 15]

autologer B-Zellen hemmen. Dennoch haben die ConA-aktivierten CD4+ T-Zellen auch potente Helferaktivität für autologe B-Lymphozyten. Somit findet man in der Population der ConAaktivierten T-Zellen mindestens zwei Subpopulationen; die Suppressor-Inducer-Zellen und die Helper-Inducer-Zellen, welche sich auch phänotypisch unterscheiden (CD45RA bzw. CDw29) (43). Hilfe und Suppression beziehen sich dabei auf die Fähigkeit zur Modulation einer B-Zellantwort. ConA stimuliert vorwiegend die CD45RA-Expression auf CD4-Lymphozyten und verschiebt damit das Gleichgewicht zwischen CD45RA- und CDw29-Expression zugunsten der Suppressor-Inducer- Zellen.


8. Arala-Chaves, M.P., Hope, L., Korn, J.H., Fudenberg, H., Role of adherent cells in immune responses to phytohemagglutinin ans concanavalin A., Eur J Immunol 8 (1978): 77- 81.

41. Cruse, J.M., Lewis, R.E., "Illustrated Dictionary of Immunology", CRC Press, Boca Raton, 1995, S. 76 und 234.

43. Cruse, J.M., Lewis, R.E., The Thymus an T Lymphocytes, "Atlas of Immunology", CRC Press, Boca Raton, 1999, S. 161-183.

59. Geppert, T., Phytohemagglutinin (PHA), In: "Encyclopedia of Immunology", Delves, P.J., Roitt, I.M. (Editors), Academic Press, San Diego, London, 1998, 2nd edition, 1952-53.

Anmerkungen

Kein Hinweis auf die Quelle.

Sichter
(SleepyHollow02) Schumann

[25.] Ad/Fragment 040 01 - Diskussion
Bearbeitet: 8. July 2014, 17:55 Hindemith
Erstellt: 8. July 2014, 10:01 (SleepyHollow02)
Ad, Fragment, Gesichtet, KomplettPlagiat, SMWFragment, Schmidmaier 2002, Schutzlevel sysop

Typus
KomplettPlagiat
Bearbeiter
SleepyHollow02
Gesichtet
Yes.png
Untersuchte Arbeit:
Seite: 40, Zeilen: 1-18
Quelle: Schmidmaier 2002
Seite(n): 15, Zeilen: 6 ff.
ConA stimuliert vorwiegend die CD45RA-Expression auf CD4-Lymphozyten und verschiebt damit das Gleichgewicht zwischen CD45RA- und CDw29-Expression zugunsten der Suppressor-Inducer- Zellen. Bei PHA hingegen kann man eine Abhängigkeit von der T-Zellkonzentration beobachten. Bei (zunächst) geringer Zelldichte in der Kultur zeigt sich bei PHA-Stimulation eine starke Helferfunktion. Bei hoher Zellkonzentration verlassen die meisten T-Zellen den proliferativen Zellzyklus und entwickeln Suppressorfunktion. Wahrscheinlich ist dies ein natürliches Prinzip, das essentiell für eine physiologische Regulation der Immunantwort und auf eine Großzahl verschiedener Immunreaktionen anwendbar ist. Hauptaufgabe der Lektine ist die Zellerkennung, sowie die Erkennung von Viren (Influenzavirus-Hämagglutinin spezifisch für N- Acetylneuraminsäure) und Bakterien. So kann es z.B. durch Bindung der Pathogene an Makrophagen und andere Immunzellen des Wirtes zur Initiierung einer Immunreaktion ohne klassische Opsonisierung kommen. In Anlehnung zur Opsonophagozytose nennt man diesen Prozeß Lektinophagozytose. Andererseits finden pathogene Mikroorganismen auf diesem Wege ihre Zielzellen. Auch konnte die Adhäsionsfunktion bei der Metastasierung menschlicher Tumoren nachgewiesen worden. Über dies [sic] gibt es lösliche Lektine, die - auf Mikroorganismen gebunden - Komplement aktivieren und damit die Lyse einleiten. Mehrere dieser "nicht-immunologischen" Abwehrstrategien gegen Mikroorganismen sind erforscht. ConA stimuliert vorwiegend die CD45RA-Expression auf CD4-Lymphozyten und verschiebt damit das Gleichgewicht zwischen CD45RA- und CDw29-Expression zugunsten der Suppressor-Inducer-Zellen. Bei PHA hingegen kann man eine Abhängigkeit von der T-Zellkonzentration beobachten (155). Bei (zunächst) geringer Zelldichte in der Kultur zeigt sich bei PHA-Stimulation eine starke

Helferfunktion. Bei hoher Zellkonzentration verlassen die meisten T-Zellen den proliferativen Zellzyklus und entwickeln Suppressorfunktion. Wahrscheinlich ist dies ein natürliches Prinzip, das essentiell für eine physiologische Regulation der Immunantwort und auf eine Großzahl verschiedener Immunreaktionen anwendbar ist. Hauptaufgabe der Lektine ist die Zellerkennung, sowie die Erkennung von Viren (Influenzavirus-Hämagglutinin spezifisch für N-Acetylneuraminsäure) und Bakterien. So kann es z.B. durch Bindung der Pathogene an Makrophagen und andere Immunzellen des Wirtes zur Initiierung einer Immunreaktion ohne klassische Opsonisierung kommen. In Anlehnung zur Opsonophagozytose nennt man diesen Prozeß Lektinophagozytose. Andererseits finden pathogene Mikroorganismen auf diesem Wege ihre Zielzellen. Auch konnte die Adhäsionsfunktion bei der Metastasierung menschlicher Tumoren nachgewiesen worden. Überdies gibt es lösliche Lektine, die - auf Mikroorganismen gebunden - Komplement aktivieren und damit die Lyse einleiten. Mehrere dieser "nicht-immunologischen" Abwehrstrategien gegen Mikroorganismen sind erforscht.


155. Piguet, P.F., Dewey, H.K., Vassalli, P., Induction or suppression of B cell proliferation and differntiation by PHA or ConA in mouse spleen cell cultures., J Immunol 117 (1976): 1817-23.

Anmerkungen

Kein Hinweis auf die Quelle.

Sichter
(SleepyHollow02) Schumann

[26.] Ad/Fragment 040 19 - Diskussion
Bearbeitet: 10. July 2014, 14:18 Schumann
Erstellt: 7. July 2014, 20:33 (SleepyHollow02)
Ad, Fragment, Gesichtet, KomplettPlagiat, Krueger 2001, SMWFragment, Schutzlevel sysop

Typus
KomplettPlagiat
Bearbeiter
SleepyHollow02
Gesichtet
Yes.png
Untersuchte Arbeit:
Seite: 40, Zeilen: 19-30
Quelle: Krueger 2001
Seite(n): 15, Zeilen: 18 ff.
2.11 Bakterielle Superantigene

Der Begriff „Superantigene“ bezeichnet eine heterogene Gruppe von Proteinmolekülen, die mit Antigen-präsentierenden Zellen und T-Lymphozyten interagieren. Hierzu ist nicht die intrazelluläre Prozessierung, die üblicherweise für ein Antigen typisch ist, erforderlich (FLEISCHER & SCHREZENMEIER 1988), sondern die Aktivierung erfolgt nach Assoziation mit dem MHC-Klasse-II-Molekül der Antigen-präsentierenden Zelle und der Vβ- Region des T-Zellrezeptors von T-Lymphozyten (GASCOIGNE 1993). Durch diese Interaktion sind Superantigene in der Lage, eine deutlich höhere Prozentzahl des T-Zellrepertories des Wirtes zu aktivieren als durch die Präsentation eines, auf herkömmliche Weise prozessierten, Antigens erfolgt. In Abhängigkeit vom jeweiligen Superantigen und der Frequenz von „passenden“ variablen Rezeptorsegmenten führt diese Interaktion zur initialen Proliferation von bis zu 25% des individuellen T-Zellrepertoires, während die [Reaktionshäufigkeit bei der normalen Antigenpräsentation unter 0,1% der Zellen liegt (IRWIN & GASCOIGNE 1993).]

2.1 Bakterielle Superantigene

Der Begriff „Superantigene“ bezeichnet eine heterogene Gruppe von Proteinmolekülen, die mit Antigen-präsentierenden Zellen und T-Lymphozyten interagieren. Hierzu ist nicht die intrazelluläre Prozessierung, die üblicherweise für ein Antigen typisch ist, erforderlich (FLEISCHER & SCHREZENMEIER 1988), sondern die Aktivierung erfolgt nach Assoziation mit dem MHC-Klasse-II-Molekül der Antigen-präsentierenden Zelle und der Vβ-Region des T-Zellrezeptors von T-Lymphozyten (GASCOIGNE 1993). Durch diese Interaktion sind Superantigene in der Lage, eine deutlich höhere Prozentzahl des T-Zellreservoirs des Wirtes zu aktivieren als durch die Präsentation eines, auf herkömmliche Weise prozessierten, Antigens erfolgt. In Abhängigkeit vom jeweiligen Superantigen und der Frequenz von „passenden“ variablen Rezeptorsegmenten führt diese Interaktion zur initialen Proliferation von bis zu 25% des individuellen T-Zellrepertoires, während die Reaktionshäufigkeit bei der normalen Antigenpräsentation unter 0,1% der Zellen liegt (IRWIN & GASCOIGNE 1993).

Anmerkungen

Kein Hinweis auf die Quelle. Referenzen werden mitübernommen.

Der Begriff "Zellrepertories" existiert online nur in der Arbeit von Ad: [1].

Sichter
(SleepyHollow02), Hindemith

[27.] Ad/Fragment 041 01 - Diskussion
Bearbeitet: 7. July 2014, 21:27 Hindemith
Erstellt: 7. July 2014, 20:44 (SleepyHollow02)
Ad, Fragment, Gesichtet, KomplettPlagiat, Krueger 2001, SMWFragment, Schutzlevel sysop

Typus
KomplettPlagiat
Bearbeiter
SleepyHollow02
Gesichtet
Yes.png
Untersuchte Arbeit:
Seite: 41, Zeilen: 1 ff. (komplett)
Quelle: Krueger 2001
Seite(n): 15, 16, 18, Zeilen: 15: letzter Satz; 16: 1ff; 18: 1ff
[In Abhängigkeit vom jeweiligen Superantigen und der Frequenz von „passenden“ variablen Rezeptorsegmenten führt diese Interaktion zur initialen Proliferation von bis zu 25% des individuellen T-Zellrepertoires, während die] Reaktionshäufigkeit bei der normalen Antigenpräsentation unter 0,1% der Zellen liegt (IRWIN & GASCOIGNE 1993).

Die Konsequenzen dieser Art von Interaktion sind vielfältig. Auf der Seite der T Zellen kann dies zu polyklonaler Proliferation, zur Induktion von Apoptose und/oder Anergie der Zellen führen (HERMAN et al. 1991; HUANG & CRISPE 1993). Ähnliche Beobachtungen konnten auch bei Superantigen-präsentierenden Zellen (MHC-Klasse-II-positiven Makrophagen und deren Varianten; B-Zellen) gemacht werden (AOUDJIT et al. 1995): Auch diese Zellen können nach Superantigenkontakt aktiviert oder getötet werden.

2.11.1 Bindungsmechanismen an Immunzellen

Bindung an MHC-Klasse-II-Moleküle

Die Bindung an MHC-Klasse-II-Moleküle ist unabdingbar für Superantigen-induzierte zelluläre Reaktionen. Untersuchungen mit Staphylokokken-Superantigenen konnten die direkte Bindung an Regionen des Klasse-II-Moleküls außerhalb der Antigenbindungsstelle demonstrieren (DELLABONA et al. 1990). Im Gegensatz zu konventionellen Antigenen müssen Superantigene nicht erst prozessiert werden, um über MHC-Klasse-II-Moleküle den T-Zellen präsentiert werden zu können (FLEISCHER & SCHREZENMEIER 1988). Die Bindung der Superantigene an Regionen außerhalb der Antigenbindungsstelle ermöglicht zudem ein breites Spektrum an Bindungsspezifität für verschiedene allele Formen von MHC-Klasse- II-Molekülen, da sich die polymorphen Sequenzen der MHC-Klasse-II-Allele vorwiegend im Bereich der Antigenbindungsgrube finden. In Abhängigkeit von der Art des Toxins werden unterschiedliche Bindungsstellen besetzt. Während z.B. SEA und SEE zwei unterschiedliche Bindungsstellen auf dem Klasse-II-Molekül aufweisen, existiert für SEB und TSST-1 nur je eine Stelle, die im ersten Fall auf eine Domäne der α-Kette beschränkt ist, sich im zweiten Fall jedoch über beide Ketten des MHC-Klasse-II-Moleküls erstreckt. Verschiedene Superantigene unterscheiden sich zudem in ihrer Affinität, an MHC-Klasse-II-Moleküle zu binden (CHINTAGUMPALA et al. 1991; LABRECQUE et al.1993).

In Abhängigkeit vom jeweiligen Superantigen und der Frequenz von „passenden“ variablen Rezeptorsegmenten führt diese Interaktion zur initialen Proliferation von bis zu 25% des individuellen T-Zellrepertoires, während die Reaktionshäufigkeit bei der normalen Antigenpräsentation unter 0,1% der Zellen liegt (IRWIN & GASCOIGNE 1993).

[Seite 16:]

Die Konsequenzen dieser Art von Interaktion sind vielfältig. Auf der Seite der T-Zellen kann dies zu polyklonaler Proliferation, zur Induktion von Apoptose und/oder Anergie der Zellen führen (HERMAN et al. 1991, HUANG & CRISPE 1993). Ähnliche Beobachtungen konnten auch bei Superantigen-präsentierenden Zellen (MHC-Klasse-II-positiven Makrophagen und deren Varianten; B-Zellen) gemacht werden (AOUDJIT et al. 1995): Auch diese Zellen können nach Superantigenkontakt aktiviert oder getötet werden.

[Seite 18:]

2.1.2 Bindungsmechanismen an Immunzellen

Bindung an MHC-Klasse-II-Moleküle

Die Bindung an MHC-Klasse-II-Moleküle ist unabdingbar für Superantigen-induzierte zelluläre Reaktionen. Untersuchungen mit Staphylokokken-Superantigenen konnten die direkte Bindung an Regionen des Klasse-II-Moleküls außerhalb der Antigenbindungsstelle demonstrieren (DELLABONA et al. 1990). Im Gegensatz zu konventionellen Antigenen müssen Superantigene nicht erst prozessiert werden, um über MHC-Klasse- II-Moleküle den T-Zellen präsentiert werden zu können (FLEISCHER & SCHREZENMEIER 1988). Die Bindung der Superantigene an Regionen außerhalb der Antigenbindungsstelle ermöglicht zudem ein breites Spektrum an Bindungsspezifität für verschiedene allele Formen von MHC-Klasse-II-Molekülen, da sich die variablen Sequenzen der MHC-Klasse-II-Allele vorwiegend im Bereich der Antigenbindungsgrube finden.

In Abhängigkeit von der Art des Toxins werden unterschiedliche Bindungsstellen besetzt. Während z.B. SEA und SEE zwei unterschiedliche Bindungsstellen auf dem Klasse-II-Molekül aufweisen, existiert für SEB und TSST-1 nur je eine Stelle, die im ersten Fall auf eine Domäne der α-Kette beschränkt ist, sich im zweiten Fall jedoch über beide Ketten des MHC-Klasse-II-Moleküls erstreckt. Verschiedene Superantigene unterscheiden sich zudem in ihrer Affinität, an MHC-Klasse-II-Moleküle zu binden (CHINTAGUMPALA et al. 1991, LABREQUE et al. 1993).

Anmerkungen

Kein Hinweis auf die Quelle. Referenzen werden mitübernommen.

Sichter
(SleepyHollow02), Hindemith

[28.] Ad/Fragment 042 01 - Diskussion
Bearbeitet: 7. July 2014, 21:30 Hindemith
Erstellt: 7. July 2014, 20:54 (SleepyHollow02)
Ad, Fragment, Gesichtet, KomplettPlagiat, Krueger 2001, SMWFragment, Schutzlevel sysop

Typus
KomplettPlagiat
Bearbeiter
SleepyHollow02
Gesichtet
Yes.png
Untersuchte Arbeit:
Seite: 42, Zeilen: 1 ff. (komplett)
Quelle: Krueger 2001
Seite(n): 18, 19, Zeilen: 18: 21 ff.; 19: 1 ff.
Bindung an den T-Zellrezeptor

Strukturell liegen der Antigenspezifität eines αβ T-Zellrezeptors drei hypervariable Regionen innerhalb der variablen Elemente von α- und β-Kette zugrunde. Superantigene binden außerhalb der Antigenbindungsstelle an allotypische Sequenzen der β-Kette (Vβ-Regionen). Damit überwinden Superantigene die Antigenspezifität der verschiedenen T-Zellrezeptoren, indem sie an eine exponierte und nicht direkt an der Antigenerkennung beteiligte Stelle im variablen Bereich der β-Kette des Rezeptors binden.

2.11.2 Konsequenzen der Superantigenbindung

Im physiologischen Fall werden durch konventionelle Antigene zwischen 0,001% und 0,01% der T-Zellen aktiviert. Superantigene hingegen stimulieren bis zu 25% aller T-Zellen (HERMAN et al. 1991). Die Frequenz Superantigen-reaktiver T-Zellen hängt von der Vβ- Spezifität des jeweiligen Superantigens und von dessen Konzentration ab (FLEISCHER et al. 1991; MOLLICK et al. 1991; IRWIN & GASCOIGNE 1993; SCHUBERTH 1997). Die in vivo Wirkungen von Superantigenen wurden im wesentlichen anhand von Injektionen unterschiedlicher Dosen von Superantigenen- in Mäusen untersucht. Dabei stellte die Modulation bestimmter Zelloberflächenantigene, wie L-Selektin, IL-2- und Transferrin- Rezeptoren, die zuerst erkennbare Veränderung der reaktiven T-Zellfraktion dar (MIETHKE et al. 1993).

Die Aktivierung führt in vivo und in vitro zunächst zu einer Expansion reaktiver T Zellen. Aktivierte T-Zellen können anergisch werden (Reaktionslosigkeit nach erneutem Antigenkontakt) oder eliminiert werden (Induktion von Apoptose) (HERMAN et al. 1991; HUANG & CRISPE 1993). Eine polyklonale Aktivierung vieler Vβ-reaktiver T Zellen durch Superantigene führt unter Umständen zur Expansion autoreaktiver T Zellklone. Ein begrenztes Vβ-Spektrum autoreaktiver T-Zellen bzw. eine selektive Expansion bestimmter T-Zellen wurde in der Tat bei einigen Autoaggressionserkrankungen (z.B. der Rheumatoiden Arthritis und dem Typ I Diabetes mellitus) beobachtet (CONARD et al. 1994, GORONZY et al. 1994). Dies läßt die Beteiligung von Superantigenen in der Pathogenese solcher Erkrankungen zumindest nicht unwahrscheinlich erscheinen.

Bindung an den T-Zellrezeptor

Strukturell liegen der Antigenspezifität eines αβT-Zellrezeptors drei hypervariable Regionen innerhalb der variablen Elemente von α- und β-Kette zugrunde. Superantigene binden außerhalb der Antigenbindungsstelle an polymorphe Sequenzen der β-Kette (Vβ-Regionen). Damit überwinden Superantigene die Antigenspezifität der verschiedenen T-Zellrezeptoren, indem sie an eine exponierte und nicht direkt an der Antigenerkennung beteiligte Stelle im variablen Bereich der β-Kette des Rezeptors binden.

[Seite 19:]

2.1.3 Konsequenzen der Superantigenbindung an MHC-Klasse-II-Moleküle und den T-Zellrezeptor

Im physiologischen Fall werden durch konventionelle Antigene zwischen 0,001% und 0,01% der T-Zellen aktiviert. Superantigene hingegen stimulieren bis zu 25% aller T-Zellen (HERMAN et al. 1991). Die Frequenz Superantigen-reaktiver T-Zellen hängt von der Vβ-Spezifität des jeweiligen Superantigens und von dessen Konzentration ab (FLEISCHER et al. 1991, MOLLICK et al. 1991, IRWIN & GASCOIGNE 1993, SCHUBERTH 1997). Die in vivo Wirkungen von Superantigenen wurden im wesentlichen - anhand von Injektionen unterschiedlicher Dosen von Superantigenen - in Mäusen untersucht. Dabei stellte die Modulation bestimmter Zelloberflächenantigene, wie L-Selektin, IL-2- und Transferrin-Rezeptoren, die zuerst erkennbare Veränderung der reaktiven T-Zellfraktion dar (MIETHKE et al. 1993).

Die Aktivierung führt in vivo und in vitro zunächst zu einer Expansion reaktiver T-Zellen. Aktivierte T-Zellen können anergisch werden (Reaktionslosigkeit nach erneutem Antigenkontakt) oder eliminiert werden (Induktion von Apoptose) (HERMAN et al. 1991, HUANG & CRISPE 1993). Eine polyklonale Aktivierung vieler Vβ-reaktiver T-Zellen durch Superantigene führt unter Umständen zur Expansion autoreaktiver T-Zellklone. Ein begrenztes Vβ-Spektrum autoreaktiver T-Zellen bzw. eine selektive Expansion bestimmter T-Zellen wurde in der Tat bei einigen Autoaggressionserkrankungen (z.B. der Rheumatoiden Arthritis und dem Typ I Diabetes mellitus) beobachtet (CONARD et al. 1994, GORONZY et al. 1994). Dies läßt die Beteiligung von Superantigenen in der Pathogenese solcher Erkrankungen zumindest nicht unwahrscheinlich erscheinen.

Anmerkungen

Kein Hinweis auf die Quelle. Referenzen werden mitübernommen.

Sichter
(SleepyHollow02), Hindemith

[29.] Ad/Fragment 043 01 - Diskussion
Bearbeitet: 7. July 2014, 21:57 Hindemith
Erstellt: 7. July 2014, 20:59 (SleepyHollow02)
Ad, Fragment, Gesichtet, KomplettPlagiat, Krueger 2001, SMWFragment, Schutzlevel sysop

Typus
KomplettPlagiat
Bearbeiter
SleepyHollow02
Gesichtet
Yes.png
Untersuchte Arbeit:
Seite: 43, Zeilen: 1 ff. (komplett)
Quelle: Krueger 2001
Seite(n): 19 f., Zeilen: 19: letzter Absatz; 20: 1 ff.
In Folge der T-Zellaktivierung kommt es zur Produktion und Freisetzung einer Reihe von Zytokinen, die wiederum kaskadenartig zur Aktiverung und Ausdifferenzierung funktionell unterschiedlicher Zellsubpopulationen beitragen. So können bspw. zytotoxische T-Zellen ausdifferenzieren, die in der Lage sind, MHC-Klasse-II-positive Zielzellen in Anwesenheit von Superantigenen zu töten. Diese sehr potente Superantigen-abhängige zelluläre Zytotoxizität (SDCC) wird von einem großen Teil CD4+ und CD8+ T-Zellen ausgeübt. Die bereits von ruhenden T-Zellen ausgeführte Zytotoxizität, läßt sich durch Vorinkubation mit Superantigenen noch potenzieren und erstreckt sich u.a. auch auf autologe B-Zellen, Monozyten und aktivierte MHC-Klasse-II-positive T Lymphozyten (HEDLUND et al. 1990). Bei B-Lymphozyten kann die durch Superantigen-vermittelte Interaktion mit T-Zellen zu Proliferation und Differenzierung in Immunglobulin-sezernierende Zellen, aber auch zum Tod führen (MOURAD et al. 1989). HENDRICKS. (1998) fand diese dichotome Reaktionsweise ebenfalls bei bovinen B-Zellen; entscheidend für das Schicksal der B-Zellen war dabei die eingesetzte Konzentration der Superantigene, wobei interessanterweise keine lineare Dosisabhängigkeit bestand.

Die Zytokin-induzierende Potenz verschiedener Superantigene, sowie das Spektrum induzierter Zytokine in vivo und in vitro, wurde von verschiedener Seite für Mensch und Maus gezeigt. Allerdings sind die Berichte schwer vergleichbar und kaum zu generalisieren. Zum Teil wurden die Daten nach systemischer Verabreichung von Superantigenen in vivo gewonnen (BETTE et al. 1993; LITTON et al. 1994) oder die Daten beziehen sich selektiv auf einzelne Antigen-präsentierende Zellen (PALKAMA & HURME 1993; CHAPES et al. 1994) oder T-Zellen (KRISTENSSON et al. 1992; DAMLE et al. 1993; LAGOO et al. 1994). Bei menschlichen Monozyten können Superantigene z.B. die Funktion von LFA-1 (MOURAD et al. 1990) sowie die Produktion verschiedener Monokine, z.B. IL-1β und TNF-α (TREDE et al. 1991) heraufregulieren. Für das Rind gibt es Berichte über die Induktion von IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, IFN-γ und TNF-α in Superantigen-stimulierten monoukleären Zellen des Blutes (YOKOMIZO et al. 1995; SCHUBERTH 1997). In anderen Untersuchungen konnte als Folge der Bindung von Superantigenen an MHC-Klasse-II-Moleküle die Synthese von Stickstoffmonoxid (FAST et al. 1991; CUNHA et al. 1993; HAUSCHILDT et al. 1993; HENDRICKS (1998)) ebenso wie die Induktion Cyclooxigenase-abhängiger Arachidonsäure- Metaboliten wie PGE2 (MEHINDATE et al. 1995), HENDRICKS. (1998) demonstriert werden.

In Folge der T-Zellaktivierung kommt es zur Produktion und Freisetzung einer Reihe

von Zytokinen, die wiederum kaskadenartig zur Aktiverung und Ausdifferenzierung funktionell unterschiedlicher Zellsubpopulationen beitragen. So können bspw. zytotoxische T-Zellen ausdifferenzieren, die in der Lage sind, MHC-Klasse-II-positive Zielzellen in Anwesenheit von Superantigenen zu töten. Diese sehr potente Superantigen-abhängige zelluläre Zytotoxizität (SDCC) wird von einem großen Teil CD4+ und CD8+ T-Zellen ausgeübt. Die bereits von ruhenden T-Zellen ausgeführte Zytotoxizität, läßt sich durch Vorinkubation mit Superantigenen noch potenzieren und erstreckt sich u.a. auch auf autologe B-Zellen, Monozyten und aktivierte MHC-Klasse- II-positive T-Lymphozyten (HEDLUND et al. 1990).

[Seite 20:]

Bei B-Lymphozyten kann die durch Superantigen-vermittelte Interaktion mit T-Zellen zu Proliferation und Differenzierung in Immunglobulin-sezernierende Zellen, aber auch zum Tod führen (MOURAD et al. 1989). HENDRICKS (1998) fand diese dichotome Reaktionsweise ebenfalls bei bovinen B-Zellen; entscheidend für das Schicksal der B-Zellen war dabei die eingesetzte Konzentration der Superantigene, wobei interessanterweise keine lineare Dosisabhängigkeit bestand.

Die Zytokin-induzierende Potenz verschiedener Superantigene, sowie das Spektrum induzierter Zytokine in vivo und in vitro, wurde von verschiedener Seite für Mensch und Maus gezeigt. Allerdings sind die Berichte schwer vergleichbar und kaum zu generalisieren. Zum Teil wurden die Daten nach systemischer Verabreichung von Superantigenen in vivo gewonnen (BETTE et al. 1993, LITTON et al. 1994) oder die Daten beziehen sich selektiv auf einzelne Antigen-präsentierende Zellen (PALKAMA & HURME 1993, CHAPES et al. 1994) oder T-Zellen (KRISTENSON et al. 1992, DAMLE et al. 1993, LAGOO et al. 1994).

Bei menschlichen Monozyten können Superantigene z.B. die Funktion von LFA-1 (MOURAD et al. 1990) sowie die Produktion verschiedener Monokine, z.B. IL-1β und TNF-α (TREDE et al. 1991) heraufregulieren. Für das Rind gibt es Berichte über die Induktion von IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, IFN-γ und TNF-α in Superantigen-stimulierten monoukleären Zellen des Blutes (YOKOMIZO et al. 1995, SCHUBERTH 1997). In anderen Untersuchungen konnte als Folge der Bindung von Superantigenen an MHC-Klasse- II-Moleküle die Synthese von Stickstoffmonoxid (FAST et al. 1991, CUNHA et al. 1993, HAUSCHILDT et al. 1993, HENDRICKS 1998) ebenso wie die Induktion Cyclooxigenase-abhängiger Arachidonsäure-Metaboliten wie PGE2 (MEHINDATE et al. 1995, HENDRICKS 1998) demonstriert werden.

Anmerkungen

Kein Hinweis auf die Quelle. Referenzen werden mitübernommen.

Sichter
(SleepyHollow02), Hindemith

[30.] Ad/Fragment 044 01 - Diskussion
Bearbeitet: 7. July 2014, 22:00 Hindemith
Erstellt: 7. July 2014, 21:02 (SleepyHollow02)
Ad, Fragment, Gesichtet, KomplettPlagiat, Krueger 2001, SMWFragment, Schutzlevel sysop

Typus
KomplettPlagiat
Bearbeiter
SleepyHollow02
Gesichtet
Yes.png
Untersuchte Arbeit:
Seite: 44, Zeilen: 1-8
Quelle: Krueger 2001
Seite(n): 20, Zeilen: letzter Absatz
Im Unterschied zu den immunologischen Konsequenzen von systemisch wirkenden Superantigenen, wurden die Effekte nach lokalem Kontakt mit Superantigenen bisher erst wenig untersucht. HERZ et al. (1999) studierten die Wirkung von inhaliertem SEB auf die Atemwegsschleimhaut von Mäusen. Niedrig dosiertes SEB provozierte einen Influx von Lymphozyten, eosinophilen und neutrophilen Granulozyten, sowie meßbare Konzentrationen von IL-4, aber nicht IFN-γ, in der bronchialen Lavageflüssigkeit. Diese Ergebnisse lassen u.a. vermuten, dass nach lokalem Kontakt der Mukosa mit Superantigenen eine entzündliche Immunantwort ausgelöst wird, die dem nicht-allergischen Asthma gleicht (HERZ et al. 1999). Im Unterschied zu den immunologischen Konsequenzen von systemisch wirkenden Superantigenen, wurden die Effekte nach lokalem Kontakt mit Superantigenen bisher erst wenig untersucht. HERZ et al. (1999) studierten die Wirkung von inhaliertem SEB auf die Atemwegsschleimhaut von Mäusen. Niedrig dosiertes SEB provozierte einen Influx von Lymphozyten, eosinophilen und neutrophilen Granulozyten, sowie meßbare Konzentrationen von IL-4, aber nicht IFN-γ, in der bronchialen Lavageflüssigkeit. Diese Ergebnisse lassen u.a. vermuten, daß nach lokalem Kontakt der Mukosa mit Superantigenen, eine entzündliche Immunantwort ausgelöst wird, die dem nicht-allergischen Asthma gleicht (HERZ et al. 1999).
Anmerkungen

Kein Hinweis auf die Quelle. Referenzen werden mitübernommen.

Sichter
(SleepyHollow02), Hindemith

[31.] Ad/Fragment 044 09 - Diskussion
Bearbeitet: 7. July 2014, 22:32 Hindemith
Erstellt: 7. July 2014, 20:21 (SleepyHollow02)
Ad, Fragment, Gesichtet, SMWFragment, Schutzlevel sysop, Verschleierung, Werner 2004

Typus
Verschleierung
Bearbeiter
SleepyHollow02
Gesichtet
Yes.png
Untersuchte Arbeit:
Seite: 44, Zeilen: 9-30
Quelle: Werner 2004
Seite(n): 9, Zeilen: 1 ff.
2.12 Nekrose

Im Gegensatz zur Apoptose ist der Vorgang der Nekrose durch ein Anschwellen der Zelle charakterisiert. Dies führt zur Zerstörung der Plasmamembran und zur Freisetzung des zytoplasmatischen Inhalts in den interzellulären Raum. Eine inflammatorische Reaktion mit einhergehenden Gewebeschädigungen ist die Folge. Die Zellorganellen schwellen ebenfalls an und platzen anschließend, während der Zellkern meistens intakt bleibt (SCHWEICHEL & MERKER 1973). Hauptsächlich tritt Nekrose in den Geweben entweder in Fällen von akutem Sauerstoff- oder Nährstoffentzug oder in Folge von extremer physiologischer Schädigung durch Hitze, Detergenzien oder Radioaktivität auf. Neueste Studien zeigen dagegen, dass der nekrotische Zelltod ebenfalls sowohl während der normalen Physiologie der Zelle als auch während der Entwicklung eines Organismus erscheint (KITANAKA & KUCHINO 1999; CHAUTAN et al. 1999). Unter einigen pathologischen Umständen, wie z. B. bei einem Schlaganfall oder bei durch Zytokine und Toxine induzierter Leberschädigung kann der Zelltod in apoptotischer sowie in nekrotischer Form auftreten (BEILHARZ et al. 1995; CHARRIAUT-MARLANGUE et al. 1996; LEIST et al. 1996). Demzufolge wurde die Existenz eines nekrose-ähnlichen Zelltodsignalwegs angenommen, der durch ein eingebautes Todesprogramm reguliert wird und von der Apoptosemaschinerie unabhängig ist (KITANAKA u. KUCHINO, 1999). Obwohl erste in vitro-Modelle für einen nekrotischen Zelltod ohne Capasenaktivität beschrieben sind, blieb der molekulare Mechanismus der nekrotischen Form des Zelltods in seiner Gesamtheit weitestgehend unverstanden (DAUGAS et al. 2000; SARIN et al. 1997; TRAPANI et al. 1998; HEIBEIN et al. 1999; WOODLE 1997).

1.4 Nekrose

Im Gegensatz zur Apoptose ist der Vorgang der Nekrose durch ein Anschwellen der Zelle charakterisiert. Dies führt zur Zerstörung der Plasmamembran und zur Freisetzung des zytoplasmatischen Inhalts in den interzellulären Raum. Eine inflammatorische Reaktion mit einhergehenden Gewebeschädigungen ist die Folge. Die Zellorganellen schwellen ebenfalls an und platzen anschließend, während der Zellkern meistens intakt bleibt (Schweichel und Merker, 1973). Hauptsächlich tritt Nekrose in den Geweben entweder in Fällen von akutem Sauerstoff- oder Nährstoffentzug oder in Folge von extremer physiologischer Schädigung durch Hitze, Detergenzien oder Radioaktivität auf. Neueste Studien zeigen dagegen, dass der nekrotische Zelltod ebenfalls sowohl während der normalen Physiologie der Zelle als auch während der Entwicklung eines Organismus erscheint. (Kitanaka und Kuchino, 1999; Chautan et al., 1999). Unter einigen pathologischen Umständen, wie z. B. bei einem Schlaganfall) oder bei durch Zytokine und Toxine induzierter Leberschädigung kann der Zelltod in apoptotischer sowie in nekrotischer Form auftreten (Beilharz et al., 1995; Charriaut-Marlangue et al., 1996; Leist et al., 1996). Demzufolge wurde die Existenz eines nekrose-ähnlichen Zelltodsignalwegs angenommen, der durch ein eingebautes Todesprogramm reguliert wird und von der Apoptosemaschinerie unabhängig ist (Kitanaka und Kuchino, 1999). Obwohl erste in vitro Modelle für einen nekrotischen Zelltod ohne Capasenaktivität beschrieben sind, blieb der molekulare Mechanismus der nekrotischen Form des Zelltods in seiner Gesamtheit weitestgehend unverstanden (Daugas et al., 2000; Sarin et al., 1997; Trapani et al., 1998; Heibein et al., 1999; Woodle et al., 1997; Deas et al., 1998; Johnson et al., 1998; Vercammen et al., 1998).

Anmerkungen

Kein Hinweis auf die Quelle. Referenzen werden mitübernommen.

Sichter
(SleepyHollow02), Hindemith

[32.] Ad/Fragment 045 01 - Diskussion
Bearbeitet: 7. July 2014, 22:02 Hindemith
Erstellt: 7. July 2014, 21:06 (SleepyHollow02)
Ad, Fragment, Gesichtet, Krueger 2001, SMWFragment, Schutzlevel sysop, Verschleierung

Typus
Verschleierung
Bearbeiter
SleepyHollow02
Gesichtet
Yes.png
Untersuchte Arbeit:
Seite: 45, Zeilen: 1 ff. (komplett)
Quelle: Krueger 2001
Seite(n): 30, Zeilen: 1 ff.
2.13 Apoptose

Der Begriff Apoptose kommt aus dem Griechischen und beschreibt eine Blume, die ihre Blütenblätter verliert oder einen Baum, der seine Blätter abwirft. Dies gleicht dem Abschnüren von Membranvesikeln, was bei einer besonderen Form des Zelltodes auftritt; deshalb wurde der Begriff Apoptose für diese Art des Todes übernommen. Apoptose oder auch programmierter Zelltod ist ein Vorgang, der physiologischerweise im Körper vorkommt. JACOBSON et al. (1997) teilen die Aufgaben der Apoptose in fünf Gruppen ein: Erstens das Formen von Gewebsstrukturen, zweitens das Zerstören von nicht benötigten Gewebsstrukturen, drittens die Kontrolle der Zellzahl, viertens die Elimination von nicht normalen, nicht funktionierenden oder potentiell schädlichen Zellen bzw. von Zellen, die am falschen Ort sind und fünftens die Produktion von differenzierten Zellen ohne Organellen (z.B. Keratinozyten, Linsenepithel). Als Beispiel für die vierte Funktion kann die Kontrolle sich entwickelnder T- und B-Lymphozyten dienen, von denen die potentiell gefährlichen (autoreaktiven) eliminiert werden müssen (JACOBSON et al. 1997).

Die Apoptose ist ein fein regulierter, komplizierter Mechanismus, was auf die große Bedeutung dieses Prozesses für den Organismus schließen läßt. Im Rahmen der Apoptose wird -im Gegensatz zur Nekrose- kein Inhalt der sterbenden Zelle freigesetzt, was z.B. bei der Elimination von im Gewebe befindlichen Neutrophilen sehr wichtig ist, damit es durch die Vielzahl der in ihnen enthaltenden Enzyme nicht zu einer unnötigen Schädigung des umliegenden Gewebes kommt (COHEN 1993).

Der Zelltod ist ein wichtiger Bestandteil in der Entwicklung von Lebewesen. Er tritt in vielen sich entwickelnden Geweben von Invertebraten und Vertebraten auf (Übersicht bei: GLUCKSMANN 1951; CLARKE & CLARKE 1996). Der Begriff „programmierter Zelltod“ wurde zunächst benutzt, um einen Zelltod zu beschreiben, der an vorhersagbaren Orten und zu vorhersagbaren Zeiten während der Entwicklung auftrat, um zu verdeutlichen, daß der Tod zum programmierten Entwicklungsplan von Organismen gehört (LOCKSHIN & WILLIAMS 1964). Es war ebenfalls bekannt, daß ein Teil dieser Zelltode durch von anderen Geweben produzierte Substanzen verhindert werden kann. Daraus kann man schließen, daß der Tod nicht unabdingbar ist und durch Signale von anderen Zellen unterdrückt werden kann (SAUNDERS 1996).

2.4 Apoptose

Der Begriff Apoptose kommt aus dem Griechischen und beschreibt eine Blume, die ihre Blütenblätter verliert oder einen Baum, der seine Blätter abwirft. Dies gleicht dem Abschnüren von Membranvesikeln, was bei einer besonderen Form des Zelltodes auftritt; deshalb wurde der Begriff Apoptose für diese Art des Todes übernommen. Apoptose oder auch programmierter Zelltod ist ein Vorgang, der physiologischerweise im Körper vorkommt.

JACOBSON et al. (1997) teilen die Aufgaben der Apoptose in fünf Gruppen ein: Erstens das Formen von Gewebsstrukturen, zweitens das Zerstören von nicht benötigten Gewebsstrukturen, drittens die Kontrolle der Zellzahl, viertens die Elimination von nicht normalen, nicht funktionierenden oder potentiell schädlichen Zellen bzw. von Zellen, die am falschen Ort sind und fünftens die Produktion von differenzierten Zellen ohne Organellen (z.B. Kerationzyten, Linsenepithel). Als Beispiel für die vierte Funktion kann die Kontrolle sich entwickelnder T- und B-Lymphozyten dienen, von denen die potentiell gefährlichen (autoreaktiven) eliminiert werden müssen (JACOBSON et al. 1997).

Die Apoptose ist ein fein regulierter, komplizierter Mechanismus, was auf die große Bedeutung dieses Prozesses für den Organismus schließen läßt. Im Rahmen der Apoptose wird - im Gegensatz zur Nekrose - kein Inhalt der sterbenden Zelle freigesetzt, was z.B. bei der Elimination von im Gewebe befindlichen Neutrophilen sehr wichtig ist, damit es durch die Vielzahl der in ihnen enthaltenden Enzyme nicht zu einer unnötigen Schädigung des umliegenden Gewebes kommt (COHEN 1993) (s. 2.3.2).

Der Zelltod ist ein wichtiger Bestandteil in der Entwicklung von Lebewesen. Er tritt in vielen sich entwickelnden Geweben von Invertebraten und Vertebraten auf (Übersicht bei: GLUCKSMANN 1951, CLARKE & CLARKE 1996). Der Begriff „programmierter Zelltod“ wurde zunächst benutzt, um einen Zelltod zu beschreiben, der an vorhersagbaren Orten und zu vorhersagbaren Zeiten während der Entwicklung auftrat, um zu verdeutlichen, daß der Tod zum programmierten Entwicklungsplan von Organismen gehört (LOCKSHIN & WILLIAMS 1964). Es war ebenfalls bekannt, daß ein Teil dieser Zelltode durch von anderen Geweben produzierte Substanzen verhindert werden kann. Daraus kann man schließen, daß der Tod nicht unabdingbar ist und durch Signale von anderen Zellen unterdrückt werden kann (Übersicht bei: SAUNDERS 1966).

Anmerkungen

Kein Hinweis auf die Quelle. Seitenidentisch.

Sichter
(SleepyHollow02), Hindemith

[33.] Ad/Fragment 046 01 - Diskussion
Bearbeitet: 10. July 2014, 14:19 Schumann
Erstellt: 7. July 2014, 21:07 (SleepyHollow02)
Ad, Fragment, Gesichtet, KomplettPlagiat, Krueger 2001, SMWFragment, Schutzlevel sysop

Typus
KomplettPlagiat
Bearbeiter
SleepyHollow02
Gesichtet
Yes.png
Untersuchte Arbeit:
Seite: 46, Zeilen: 1 ff. (komplett)
Quelle: Krueger 2001
Seite(n): 31, Zeilen: 1 ff.
Wenn Zellen während der normalen Entwicklung, der Gewebehomöostase oder in der Peripherie von akuten Läsionen sterben, verkleinern sie sich, kondensieren, und die Organellen und die Plasmamembranen behalten ihre Integrität. Diesen Prozeß betitelten (KERR et al. 1974) als Apoptose. Die toten Zellen oder ihre Fragmente werden schnell von residenten Makrophagen phagozytiert, bevor Zellinhalte austreten können. Damit werden Entzündungsreaktionen vermieden. Auf Grund der Tatsache, daß die Morphologie apoptotischer Zellen in allen Geweben und bei allen Tieren sehr ähnlich ist, behaupteten KERR et al. (1974), daß dieser Tod das Spiegelbild eines aktiven, intra-zellulären Todesprogramms sei, das durch eine Vielzahl physiologischer oder pathologischer Stimuli induziert oder verhindert werden kann. Heutzutage ist mit dem Begriff Apoptose jeder Zelltod gemeint, der durch ein intrazelluläres „Todesprogramm“ vermittelt wird, unabhängig davon, wodurch der Tod induziert wird und ob alle charakteristischen Anzeichen der Apoptose gezeigt werden (JACOBSON et al. 1997). Eine Zelle, die dem programmierten Zelltod anheim fällt, wird so schnell entfernt (häufig in einer Stunde oder weniger), daß sogar bei hohen Sterberaten nur wenige tote Zellen zu sehen sind (JACOBSON et al. 1997). Der programmierte Zelltod kann in allen kernhaltigen Zellen ablaufen, beginnend mit der Zygote (WEIL et al. 1996).

Durch genetische Studien, besonders in dem Nematoden Caenorhabditis elegans, kam es zur Identifizierung von Genen, die dem Todesprogramm und seiner Kontrolle gewidmet sind (HORWITZ et al. 1982; ELLIS & HORWITZ 1986), später auch zu der Erkenntnis, daß einige dieser Gene homolog zu denen von Säugetieren sind (YUAN et al. 1993). Das zuerst identifizierte, sog. ced-3 Gen, kodiert für eine Cystein-Protease, die homolog zu dem Interleukin-1β-converting enzyme (ICE) ist (YUAN et al. 1993). Das ICE ist eine Cystein- Protease bei Säugetieren, die aus Vorstufen das proinflammatorische Zytokin IL-1□ [sic] produziert wird. Inzwischen sind mehrere dieser Proteasen identifiziert, und sie werden auf Grund ihrer Spaltungsstelle heute einheitlich als Caspasen bezeichnet. Da spezifische Proteine oder Caspase-Inhibitoren die Apoptose verhindern können, scheint klar zu sein, dass Caspasen der zentrale Teil des Todesprogramms sind, obwohl einige von ihnen, so wie der Prototyp dieser Familie, IL-1β-converting enzyme (ICE), auch noch andere Funktionen wahrnehmen (JACOBSON et al. 1997).


KERR JFR, HARMON B, SEARLE J. (1974) : An electron-microscope study of cell deletion in the anuran tadpole tail during spontaneous metamorphosis with special reference to apoptosis of striated muscle fibers. J. Cell: Sci. ,14, 571-585

KERR JFR, WYLLIE AH & CURRIE AR. (1972) : Apoptosis: a basic biological phenomenon with wide-ranging implications in tissue kinetics. Br. J. Cancer ,24 , 239-257

[...]

Wenn Zellen während der normalen Entwicklung, der Gewebehomöostase oder in der Peripherie von akuten Läsionen sterben, verkleinern sie sich, kondensieren, und die Organellen und die Plasmamembranen behalten ihre Integrität. Diesen Prozeß betitelten KERR et al. (1972) als Apoptose. Die toten Zellen oder ihre Fragmente werden schnell von residenten Makrophagen phagozytiert, bevor Zellinhalte austreten können. Damit werden Entzündungsreaktionen vermieden. Auf Grund der Tatsache, daß die Morphologie apoptotischer Zellen in allen Geweben und bei allen Tieren sehr ähnlich ist, behaupteten KERR et al. (1972), daß dieser Tod das Spiegelbild eines aktiven, intra-zellulären Todesprogramms sei, das durch eine Vielzahl physiologischer oder pathologischer Stimuli induziert oder verhindert werden kann. Heutzutage ist mit dem Begriff Apoptose jeder Zelltod gemeint, der durch ein intrazelluläres „Todesprogramm“ vermittelt wird, unabhängig davon, wodurch der Tod induziert wird und ob alle charakteristischen Anzeichen der Apoptose gezeigt werden (JACOBSON et al. 1997). Eine Zelle, die dem programmierten Zelltod anheim fällt, wird so schnell entfernt (häufig in einer Stunde oder weniger), daß sogar bei hohen Sterberaten nur wenige tote Zellen zu sehen sind (JACOBSON et al. 1997). Der programmierte Zelltod kann in allen kernhaltigen Zellen ablaufen, beginnend mit der Zygote (WEIL et al. 1996).

Durch genetische Studien, besonders in dem Nematoden Caenorhabditis elegans, kam es zur Identifizierung von Genen, die dem Todesprogramm und seiner Kontrolle gewidmet sind (HORWITZ et al. 1982, ELLIS & HORWITZ 1986), später auch zu der Erkenntnis, daß einige dieser Gene homolog zu denen von Säugetieren sind (YUAN et al. 1993, HENGARTNER & HORWITZ 1994). Das zuerst identifizierte, sog. ced-3 Gen, kodiert für eine Cystein-Protease, die homolog zu dem Interleukin-1β-converting enzyme (ICE) ist (YUAN et al. 1993). Das ICE ist eine Cystein-Protease bei Säugetieren, die aus Vorstufen das proinflammatorische Zytokin IL-1β produziert wird. Inzwischen sind mehrere dieser Proteasen identifiziert, und sie werden auf Grund ihrer Spaltungsstelle heute einheitlich als Caspasen bezeichnet (s. 2.4.4). Da spezifische Proteine oder Caspase-Inhibitoren die Apoptose verhindern können, scheint klar zu sein, daß Caspasen der zentrale Teil des Todesprogramms sind, obwohl einige von ihnen, so wie der Prototyp dieser Familie, IL-1β-converting enzyme (ICE), auch noch andere Funktionen wahrnehmen (JACOBSON et al. 1997, s. 2.4.4).


KERR, J.F.R., A.H. WYLLIE & A.R. CURRIE (1972) Apoptosis: a basic biological phenomenon with wide-ranging implication in tissue kinetics Br. J. Cancer 26, 239-257

[...]

Anmerkungen

Seitenidentisch.

Die Referenz KERR et al. (1972) scheint hier die korrekte zu sein, da der Begriff "Apoptose" schon im Titel des Papers von 1972 auftaucht, bei Ad aber steht:

"Diesen Prozeß betitelten (KERR et al. 1974) als Apoptose."

Man beachte auch den Ausdruck "IL-1□" bei Ad. Hier könnte es sich um ein Artefact handeln, das beim Übernehmen von "IL-1β" via copy-paste entstanden ist.

Sichter
(SleepyHollow02), Hindemith

[34.] Ad/Fragment 047 02 - Diskussion
Bearbeitet: 7. July 2014, 22:36 Hindemith
Erstellt: 7. July 2014, 19:35 (SleepyHollow02)
Ad, Fragment, Gesichtet, KomplettPlagiat, SMWFragment, Schutzlevel sysop, Werner 2004

Typus
KomplettPlagiat
Bearbeiter
SleepyHollow02
Gesichtet
Yes.png
Untersuchte Arbeit:
Seite: 47, Zeilen: 2-32
Quelle: Werner 2004
Seite(n): 5, 6, Zeilen: 5: 1 ff.; 6: 1
2.13.1 Zellmorphologie und zeitliche Abfolge der Apoptose

In der ersten Phase der Apoptose verliert die Zelle zunächst den Kontakt zu ihren Nachbarzellen. Das Chromatin des Zellkerns wird stark verdichtet und zu diesem Zeitpunkt durch aktivierte Endonukleasen zuerst in große Fragmente von etwa 50 bis 300 kbp (Kilobasenpaaren) und anschließend in kleinere Fragmente bestehend aus Multimeren von ungefähr 180 bp internukleosomal gespalten. Die kleine Untereinheit des DNA Fragmentierungsfaktors DFF40 ist eine solche spezifische Nuklease, die nach gängiger Vorstellung inaktiv als Komplex mit ihrem Inhibitor, der anderen Untereinheit des DNA Fragmentierungsfaktors, im Zytosol vorliegt (LIU et al. 1997; ENARI et al. 1998; SUSIN et al. 1999; SAHARA et al. 1999; ZAMZAMI et al. 2000). Die Aktivierung der nukleolytischen Untereinheit erfolgt über die Abspaltung des Inhibitors durch eine Aspartat- spezifische Cystein-Protease, kurz Caspase genannt. Die übrigen Zellorganellen verbleiben zunächst überwiegend intakt.

Die zweite Phase der Apoptose ist gekennzeichnet durch eine Auffaltung der Zellmembran und die Separation zellulärer, insbesondere nukleärer Fragmente.

Am Schluss werden die verbliebenen Zellreste durch Phagozytose von Nachbarzellen oder Makrophagen aufgenommen und endgültig abgebaut. Der entscheidende Unterschied zur Nekrose besteht darin, dass die schrumpfende Zelle und die apoptotischen Körperchen von den Phagozyten an den Membranveränderungen, wie z. B. der Umlagerung von Phosphatidylserin von der Innen- auf die Außenseite der Plasmamembran erkannt und beseitigt werden, bevor die Integrität der Zellmembran endgültig verloren geht (REN & SAVILL 1998; FADOK et al. 2000). Dadurch wird eine inflammatorische Reaktion mit einer nachfolgenden Schädigung der Nachbarzellen und eine Aktivierung neutrophiler Granulozyten und Makrophagen vermieden. Die Zellfragmente werden dabei innerhalb von Vesikeln (Phagolysosomen) der phagozytierenden Zelle abgebaut. Um die Phagozytose zu erleichtern, reduzieren apoptotische Zellen ihr Volumen. Sie pumpen Ionen, vor allem K+ Cl- und organische Osmolyte, nach außen und kontrahieren ihr Zytoskelett (BORTNER & CIDLOWSKI 1999; HUG 2000).

Lange Zeit wurde das Ausbleiben einer Entzündungsreaktion als eines der wichtigen Charakteristika des apopotischen Prozesses angesehen. Einige Faktoren wie die Produktion der immunsuppressiven Zytokine Interleukin (IL)-10 und transformierender Wachstumsfaktor-β (transforming growth factor-beta, TGF-β) sprechen auch für diese [Theorie (RONCHETTI et al. 1999).]

In der ersten Phase der Apoptose verliert die Zelle zunächst den Kontakt zu ihren Nachbarzellen. Das Chromatin des Zellkerns wird stark verdichtet und zu diesem Zeitpunkt durch aktivierte Endonukleasen zuerst in große Fragmente von etwa 50 bis 300 kbp (Kilobasenpaaren) und anschließend in kleinere Fragmente bestehend aus Multimeren von ungefähr 180 bp internukleosomal gespalten. Die kleine Untereinheit des DNA Fragmentierungsfaktors DFF40 ist eine solche spezifische Nuklease, die nach gängiger Vorstellung inaktiv als Komplex mit ihrem Inhibitor, der anderen Untereinheit des DNA Fragmentierungsfaktors, im Zytosol vorliegt (Liu et al., 1997; Enari et al., 1998; Susin et al., 1999; Sahara et al., 1999; Zamzami und Kroemer, 1999). Die Aktivierung der nukleolytischen Untereinheit erfolgt über die Abspaltung des Inhibitors durch eine Aspartat-spezifische Cystein-Protease, kurz Caspase genannt. Die übrigen Zellorganellen verbleiben zunächst überwiegend intakt.

Die zweite Phase der Apoptose ist gekennzeichnet durch eine Auffaltung der Zellmembran und die Separation zellulärer, insbesondere nukleärer Fragmente. [...]

Am Schluss werden die verbliebenen Zellreste durch Phagozytose von Nachbarzellen oder Makrophagen aufgenommen und endgültig abgebaut. Der entscheidende Unterschied zur Nekrose besteht darin, dass die schrumpfende Zelle und die apoptotischen Körperchen von den Phagozyten an den Membranveränderungen, wie z. B. der Umlagerung von Phosphatidylserin von der Innen- auf die Außenseite der Plasmamembran erkannt und beseitigt werden, bevor die Integrität der Zellmembran endgültig verloren geht. (Savill, 1997 und 1998; Platt et al., 1998; Fadok et al., 1998; Ren und Savill, 1998; Fadok et al., 2000). Dadurch wird eine inflammatorische Reaktion mit einer nachfolgenden Schädigung der Nachbarzellen und eine Aktivierung neutrophiler Granulozyten und Makrophagen vermieden. Die Zellfragmente werden dabei innerhalb von Vesikeln (Phagolysosomen) der phagozytierenden Zelle abgebaut. Um die Phagozytose zu erleichtern, reduzieren apoptotische Zellen ihr Volumen. Sie pumpen Ionen, vor allem K+ Cl- und organische Osmolyte, nach außen und kontrahieren ihr Zytoskelett (Hughes et al., 1997; Bortner und Cidlowski, 1999; Übersicht von Hug, 2000).

Lange Zeit wurde das Ausbleiben einer Entzündungsreaktion als eines der wichtigen Charakteristika des apopotischen Prozesses angesehen. Einige Faktoren wie die Produktion der immunsuppressiven Zytokine Interleukin (IL)-10 und transformierender Wachstumsfaktor-β (transforming growth factor-beta, TGF-β) sprechen auch für diese

[Seite 6]

Theorie (Fadok et al., 1998; Ronchetti et al., 1999).

Anmerkungen

Kein Hinweis auf die Quelle. Referenzen werden mitübernommen. Seitenidentisch.

Sichter
(SleepyHollow02), Hindemith

[35.] Ad/Fragment 048 01 - Diskussion
Bearbeitet: 7. July 2014, 23:16 Hindemith
Erstellt: 7. July 2014, 19:40 (SleepyHollow02)
Ad, Fragment, Gesichtet, KomplettPlagiat, SMWFragment, Schutzlevel sysop, Werner 2004

Typus
KomplettPlagiat
Bearbeiter
SleepyHollow02
Gesichtet
Yes.png
Untersuchte Arbeit:
Seite: 48, Zeilen: 1 ff. (komplett)
Quelle: Werner 2004
Seite(n): 6, 7, Zeilen: 6: 7ff; 7: 1ff.
Je nach Stimulus lassen sich apoptotische Veränderungen bereits nach einigen Minuten oder erst nach Stunden nachweisen. Ob eine Apoptose eingeleitet wird, hängt nicht nur vom Zelltyp ab, sondern auch vom Differenzierungszustand, der Position im Zellzyklus oder der Genaktivierung. Es können sowohl chemische Substanzen wie Glukocorticoide, freie Radikale, Wasserstoffperoxid und Glutamat, wie auch physikalische Schädigungen, bedingt durch UV-Strahlen, Röntgenstrahlen, Gamma- und Beta-Strahlen sowie Hitzeschock, Apoptose einleiten.. Dazu kommen noch sogenannte Todesfaktoren, die Apoptose initiieren können, wie z. B. Fas Ligand (FasL), Tumor Nekrose Faktor (TNF) und der TNF-verwandte Apoptose-induzierende Faktor (TRAIL).

Nach der Bindung dieser Todesfaktoren an ihre entsprechenden Rezeptoren wird die Todesrezeptor-vermittelte Apoptose ausgelöst. Todesrezeptoren weisen eine C-terminale intrazelluläre Todesdomäne (DD) auf, welche als Protein-Protein-Interaktionsmotiv in verschiedenen Rezeptoren, wie z. B. TNF-R1 oder Fas, vorzufinden ist. Mittels der Todesdomäne werden Adapterproteine, die ebenfalls eine Todesdomäne enthalten, an den Rezeptor rekrutiert. Dazu gehören das Fas-assoziierte Protein mit Todesdomäne (FADD), das TNF-R1-assoziierte Protein mit Todesdomäne (TRADD) sowie das Rezeptor-interagierende Protein (RIP). Einige dieser Adapterproteine, wie z. B. FADD, besitzen zusätzlich eine weitere Portein-Protein-Interaktionsdomäne, die Todeseffektordomäne (DED), über die wiederum die Procaspase-8, die ebenfalls eine Todeseffektordomäne aufweist, rekrutiert und durch Autoprozessierung aktiviert wird. Die aktivierte Caspase-8 initiiert eine proapoptotische Signal-Kaskade durch nachfolgende Prozessierung der Effektor-Caspase-3, welche neben der Spaltung von Strukturproteinen auch die ebenfalls ausführenden Caspasen- 6 und -7 aktivieren kann. Durch zusätzliche Caspase-6-vermittelte Prozessierung der Caspase- 8 wird ein signalverstärkender Rückkopplungskreislauf eingeleitet. Diese Form der durch Caspasen vermittelten Apoptose wird entweder als Typ I-Apoptose oder als extrinsischer Signalweg zur Apoptose bezeichnet (SCAFFIDI et al. 1998). Im Vergleich dazu wird die Typ- II-Apoptose oder auch intrinsischer Signalweg zur Apoptose unter mitochondrialer Beteiligung initiiert. Auch hier wird durch die Oligomerisierung des Rezeptors Caspase-8 aktiviert. Im nächsten Schritt fragmentiert diese das zytosolische Protein BID, dessen carboxyterminales Spaltprodukt nach seiner Translokation zu den Mitochondrien die Freisetzung von Cytochrom C aus der inneren Mitochondrienmembran in das Zytoplasma vermittelt (LUO et al. 1998; LI et al. 1998). Cytochrom C bindet im Komplex mit dATP an Apaf-1 (Apoptotischer Protease-aktivierender Faktor-1), wodurch eine [Konformationsänderung bewirkt wird, so dass nachfolgend durch homophile Interaktionen der CARD-Domänen von Apaf-1 und Procaspase-9 diese aktiviert wird (LI et al. 1998).]


LI H, ZHU H, XU CJ & YUAN J. (1998) : Cleavage of BID by caspase 8 mediates the mitochondrial damage in the Fas pathway of apoptosis. Cell ,94, 491-501

LI P, NIJHAWAN D, BUDIHARDJO I, SRINIVASULA SM, AHMAD M, ALNEMRI ES & WANG X. (1997) : Cytochrome c and dATP-dependent formation of Apaf-1/caspase-9 complex initiates an apoptotic protease cascade. Cell ,91, 479-489

Je nach Stimulus lassen sich apoptotische Veränderungen bereits nach einigen Minuten oder erst nach Stunden nachweisen. Ob eine Apoptose eingeleitet wird, hängt nicht nur vom Zelltyp ab, sondern auch vom Differenzierungszustand, der Position im Zellzyklus oder der Genaktivierung. Es können sowohl chemische Substanzen wie Glukocorticoide, freie Radikale, Wasserstoffperoxid und Glutamat, wie auch physikalische Schädigungen, bedingt durch UV-Strahlen, Röntgenstrahlen, Gamma- und Beta-Strahlen sowie Hitzeschock, Apoptose einleiten. [...] Dazu kommen noch sogenannte Todesfaktoren, die Apoptose initiieren können, wie z. B. Fas Ligand (FasL), Tumor Nekrose Faktor (TNF) und der TNF-verwandte Apoptose-induzierende Faktor (TRAIL).

Nach der Bindung dieser Todesfaktoren an ihre entsprechenden Rezeptoren wird die Todesrezeptor-vermittelte Apoptose ausgelöst. Todesrezeptoren weisen eine C-terminale intrazelluläre Todesdomäne (DD) auf, welche als Protein-Protein-Interaktionsmotiv in verschiedenen Rezeptoren, wie z. B. TNF-R1 oder Fas, vorzufinden ist. Mittels der Todesdomäne werden Adapterproteine, die ebenfalls eine Todesdomäne enthalten, an den Rezeptor rekrutiert. Dazu gehören das Fas-assoziierte Protein mit Todesdomäne (FADD), das TNF-R1-assoziierte Protein mit Todesdomäne (TRADD) sowie das Rezeptor-interagierende Protein (RIP). Einige dieser Adapterproteine, wie z. B. FADD, besitzen zusätzlich eine weitere Portein-Protein-Interaktionsdomäne, die Todeseffektordomäne (DED), über die wiederum die Procaspase-8, die ebenfalls eine Todeseffektordomäne aufweist, rekrutiert und durch Autoprozessierung aktiviert wird. Die aktivierte Caspase-8 initiiert eine proapoptotische Signal-Kaskade durch nachfolgende Prozessierung der Effektor-Caspase-3, welche neben der Spaltung von Strukturproteinen auch die ebenfalls ausführenden Caspasen-6 und -7 aktivieren kann. Durch zusätzliche Caspase-6-vermittelte Prozessierung der Caspase-8 wird ein signalverstärkender Rückkopplungskreislauf eingeleitet. Diese Form der durch Caspasen vermittelten Apoptose wird entweder als Typ I-Apoptose oder als extrinsischer Signalweg zur Apoptose bezeichnet (Scaffidi et al., 1998). Im Vergleich dazu wird die Typ-

[Seite 7:]

II-Apoptose oder auch intrinsischer Signalweg zur Apoptose unter mitochondrialer Beteiligung initiiert. Auch hier wird durch die Oligomerisierung des Rezeptors Caspase-8 aktiviert. Im nächsten Schritt fragmentiert diese das zytosolische Protein BID, dessen carboxyterminales Spaltprodukt nach seiner Translokation zu den Mitochondrien die Freisetzung von Cytochrom C aus der inneren Mitochondrienmembran in das Zytoplasma vermittelt (Luo et al., 1998; Li et al., 1998). Cytochrom C bindet im Komplex mit dATP an Apaf-1 (Apoptotischer Protease-aktivierender faktor-1), wodurch eine Konformationsänderung bewirkt wird, so dass nachfolgend durch homophile Interaktionen der CARD-Domänen von Apaf-1 und Procaspase-9 diese aktiviert wird (Li et al., 1997).


Li H., Zhu H., Xu C.J., Yuan J. (1998) Cleavage of BID by caspase 8 mediates the mitochondrial damage in the Fas pathway of apoptosis. Cell 94:491-501

Li P., Nijhawan D., Budihardjo I., Srinivasula S.M., Ahmad M., Alnemri E.S., Wang X. (1997) Cytochrome c and dATP-dependent formation of Apaf-1/caspase-9 complex initiates an apoptotic protease cascade. Cell 91:479-489

Anmerkungen

Kein Hinweis auf die Quelle. Referenzen werden mitübernommen.

Man beachte, dass Li et al. (1997) zwar im Literaturverzeichnis von Ad angegeben ist, auf diese Publikation in der gesamten Dissertation aber nicht verwiesen wird, was den Schluss nahelegt, dass die Eigenleistung von Ad hier nicht zu einer Verbesserung des Textes beigetragen hat.

Sichter
(SleepyHollow02), Hindemith

[36.] Ad/Fragment 049 01 - Diskussion
Bearbeitet: 7. July 2014, 23:18 Hindemith
Erstellt: 7. July 2014, 20:01 (SleepyHollow02)
Ad, Fragment, Gesichtet, KomplettPlagiat, SMWFragment, Schutzlevel sysop, Werner 2004

Typus
KomplettPlagiat
Bearbeiter
SleepyHollow02
Gesichtet
Yes.png
Untersuchte Arbeit:
Seite: 49, Zeilen: 1 ff. (komplett)
Quelle: Werner 2004
Seite(n): 7, Zeilen: 7: 6 ff.; 8:
[Cytochrom C bindet im Komplex mit dATP an Apaf-1 (Apoptotischer Protease-aktivierender Faktor-1), wodurch eine] Konformationsänderung bewirkt wird, so dass nachfolgend durch homophile Interaktionen der CARD-Domänen von Apaf-1 und Procaspase-9 diese aktiviert wird (LI et al. 1998). Caspase-9 fungiert nun als Initiator-Caspase und prozessiert die Effektor-Caspase-3 und nachfolgend Caspase-6 und -7. Die Signalverstärkung innerhalb der Caspase-Kaskade wird bei diesem Apoptosetyp durch Caspase-7-vermittelte Caspase-9-Prozessierung und durch zusätzliche Aktivierung weiterer Caspase-8-Moleküle erreicht. Dieser Signalweg scheint in Zellen eine Rolle zu spielen, die z. B. durch einen geringen Gehalt an Pro-Caspase-8 die Effektorcaspasen nicht in ausreichendem Umfang direkt aktivieren können. Außerdem beinhaltet er die Grundlage für nicht Rezeptor-vermittelte Apoptoseprozesse, die beispielsweise durch Behandlung mit Chemotherapeutika induziert werden (Übersicht in LOS et al. 1999). Auf welche Weise der intrinsische Signalweg zur Apoptose durch derartige Chemotherapeutika ausgelöst wird, ist bisher nicht vollständig verstanden.

Die Hauptbestandteile des Apoptosenetzwerks stellen demnach die Caspasen dar. Diese Enzyme gehören der Familie der Aspartat-spezifischen Cystein-Proteasen an, da sie ihre Substrate nach einem Aspartatrest spalten und sich in dem aktiven Zentrum ein Cystein befindet (TALANIAN et al. 1997). Die Caspasen sind Komponenten der Signalkaskade und werden als Zymogene synthetisiert. Die Primärstruktur der inaktiven Procaspasen besteht aus einer N-terminalen Prodomäne sowie der großen, das aktive Zentrum (p20) und der kleinen (p10) Untereinheit. Die Procaspasen aktivieren sich gegenseitig in einer intrazellulären Caspase-Kaskade mittels Spaltung. Alternativ werden sie über die Wechselwirkung mit Adapterproteinen durch eine Nachbarschafts-induzierte Autoproteolyse aktiviert (THORNBERRY 1997). Durch proteolytische Spaltung werden die große und die kleine Untereinheit von der N-terminalen Prodomäne freigesetzt und setzen sich daraufhin zu einem aktiven Heterotetramer zusammen. Die so gebildete Caspase ist nun aktiv und kann weitere Procaspasen in der Signalkette aktivieren. Die Erkennungssequenzen für die gegenseitige Prozessierung der Caspasen und der Spaltung von Substratproteinen basiert auf einem Motiv von vier Aminosäuren, das jeweils spezifisch für die bestimmte Caspase ist und immer einen Aspartatrest an der vierten Position aufweist (THORNBERRY 1997; TALANIAN et al. 1997). Carboxyterminal dieses Aspartatrestes werden die Substrate dann fragmentiert. Die Funktionsweise der synthetischen Peptid-Inhibitoren (Ac-DEV-CHO oder zVAD-fmk) und der fluorogenen Substrate für die Aktivitätsmessung der Caspasen basiert ebenfalls auf dem Vorhandensein dieser Erkennungssequenzen. Man teilt die an der Apoptose beteiligten Caspasen in zwei Unterfamilien ein. Caspasen mit langen Pro-Domänen, wie z. B. Caspase-8 [und -9, sind meistens in der initialen Aktivierung der apoptotischen Kaskade involviert (Initiatorcaspasen), während Caspasen mit kurzen Prodomänen, wie z. B. Caspase-3, das Apoptoseprogramm zu Ende führen (Effektorcaspasen), indem sie zelluläre Substrate spalten.]

Cytochrom C bindet im Komplex mit dATP an Apaf-1 (Apoptotischer Protease-aktivierender faktor-1), wodurch eine Konformationsänderung bewirkt wird, so dass nachfolgend durch homophile Interaktionen der CARD-Domänen von Apaf-1 und Procaspase-9 diese aktiviert wird (Li et al., 1997). Caspase-9 fungiert nun als Initiator-Caspase und prozessiert die Effektor-Caspase-3 und nachfolgend Caspase-6 und -7. Die Signalverstärkung innerhalb der Caspase-Kaskade wird bei diesem Apoptosetyp durch Caspase-7-vermittelte Caspase-9-Prozessierung und durch zusätzliche Aktivierung weiterer Caspase-8-Moleküle erreicht. Dieser Signalweg scheint in Zellen eine Rolle zu spielen, die z. B. durch einen geringen Gehalt an Pro-Caspase-8 die Effektorcaspasen nicht in ausreichendem Umfang direkt aktivieren können. Außerdem beinhaltet er die Grundlage für nicht Rezeptor-vermittelte Apoptoseprozesse, die beispielsweise durch Behandlung mit Chemotherapeutika induziert werden (Übersicht in Los et al., 1999). Auf welche Weise der intrinsische Signalweg zur Apoptose durch derartige Chemotherapeutika ausgelöst wird, ist bisher nicht vollständig verstanden.

Die Hauptbestandteile des Apoptosenetzwerks stellen demnach die Caspasen dar. Diese Enzyme gehören der Familie der Aspartat-spezifischen Cystein-Proteasen an, da sie ihre Substrate nach einem Aspartatrest spalten und sich in dem aktiven Zentrum ein Cystein befindet (Talanian et al., 1997). Die Caspasen sind Komponenten der Signalkaskade und werden als Zymogene synthetisiert. Die Primärstruktur der inaktiven Procaspasen besteht aus einer N-terminalen Prodomäne sowie der großen, das aktive Zentrum enthaltenen (p20) und der kleinen (p10) Untereinheit. Die Procaspasen aktivieren sich gegenseitig in einer intrazellulären Caspase-Kaskade mittels Spaltung. Alternativ werden sie über die Wechselwirkung mit Adapterproteinen durch eine nachbarschafts-induzierte Autoproteolyse aktiviert (Thornberry N.A., 1997; Nicholson D.W. und Thornberry N.A., 1997). Durch proteolytische Spaltung werden die große und die kleine Untereinheit von der N-terminalen Prodomäne freigesetzt und setzen sich daraufhin zu einem aktiven Heterotetramer zusammen. Die so gebildete Caspase ist nun aktiv und kann weitere Procaspasen in der Signalkette aktivieren. Die Erkennungssequenzen für die gegenseitige Prozessierung der Caspasen und der Spaltung von Substratproteinen basiert auf einem Motiv von vier Aminosäuren, das

[Seite 8:]

jeweils spezifisch für die bestimmte Caspase ist und immer einen Aspartatrest an der vierten Position aufweist (Talanian et al., 1997; Thornberry et al., 1997). Carboxyterminal dieses Aspartatrestes werden die Substrate dann fragmentiert. Die Funktionsweise der synthetischen Peptid-Inhibitoren (Ac-DEV-CHO oder zVAD-fmk) und der fluorogenen Substrate für die Aktivitätsmessung der Caspasen basiert ebenfalls auf dem Vorhandensein dieser Erkennungssequenzen. Man teilt die an der Apoptose beteiligten Caspasen in zwei Unterfamilien ein. Caspasen mit langen Pro-Domänen, wie z. B. Caspase-8 und -9, sind meistens in der initialen Aktivierung der apoptotischen Kaskade involviert (Initiatorcaspasen), während Caspasen mit kurzen Prodomänen, wie z. B. Caspase-3, das Apoptoseprogramm zu Ende führen (Effektorcaspasen), indem sie zelluläre Substrate spalten.

Anmerkungen

Kein Hinweis auf die Quelle. Referenzen werden mit übernommen.

Sichter
(SleepyHollow02), Hindemith

[37.] Ad/Fragment 050 01 - Diskussion
Bearbeitet: 7. July 2014, 23:21 Hindemith
Erstellt: 7. July 2014, 20:07 (SleepyHollow02)
Ad, Fragment, Gesichtet, KomplettPlagiat, SMWFragment, Schutzlevel sysop, Werner 2004

Typus
KomplettPlagiat
Bearbeiter
SleepyHollow02
Gesichtet
Yes.png
Untersuchte Arbeit:
Seite: 50, Zeilen: 1 ff. (komplett)
Quelle: Werner 2004
Seite(n): 8, 9, 10, Zeilen: 8: 6 ff.; 9: 23ff, 10: 1 ff.
[Man teilt die an der Apoptose beteiligten Caspasen in zwei Unterfamilien ein. Caspasen mit langen Pro-Domänen, wie z. B. Caspase-8] und -9, sind meistens in der initialen Aktivierung der apoptotischen Kaskade involviert (Initiatorcaspasen), während Caspasen mit kurzen Prodomänen, wie z. B. Caspase-3, das Apoptoseprogramm zu Ende führen (Effektorcaspasen), indem sie zelluläre Substrate spalten. Die Spaltung dieser zellulären Substrate bestimmt das morphologische und biochemische Bild der Apoptose. Zu diesen Substraten gehören viele Proteine, unter anderem Proteine des Zellgerüsts wie Aktin und Plectin.

2.14 Der programmierte Zelltod und seine unterschiedlichen Formen

Der Begriff "programmierter Zelltod" verweist inzwischen auf jede Art von Zelltod, der durch ein intrazelluläres Todesprogramm ungeachtet von seinem Auslöser vermittelt wird. Die Morphologien können entweder Apoptose, Nekrose oder eine Mischung aus beiden Phänotypen sein (SCHWEICHEL & MERKER 1973). Mittlerweile existieren unterschiedliche Bezeichnungen für die verschiedenen Ausprägungen und Morphologien des Zelltods. Es kristallisieren sich jedoch vier Hauptgruppen heraus, in die man die beobachteten Zelltode einordnen kann (LEIST & JAATTELA 2001).

(i) Zunächst die klassische Apoptose mit den schon beschriebenen morphologischen und biochemischen Charakteristika, wie das Schrumpfen des Zytoplasmas, Chromatin- Kondensation, Abschnürung von apoptotischen Körperchen und die Exposition von Phophatidylserin (KERR et al. 1972). Wichtig ist zudem die Aktivierung der Caspasen im Rahmen der apoptotischen Zelltodmaschinerie, deren Inhibition zu einer Blockierung des Zelltods führt.

(ii) Daran schließt sich der Apoptose-ähnliche programmierte Zelltod (apoptosis-like programmed cell death) an. Die Chromatin-Kondensation ist hier weniger dicht als bei der klassischen Apoptose. Ebenfalls werden Phagozytose-erkennende Moleküle auf der Zellmembran gezeigt, bevor sich die apoptotischen Körperchen abschnüren. Andere apoptotische Merkmale unterscheiden sich in ihrer Ausprägung und Kombination von denen der klasssischen Apoptose, wobei nicht immer alle Hauptmerkmale zu beobachten sind. Die meisten beschriebenen Modelle der "Caspase-unabhängigen Apoptose" gehören in diese Klasse (BORNER & MONNEY 1999; KITANAKA & KUCHINO 1999; WOODLE et al. 1997).

Man teilt die an der Apoptose beteiligten Caspasen in zwei Unterfamilien ein. Caspasen mit langen Pro-Domänen, wie z. B. Caspase-8 und -9, sind meistens in der initialen Aktivierung der apoptotischen Kaskade involviert (Initiatorcaspasen), während Caspasen mit kurzen Prodomänen, wie z. B. Caspase-3, das Apoptoseprogramm zu Ende führen (Effektorcaspasen), indem sie zelluläre Substrate spalten. Die Spaltung dieser zellulären Substrate bestimmt das morphologische und biochemische Bild der Apoptose. Zu diesen Substraten gehören viele Proteine, unter anderem Proteine des Zellgerüsts wie Aktin und Plectin.

[Seite 9:]

1.5 Der programmierte Zelltod und seine unterschiedlichen Formen

Der Begriff "programmierter Zelltod" verweist inzwischen auf jede Art von Zelltod, der durch ein intrazelluläres Todesprogramm ungeachtet von seinem Auslöser vermittelt wird. Die Morphologien können entweder Apoptose, Nekrose oder eine Mischung aus beiden Phänotypen sein (Schweichel und Merker, 1973). Mittlerweile existieren unterschiedliche Bezeichnungen für die verschiedenen Ausprägungen und Morphologien des Zelltods. Es kristallisieren sich jedoch vier Hauptgruppen heraus, in die man die beobachteten Zelltode einordnen kann (Leist und Jäättelä, 2001).

[Seite 10:]

(i) Zunächst die klassische Apoptose mit den schon beschriebenen morphologischen und biochemischen Charakteristika, wie das Schrumpfen des Zytoplasmas, Chromatin- Kondensation, Abschnürung von apoptotischen Körperchen und die Exposition von Phophatidylserin (Kerr et al., 1972). Wichtig ist zudem die Aktivierung der Caspasen im Rahmen der apoptotischen Zelltodmaschinerie, deren Inhibition zu einer Blockierung des Zelltods führt.

(ii) Daran schließt sich der apoptose-ähnliche programmierte Zelltod (apoptosis-like programmed cell death) an. Die Chromatin-Kondensation ist hier weniger dicht als bei der klassischen Apoptose. Ebenfalls werden Phagozytose-erkennende Moleküle auf der Zellmembran gezeigt, bevor sich die apoptotischen Körperchen abschnüren. Andere apoptotische Merkmale unterscheiden sich in ihrer Ausprägung und Kombination von denen der klasssischen Apoptose, wobei nicht immer alle Hauptmerkmale zu beobachten sind. Die meisten beschriebenen Modelle der "caspase-unabhängigen Apoptose" gehören in diese Klasse (Borner und Monney, 1999; Kitanaka und Kuchino, 1999; Woodle et al., 1997).

Anmerkungen

Kein Hinweis auf die Quelle. Referenzen werden mitübernommen.

Sichter
(SleepyHollow02), Hindemith

[38.] Ad/Fragment 051 01 - Diskussion
Bearbeitet: 7. July 2014, 23:23 Hindemith
Erstellt: 7. July 2014, 20:16 (SleepyHollow02)
Ad, Fragment, Gesichtet, SMWFragment, Schutzlevel sysop, Verschleierung, Werner 2004

Typus
Verschleierung
Bearbeiter
SleepyHollow02
Gesichtet
Yes.png
Untersuchte Arbeit:
Seite: 51, Zeilen: 1-14
Quelle: Werner 2004
Seite(n): 10, Zeilen: 15 ff.
(iii) Der Nekrose-ähnliche programmierte Zelltod (necrosis-like programmed cell death) wird dagegen definiert über die fehlende Kondensation des Chromatins in der sterbenden Zelle. Verschiedene apoptotische Merkmale können in einem gewissen Grad noch festgestellt werden. Insgesamt unterscheiden sich die auftretenden Morphologien schon beträchtlich von denen der klassischen Apoptose. So laufen die Signalwege des Nekrose-ähnlichen Zelltods Caspase-unabhängig ab, was diese Form des programmierten Zelltods auch ausmacht. Eine Untergruppe dieser Form des Zelltods wird als abgebrochene Apoptose bezeichnet und meint eine induzierte Apoptose, die in dem Bereich der Caspaseaktivierung inhibiert und über einen alternativen, Caspase-unabhängigen Signalweg beendet wird (NICOTERA et al. 1998; HOLLER et al. 2000).

(iiii) Im Gegensatz zu den angesprochenen Formen des Zelltodes steht die pathologische Form des Zelltodes, die reine Nekrose, welche in der Vergangenheit eher als passive Form des Zelltodes angesehen wurde, für die jedoch mittlerweile ebenfalls ein eigener Signalweg angenommen wird.

(iii) Der nekrose-ähnliche programmierte Zelltod (necrosis-like programmed cell death) wird dagegen definiert über die fehlende Kondensation des Chromatins in der sterbenden Zelle. Verschiedene apoptotische Merkmale können in einem gewissen Grad noch festgestellt werden. Insgesamt unterscheiden sich die auftretenden Morphologien schon beträchtlich von denen der klassischen Apoptose. So laufen die Signalwege des nekrose-ähnlichen Zelltods caspase-unabhängig ab, was diese Form des programmierten Zelltods auch ausmacht. Eine Untergruppe dieser Form des Zelltods wird als abgebrochene Apoptose bezeichnet und meint eine induzierte Apoptose, die in dem Bereich der Caspaseaktivierung inhibiert und über einen alternativen, caspase-unabhängigen Signalweg beendet wird (Nicotera et al., 1999; Mateo et al., 1999; Holler et al., 2000).

(iiii) Im Gegensatz zu den angesprochenen Formen des Zelltos [sic] steht die pathologische Form des Zelltods, die reine Nekrose, welche in der Vergangenheit eher als passive Form des Zelltods angesehen wurde, für die jedoch mittlerweile ebenfalls ein eigener Signalweg angenommen wird.

Anmerkungen

Kein Hinweis auf die Quelle. Referenzen werden mitübernommen.

Sichter
(SleepyHollow02), Hindemith

[39.] Ad/Fragment 051 16 - Diskussion
Bearbeitet: 7. July 2014, 23:27 Hindemith
Erstellt: 7. July 2014, 18:51 (SleepyHollow02)
Ad, Blazey 2002, Fragment, Gesichtet, KomplettPlagiat, SMWFragment, Schutzlevel sysop

Typus
KomplettPlagiat
Bearbeiter
SleepyHollow02
Gesichtet
Yes.png
Untersuchte Arbeit:
Seite: 51, Zeilen: 16-27
Quelle: Blazey 2002
Seite(n): 33, Zeilen: 13 ff.
Die sicherste Methode stellt die in Routinestudien allerdings nicht praktizierbare Elektronenmikroskopie dar (GOLDSWORTHY et al. 1996 a, b). Zusätzlich wird seit kurzer Zeit auch die fluoreszierende Eigenschaft der kondensierten und damit stärker eosinophilen apoptotischen Körperchen sowie der Nachweis von TGF-ß1 und TGF-ß-“latent associated protein” (TGF-ß-LAP) für die Detektion genutzt (GOLDSWORTHY et al. 1996 b). Mit der Markierung des Phospholipids Phosphatidylserin, das während der Apoptose hauptsächlich an der Zelloberfläche lokalisiert ist, wurde eine weitere Nachweismethode aufgezeigt, die seit kurzem nicht nur in der Durchflusszytometrie eingesetzt werden kann (KOOPMAN et al. 1994; VAN ENGELAND et al. 1998).

Mit diesen Nachweismethoden werden apoptotische Zellen und Körperchen über unterschiedlich lange Zeitspannen während des Apoptoseprozesses erfasst (GOLDSWORTHY et al. 1996b; LABAT-MOLEUR et al. 1998).

Die sicherste Methode stellt die in Routinestudien allerdings nicht praktizierbare Elektronenmikroskopie dar (GOLDSWORTHY et al., 1996a, b). Zusätzlich wird seit kurzer Zeit auch die fluoreszierende Eigenschaft der kondensierten und damit stärker eosinophilen apoptotischen Körperchen sowie der Nachweis von TGF-ß1 und TGF-ß-“latent associated protein” (TGF-ß-LAP) für die Detektion genutzt (GOLDSWORTHY et al., 1996b). Mit der Markierung des Phospholipids Phosphatidylserin, das während der Apoptose hauptsächlich an der Zelloberfläche lokalisiert ist, wurde eine weitere Nachweismethode aufgezeigt, die seit kurzem nicht nur in der Durchflusszytometrie eingesetzt werden kann

(KOOPMAN et al., 1994; VAN ENGELAND et al., 1998).

Mit diesen Nachweismethoden werden apoptotische Zellen und Körperchen über unterschiedlich lange Zeitspannen während des Apoptoseprozesses erfasst (GOLDSWORTHY et al., 1996b; LABAT-MOLEUR et al., 1998).

Anmerkungen

Kein Hinweis auf die Quelle. Referenzen werden mitübernommen.

Sichter
(SleepyHollow02), Hindemith

[40.] Ad/Fragment 052 01 - Diskussion
Bearbeitet: 7. July 2014, 23:30 Hindemith
Erstellt: 7. July 2014, 18:56 (SleepyHollow02)
Ad, Blazey 2002, Fragment, Gesichtet, KomplettPlagiat, SMWFragment, Schutzlevel sysop

Typus
KomplettPlagiat
Bearbeiter
SleepyHollow02
Gesichtet
Yes.png
Untersuchte Arbeit:
Seite: 52, Zeilen: 1 ff. (komplett)
Quelle: Blazey 2002
Seite(n): 33, 34, Zeilen: 33: 26ff; 34: 1 ff.
2.15.1 Elektronenmikroskopie

Am sichersten ist es, die Apoptose ultrastrukturell mit dem Elektronenmikroskop (EM) von Zellzuständen wie der Nekrose, der Mitose und den Zytoplasmaeinschlüssen, abzugrenzen (KERR 1971; WYLLIE et al. 1980; FEHSEL et al. 1994; GOLDSWORTHY et al. 1996b) Anhand des elektronen- und lichtmikroskopischen Bildes wurden die morphologischen Kriterien der Apoptose definiert und die einzelnen Reaktionsschritte der Apoptose erfasst (KERR 1971; KERR et al. 1972; WYLLIE et al. 1980): Bei den überwiegend einzeln liegenden apoptotischen Zellen aggregiert zunächst ein Großteil des Chromatins in kompakten granulären Massen halbmond- oder sichelförmig an der Kernmembran. Die zunächst abnorm gewellte Kernmembran kerbt sich zunehmend ein, bis schließlich einzelne Kernfragmente präsent werden. Die Zellen schrumpfen und runden sich ab, so dass in soliden Geweben häufig ein elektronendurchgängiger Hof, ein sogenannter “Halo”, sichtbar wird. Die Schrumpfung resultiert zum großen Teil aus der Abgabe von Wasser an die Umgebung über das dilatierte endoplasmatische Retikulum (ER), dessen Membran zum Teil mit der Plasmamembran verschmilzt. Fortschreitende Kondensation des Zytoplasmas führt zu einer Zusammenballung der langzeitig funktionsfähigen Organellen. Ohne Synthese neuer Membranabschnitte bilden sich infolge der Zytoplasmaverdichtung Plasmamembranausstülpungen, die sich abschnüren und schließlich Membran-umschlossene apoptotische Körperchen mit oder ohne Kernfragmente bilden. Durch weitere Schrumpfung der apoptotischen Körperchen sind auch diese häufig von einem “Halo” umgeben.

Meist übernehmen angrenzende Epithelzellen oder Makrophagen die Aufgabe einer raschen Phagozytose. In Tumoren sind auch die neoplastischen Nachbarzellen an diesem Prozess beteiligt (BURSCH et al. 1990). Bei tubulärer Gewebestruktur werden die Zellen dagegen in das angrenzende Lumen abgegeben und “abgeschwemmt”. Die aufgenommenen apoptotischen Körper werden durch das lysosomale System der “Wirtszelle” abgebaut, was als “sekundäre Nekrose” bezeichnet wird. Zurück bleibt eine kleine Menge nicht verdaubaren Materials, der sogenannte “Restkörper”. In der Regel sind keine Anzeichen einer exsudativen Entzündung zu beobachten, wie sie beim nekrotischen Zelltod zu erwarten sind. Kommt es in der Embryogenese zum Absterben einer großen Gruppe von apoptotischen Zellen, treten zahlreiche Phagozyten auf, bei denen es sich nicht um zirkulierende Monozyten aus dem Blut handelt (SAUNDERS 1996; KERR 1971; WYLLIE et al. 1980). Es sind entweder Gewebemakrophagen oder benachbarte Parenchymzellen (SAUNDERS 1996).

2.7.1. Elektronenmikroskopie

Am sichersten ist es, die Apoptose ultrastrukturell mit dem Elektronenmikroskop (EM) von den differentialdiagnostisch zu berücksichtigenden Objekten, wie der Nekrose, der Mitose und den Zytoplasmaeinschlüssen, abzugrenzen (KERR et al., 1972; WYLLIE et al., 1980; FEHSEL et al., 1994; GOLDSWORTHY et al., 1996b). Anhand des elektronen- und lichtmikroskopischen Bildes wurden die morphologischen Kriterien der Apoptose definiert und die einzelnen Reaktionsschritte der Apoptose erfasst (KERR, 1971; KERR et al., 1972; WYLLIE et al., 1980):

[Seite 34:]

Bei den überwiegend einzeln liegenden apoptotischen Zellen aggregiert zunächst ein Großteil des Chromatins in kompakten granulären Massen halbmond- oder sichelförmig an der Kernmembran. Die zunächst abnorm gewellte Kernmembran kerbt sich zunehmend ein, bis schließlich einzelne Kernfragmente präsent werden. Die Zellen schrumpfen und runden sich ab, so dass in soliden Geweben häufig ein elektronendurchgängiger Hof, ein sogenannter “Halo”, sichtbar wird. Die Schrumpfung resultiert zum großen Teil aus der Abgabe von Wasser an die Umgebung über das dilatierte endoplasmatische Retikulum (ER), dessen Membran zum Teil mit der Plasmamembran verschmilzt. Fortschreitende Kondensation des Zytoplasmas führt zu einer Zusammenballung der langzeitig funktionsfähigen Organellen. Ohne Synthese neuer Membranabschnitte bilden sich infolge der Zytoplasmaverdichtung Plasmamembranausstülpungen, die sich abschnüren und schließlich Membran-umschlossene apoptotische Körperchen (AB) mit oder ohne Kernfragmente bilden. Durch weitere Schrumpfung der AB sind auch diese häufig von einem “Halo” umgeben. Meist übernehmen angrenzende Epithelzellen oder Makrophagen die Aufgabe einer raschen Phagozytose. In Tumoren sind auch die neoplastischen Nachbarzellen an diesem Prozess beteiligt (BURSCH et al., 1990). Bei tubulärer Gewebestruktur werden die Zellen dagegen in das angrenzende Lumen abgegeben und “abgeschwemmt”. Die aufgenommenen apoptotischen Körper werden durch das lysosomale System der “Wirtszelle” abgebaut, was als “sekundäre Nekrose” bezeichnet wird. Zurück bleibt eine kleine Menge nicht verdaubaren Materials, der sogenannte “Restkörper”. In der Regel sind keine Anzeichen einer exsudativen Entzündung zu beobachten, wie sie beim nekrotischen Zelltod zu erwarten sind. Kommt es in der Embryogenese zum Absterben einer großen Gruppe von apoptotischen Zellen, treten zahlreiche Phagozyten auf, bei denen es sich nicht um zirkulierende Monozyten aus dem Blut handelt (SAUNDERS, 1966; KERR, 1971; KERR et al., 1972; WYLLIE et al., 1980). Es sind entweder Gewebemakrophagen oder benachbarte Parenchymzellen (SAUNDERS, 1966).

Anmerkungen

Kein Hinweis auf die Quelle. Referenzen werden mitübernommen.

Sichter
(SleepyHollow02), Hindemith

[41.] Ad/Fragment 053 01 - Diskussion
Bearbeitet: 7. July 2014, 23:37 Hindemith
Erstellt: 7. July 2014, 19:00 (SleepyHollow02)
Ad, Blazey 2002, Fragment, Gesichtet, SMWFragment, Schutzlevel sysop, Verschleierung

Typus
Verschleierung
Bearbeiter
SleepyHollow02
Gesichtet
Yes.png
Untersuchte Arbeit:
Seite: 53, Zeilen: 1 ff. (komplett)
Quelle: Blazey 2002
Seite(n): 34, 35, 36, Zeilen: 34: 29ff; 35: 1 ff.; 36: 1ff
Mittels der Elektronenmikroskopie sind quantitative Auswertungen in einem größeren Studienumfang, wie er in Routinestudien notwendig ist, allerdings aufgrund der Kosten und Zeitaufwandes nicht praktikabel.

2.15.2 Standard-Lichtmikroskopie

Der morphologische Nachweis der Apoptose an Standard-H&E-gefärbten Zellen gilt als Standardmethode zum Apoptosenachweis (GOLDSWORTHY et al. 1996 a, b; SLOOP et al. 1999). Im Vergleich zur Elektronenmikroskopie können in der Standard-Lichtmikroskopie nicht alle unter Kapitel 2.15.1 beschriebenen Veränderungen erkannt werden (KERR et al. 1972; WYLLIE et al. 1980; GOLDSWORTHY et al. 1996 b; RAY & JENA 2000).

Die durch Fragmentierung entstehenden apoptotischen Körperchen (AB) haben unterschiedliche, meist glattrandige Formen und Größen und enthalten keine bis mehrere basophile Chromatinreste. Kleine apoptotische Körperchen werden bei der lichtmikroskopischen Betrachtung häufig nur erkannt, wenn sie derartige Chromatinreste enthalten.Im Verlauf des Prozesses liefern die intrazellulären Ansammlungen zahlreicher Kernfragmente das Bild einer Karyorrhexis (KERR et al. 1972; WYLLIE et al. 1980; GOLDSWORTHY et al. 1996 b).

Die geschilderten Veränderungen können nicht bei allen Zelltypen beobachtet werden. Kortikale Thymozyten fragmentieren ebenso wie ihre Kerne sehr begrenzt (WYLLIE et al. 1980; CHAPMAN et al. 1995). Humane lymphatische Leukämiezellen (MOLT-4 Zellen) bilden keine apoptotischen Körperchen, humane promyelozytische Leukämiezellen (HL60- Zellen) dagegen schon (CHAPMAN et al. 1995).

Bei Skelettmuskelzellen wird die Fragmentierung wahrscheinlich verhindert, indem bei der engen Packung der Myofilamente Verstrebungen entstehen (KERR et al. 1974). Die Tonofilamente der Keratinozyten unterbinden ausgeprägte Oberflächenveränderungen, so dass nur kleine Protuberanzen zu beobachten sind (WEEDON et al. 1979).

2.15.3 Fluoreszenzmikroskopie

Die Fluoreszenzmikroskopie wird vor allem als Auflichtmethode betrieben (BUCHER & WARTENBERG 1991). Die Fluorochrome leuchten auf dunklem Hintergrund auf (BURCK et al. 1988; BUCHER & WARTENBERG 1991). Eosin (Tetrabromfluoreszein-Natrium) gehört physikalisch-chemisch wie z.B. Fluoreszein oder Rhodamin in die Gruppe der [Xanthen-Derivate und wie Brillantsulphoflavin zu den anionischen oder sauren Fluorochromen (BURCK et al.1996).]

Mittels der Elektronenmikroskopie sind quantitative Auswertungen in einem größeren Studienumfang, wie er in Routinestudien notwendig ist, allerdings aufgrund des Kosten- und Zeitaufwandes nicht praktikabel.

2.7.2. Standard-Lichtmikroskopie

Der morphologische Nachweis der Apoptosen am Standard-H&E-gefärbten Schnitt gilt derzeit als Standardmethode zum Apoptosenachweis (GOLDSWORTHY et al., 1996a, b; SLOOP et al., 1999).

[Seite 35:]

Im Vergleich zur Elektronenmikroskopie können in der Standard-Lichtmikroskopie nicht alle unter Kapitel 2.7.1. beschriebenen Veränderungen erkannt werden (KERR et al., 1972; WYLLIE et al., 1980; GOLDSWORTHY et al., 1996b; RAY und JENA, 2000):

[...] Die durch Fragmentierung entstehenden apoptotischen Körperchen (AB) haben unterschiedliche, meist glattrandige Formen und Größen und enthalten keine bis mehrere basophile Chromatinreste. Kleine AB werden bei der lichtmikroskopischen Betrachtung häufig nur erkannt, wenn sie derartige Chromatinreste enthalten. [...] Dieser “Halo“ kann zur besseren Erkennung bei der lichtmikroskopischen Betrachtung beitragen. Später im Verlauf des Prozesses liefern die intrazellulären Ansammlungen zahlreicher Kernfragmente das Bild einer Karyorrhexis (KERR et al., 1972; WYLLIE et al., 1980; GOLDSWORTHY et al., 1996b), allerdings nicht des Makrophageneigenen Zellkerns.

Die geschilderten Veränderungen können nicht bei allen Zelltypen und in allen Organen beobachtet werden. Kortikale Thymozyten fragmentieren ebenso wie ihre Kerne sehr begrenzt (WYLLIE et al., 1980; CHAPMAN et al., 1995). Humane lymphatische Leukämiezellen (MOLT-4 Zellen) bilden keine apoptotischen Körperchen, humane promyelozytische Leukämiezellen (HL60-Zellen) dagegen schon (CHAPMAN et al., 1995). Bei Skelettmuskelzellen wird die Fragmentierung wahrscheinlich verhindert, indem bei der engen Packung der Myofilamente Verstrebungen entstehen (KERR et al., 1974). Die Tonofilamente der Keratinozyten unterbinden ausgeprägte Oberflächenveränderungen, so dass nur kleine Protuberanzen zu beobachten sind (WEEDON et al., 1979).

[Seite 36:]

2.7.3. Fluoreszenzmikroskopie

Die Fluoreszenzmikroskopie wird vor allem als Auflichtmethode betrieben (BUCHER und WARTENBERG, 1991). Die Fluorochrome leuchten auf dunklem Hintergrund auf (BURCK, 1988; BUCHER und WARTENBERG, 1991). Eosin (Tetrabromfluoreszein- Natrium) gehört physikalisch-chemisch wie z.B. Fluoreszein oder Rhodamin in die Gruppe der Xanthen-Derivate und wie Brillantsulphoflavin zu den anionischen oder sauren Fluorochromen (BURCK, 1988).

Anmerkungen

Kein Hinweis auf die Quelle. Referenzen werden mitübernommen.

Sichter
(SleepyHollow02), Hindemith

[42.] Ad/Fragment 054 01 - Diskussion
Bearbeitet: 7. July 2014, 23:40 Hindemith
Erstellt: 7. July 2014, 19:06 (SleepyHollow02)
Ad, Blazey 2002, Fragment, Gesichtet, SMWFragment, Schutzlevel sysop, Verschleierung

Typus
Verschleierung
Bearbeiter
SleepyHollow02
Gesichtet
Yes.png
Untersuchte Arbeit:
Seite: 54, Zeilen: 1-10
Quelle: Blazey 2002
Seite(n): 36, Zeilen: 3 ff.
[Eosin (Tetrabromfluoreszein-Natrium) gehört physikalisch-chemisch wie z.B. Fluoreszein oder Rhodamin in die Gruppe der] Xanthen-Derivate und wie Brillantsulphoflavin zu den anionischen oder sauren Fluorochromen (BURCK et al.1996).

Bei der Fluoreszenzmikroskopie nutzt man zum Nachweis der Apoptose die Eigenschaft von Eosin, das von ihm absorbierte Licht in einer anderen Wellenlänge wieder abzustrahlen sowie die Tatsache, dass apoptotische Körperchen eine deutlich höhere Eosinophilie als vollständige Zellen aufweisen. Hierbei ist zu beachten, dass auch andere Zytoplasmaeinschlüsse (z.B. Proteintropfen) durch ihre Eosinophilie eine fluoreszierende Eigenschaft aufweisen können (ESPADA et al. 1993; STINCHCOMBE et al. 1995; GOLDSWORTHY et al. 1996 a,b). Mit zunehmendem Gehalt an Kernfragmenten wird die Fluoreszenz der apoptotischen Körperchen maskiert (STINCHCOMBE 1996).

Eosin (Tetrabromfluoreszein- Natrium) gehört physikalisch-chemisch wie z.B. Fluoreszein oder Rhodamin in die Gruppe der Xanthen-Derivate und wie Brillantsulphoflavin zu den anionischen oder sauren Fluorochromen (BURCK, 1988).

Bei der Fluoreszenzmikroskopie nutzt man zum Nachweis der Apoptose die Eigenschaft von Eosin, das von ihm absorbierte Licht in einer anderen Wellenlänge wieder abzustrahlen sowie die Tatsache, dass apoptotische Körperchen eine deutlich höhere Eosinophilie als die umgebenden Zellen aufweisen. Hierzu werden nach STINCHCOMBE (STINCHCOMBE et al., 1995; STINCHCOMBE, 1996) möglichst dünne Gewebeschnitte mit 0,4%iger alkoholischer Eosin- sowie schwacher Hämatoxylin- Gegenfärbung gefärbt. Hierbei ist zu beachten, dass auch andere Zytoplasmaeinschlüsse (z.B. Proteintropfen) durch ihre Eosinophilie eine fluoreszierende Eigenschaft aufweisen können (ESPADA et al., 1993; STINCHCOMBE et al., 1995; GOLDSWORTHY et al., 1996a, b). Mit zunehmendem Gehalt an Kernfragmenten wird die Fluoreszenz der apoptotischen Körperchen maskiert (STINCHCOMBE, 1996).

Anmerkungen

Kein Hinweis auf die Quelle. Referenzen werden mitübernommen.

Sichter
(SleepyHollow02), Hindemith

[43.] Ad/Fragment 054 12 - Diskussion
Bearbeitet: 7. July 2014, 23:55 Hindemith
Erstellt: 7. July 2014, 15:29 (SleepyHollow02)
Ad, Edelmann 2005, Fragment, Gesichtet, SMWFragment, Schutzlevel sysop, Verschleierung

Typus
Verschleierung
Bearbeiter
SleepyHollow02
Gesichtet
Yes.png
Untersuchte Arbeit:
Seite: 54, Zeilen: 12-30
Quelle: Edelmann 2005
Seite(n): 7, 8, Zeilen: 7: letzte Zeilen; 8: 1 ff.
Die Bestimmung des DNA-Gehalts von Zellen war eine der ersten Anwendungen für die Durchflußzytometrie in den frühen 70-iger Jahren. Man hatte erkannt, dass sich bestimmte Fluorochrome wie BrDU, oder Propidiumiodid stöchiometrisch an die DNA anlagern (SHAPIRO 2003).Über den Gehalt des Farbstoffes konnte dann der Gehalt an DNA errechnet werden. Zurzeit ist eine Vielzahl von DNA-Farbstoffen auf dem Markt. Grob kann man sie nach folgenden Kriterien unterscheiden: Lebend- und Totfarbstoffe: Lebendfarbstoffe lassen Untersuchungen an lebenden Zellen zu, sie werden über aktive Transportmechanismen in die Zelle transportiert. Desweiteren unterscheidet man DNA-spezifische Farbstoffe, die sich an die AT- oder GC- Bindung der DNA anlagern, von unspezifischen Farbstoffen die sowohl DNA als auch RNA anfärben und eine Vorbehandlung mit RNA-se nötig machen.

Die ältesten Vertreter sind zum einen Propidiumiodid, ein mit Bindung an RNA/ DNA Fluoreszenz entwickelnder Farbstoff. Zum anderen wird das Bis-Benzimidazol HOECHST 33342 benutzt, ein DNA- spezifischer Lebendfarbstoff, der allerdings einen UV-Laser zur Exzitation braucht.

Die Mycine wie z. B. Chromomycin 3, ein grünes Fluorochrom, oder Actinomycin D, ein rotes Fluorochrom, sind durch ihre GC-Bindung DNA-spezifisch, benötigen aber fixierte und permeabilisierte Zellen. Die Cyan-Farbstoffe benötigen ebenfalls permeabilisierte Zellen, und, je nach Ausführung (Blau/ Grün/ Rot) entsprechende Lichtquellen wie Argon-UV- oder Neodymlaser oder Quecksilberdampflampen zur Anregung.

Die Bestimmung des DNA-Gehalts von Zellen war eine der ersten Anwendungen für die Durchflußzytometrie in den frühen 70-iger Jahren. Man hatte erkannt, dass sich

[Seite 8:]

bestimmte Fluorochrome wie BrDU, oder Propidiumiodid stöchiometrisch an die DNA anlagern {71}. Über den Gehalt des Farbstoffes konnte dann der Gehalt an DNA errechnet werden.

[...]

Heute ist eine Vielzahl von DNA-Farbstoffen auf dem Markt. Grob kann man sie nach folgenden Kriterien unterscheiden:

Lebend- und Totfarbstoffe: Lebendfarbstoffe lassen Untersuchungen an lebenden Zellen zu, sie werden über aktive Transportmechanismen in die Zelle transportiert. Totfarbstoffe benötigen fixierte und permeabilisierte Zellen.

Desweiteren unterscheidet man DNA-spezifische Farbstoffe, die sich an die AT- oder GC-Bindung der DNA anlagern, von unspezifischen Farbstoffen die sowohl DNA als auch RNA anfärben und eine Vorbehandlung mit RNA-se nötig machen.

Die ältesten Vertreter sind zum einen Propidiumiodid, ein mit Bindung an RNA/ DNA Fluoreszenz entwickelnder Farbstoff, der RNA-se Vorbehandlung und Permeabilisierung benötigt. Zum anderen wird das Bis-Benzimidazol HOECHST 33342 benutzt, ein DNA-spezifischer Lebendfarbstoff, der allerdings einen UV-Laser zur Exzitation braucht.

Die Mycine wie z. B. Chromomycin 3, ein grünes Fluorochrom, oder Actinomycin D, ein rotes Fluorochrom, sind durch ihre GC-Bindung DNA-spezifisch, benötigen aber fixierte und permeabilisierte Zellen.

Die Cyan-Farbstoffe benötigen ebenfalls permeabilisierte Zellen, und, je nach Ausführung (Blau/ Grün/ Rot) entsprechende Lichtquellen wie Argon-UV- oder Neodym-Laser oder Quecksilberdampflampen zur Anregung.

Anmerkungen

Kein Hinweis auf die Quelle.

Sichter
(SleepyHollow02), Hindemith

[44.] Ad/Fragment 055 01 - Diskussion
Bearbeitet: 10. July 2014, 14:20 Schumann
Erstellt: 7. July 2014, 15:37 (SleepyHollow02)
Ad, Edelmann 2005, Fragment, Gesichtet, KomplettPlagiat, SMWFragment, Schutzlevel sysop

Typus
KomplettPlagiat
Bearbeiter
SleepyHollow02
Gesichtet
Yes.png
Untersuchte Arbeit:
Seite: 55, Zeilen: 1-14
Quelle: Edelmann 2005
Seite(n): 9, 10, Zeilen: 9: 1 ff.; 10: 14 f.
Relativ neu sind die SYTO-Farbstoffe, die es als Totfarbstoff (CYTOX) oder als Lebendfarbstoff (SYTO) gibt (Molecular Probes Inc., Eugene, OR, USA), die jeweils mit verschiedenen Fluoreszenzfarbstoffen gekoppelt werden können (grün, blau, orange, rot). Diese Farbstoffe sind nicht DNA-spezifisch und erreichen nicht die stöchiometrische Zuverlässigkeit wie HOECHST 33342 oder Propidiumiodid. Sie sind daher nicht zur quantitativen DNA-Analyse geeignet, können aber zur Totfärbung genutzt werden. Ein neuer Farbstoff ist das deep-red-anthraquinone (DRAQ5), der DNA-spezifisch ist und sich innerhalb von Sekunden in lebenden Zellen verteilt. Es ist keine weitere Vorbehandlung nötig, und er lässt sich sowohl von Argon- als auch Diodenlaser anregen. Das Emissionsspektrum liegt bei 670 nm, weit vom Spektrum des GFP entfernt. DRAQ5 erreicht dabei die gleiche stöchiometrische Genauigkeit wie Propidiumiodid und ist damit sehr gut zur quantitativen DNA-Bestimmung geeignet (SMITH et al. 1999; WILTSHIRE et al.2000; PAUL et al. 2000). Eine weitere Möglichkeit, die oft in der Durchflusszytometrie eingesetzt wird, ist die Markierung von Membranbestandteilen durch Annexin V.

SMITH PJ, BLUNT NA, WILTSHIRE M, CEHOY T, DALE-SPITTLE PT, CRAVEN MR, WATSON JW, BRADAMOS W, ERRINGTON RJ & PATTERSON LH. (2000) : Characteristics of a novel deep red/infrared fluorescent cell-permeant DNA probe, DRAQ5, in intact human cells analyzed by flow cytometry, confocal and multiphoton microscopy. Cytometry ,40, 280-291

SMITH PJ, WILTSHIRE M, DAVIES S, PATTERSON LH & HOY T. (1999) : A novel cell permeant and far red-fluorescing DNA probe, DRAQ5, for blood cell discrimination by flow cytometry. J. Imm. Methods. ,229, 131-139

WILTSHIRE M, PATTERSON LH & SMITH PJ. (2000) : A novel deep red/low infrared fluorescentflowcytometricprobe [sic],DRAQ5NO, forthediscriminationofintact [sic] nucleated cells in apoptotic cell populations. Cytometry ,39, 217-223

Relativ neu sind die SYTO-Farbstoffe, die es als Totfarbstoff (CYTOX) oder als Lebendfarbstoff (SYTO) gibt (Molecular Probes Inc., Eugene, OR, USA), die jeweils mit verschiedenen Fluoreszenzfarbstoffen gekoppelt werden können (grün blau, orange, rot). Diese Farbstoffe sind nicht DNA-spezifisch und erreichen nicht die stöchiometrische Zuverlässigkeit wie HOECHST 33342 oder Propidiumiodid. Sie sind daher nicht zur quantitativen DNA-Analyse geeignet, können aber zur Totfärbung genutzt werden. Ein neuer Farbstoff ist das deep-red-anthraquinone (DRAQ5), der DNA-spezifisch ist und sich innerhalb von Sekunden in lebenden Zellen verteilt. Es ist keine weitere Vorbehandlung nötig, und er lässt sich sowohl von Argon- als auch Diodenlaser anregen. Das Emissionsspektrum liegt bei 670 nm, weit vom Spektrum des GFP entfernt. DRAQ5 erreicht dabei die gleiche stöchiometrische Genauigkeit wie Propidiumiodid und ist damit sehr gut zur quantitativen DNA-Bestimmung geeignet {54, 55, 56}.

[Seite 10]

Eine weitere Möglichkeit, die oft in der Durchflusszytometrie eingesetzt wird, ist die Markierung von Membranbestandteilen durch Annexin V.


54. Smith PJ; Wiltshire M; Davies S; Patterson LH; Hoy T; A novel cell permeant and far red-fluorescing DNA probe, DRAQ5, for blood cell discrimination by flow cytometry. J Imm Methods, Vol. 229: 131-139, 1999.

55. Marie Wiltshire; Laurence H.Patterson, Paul J.Smith 1 A novel deep red/low infrared fluorescent flow cytometric probe, DRAQ5NO, for the discrimination of intact nucleated cells in apoptotic cell populations. Cytometry, Vol. 39, Issue 3, 217- 223, 2000.

56. Paul J. Smith, Nicola Blunt, Marie Wiltshire, Terence Hoy, Paul Teesdale-Spittle, Michael R.Craven, James V.Watson, W.Brad Amos, Rachel J.Errington, Laurence H.Patterson; Characteristics of a novel deep red/infrared fluorescent cell-permeant DNA probe, DRAQ5, in intact human cells analyzed by flow cytometry, confocal and multiphoton microscopy. Cytometry, Vol. 40, Issue 4, 280-291, 2000.

Anmerkungen

Kein Hinweis auf die Quelle.

Man beachte, dass man im Literaturverzeichnis von Ad keine Publikation "PAUL et al. 2000" findet. Es scheint sich hier um einen Übertragungsfehler zu handeln, denn in der Quelle wird der Vornamen "Paul" des Autors der zu referenzierenden Publikation ausgeschrieben.

Sichter
(SleepyHollow02), Hindemith

[45.] Ad/Fragment 055 14 - Diskussion
Bearbeitet: 7. July 2014, 23:43 Hindemith
Erstellt: 7. July 2014, 19:11 (SleepyHollow02)
Ad, Blazey 2002, Fragment, Gesichtet, SMWFragment, Schutzlevel sysop, Verschleierung

Typus
Verschleierung
Bearbeiter
SleepyHollow02
Gesichtet
Yes.png
Untersuchte Arbeit:
Seite: 55, Zeilen: 14-32
Quelle: Blazey 2002
Seite(n): 41, Zeilen: 5 ff.
Das anionische Phospholipid Phosphatidylserin ist zu etwa 95% in der zytosolischen Schicht der Doppelmembran der äußeren Zellmembran lokalisiert. Mit der Einleitung des programmierten Zelltodes kommt es durch noch nicht genau geklärte Reaktionsmechanismen zu einer Umverteilung dieses Membranbausteins an die Außenseite der Plasmamembran (DIAZ & SCHROIT 1996; VAN DEN EIJNDE et al., 1997a,b; VAN ENGELAND et al. 1998). Auch bei Insekten- und Pflanzenzellen kann dieser Wechsel der Lokalisation des PS beobachtet werden (VAN ENGELAND et al. 1998). Nur durch die hauptsächliche Orientierung des Phosphatidylserins zur Zellumgebung ist eine Verschmelzung der Membranabschnürungen und die Bildung apoptotischer Körperchen möglich (DIAZ & SCHROIT 1996). Phosphatidylserin fungiert gleichfalls als Rezeptor für die Phagozyten - speziell für Makrophagen aus der Peritonealhöhle. Durch die schnelle Phagozytose wird ein Austritt chemotaktischer Substanzen mit nachfolgender entzündlicher Reaktion verhindert (DIAZ & SCHROIT 1996; VAN DEN EIJNDE et al., 1997a, b).

Eine Sichtbarmachung des nach außen verlegten PS wird durch die Anlagerung des Antikoagulans Annexin V (Synonyme: “Placental Protein 4” (PP4), “Vascular- Anticoagulant-a”) ermöglicht, welches an Fluoreszein-Isothiozyanat (FITC) oder Biotin gekoppelt ist, wodurch der direkte oder indirekte Nachweis möglich wird (KOOPMAN et al. 1994; VAN ENGELAND et al. 1998).

Das anionische Phospholipid Phosphatidylserin (PS) ist zu etwa 95% in der zytosolischen Schicht der Doppelmembran der äußeren Zellmembran lokalisiert. Mit der Einleitung des programmierten Zelltodes kommt es durch noch nicht genau geklärte Reaktionsmechanismen zu einer Umverteilung dieses Membranbausteins an die Außenseite der Plasmamembran (DIAZ und SCHROIT, 1996; VAN DEN EIJNDE et al., 1997a, b; VAN ENGELAND et al., 1998). Auch bei Insekten- und Pflanzenzellen kann dieser Wechsel der Lokalisation des PS beobachtet werden (VAN ENGELAND et al., 1998). Nur durch die hauptsächliche Orientierung des Phosphatidylserins zur Zellumgebung ist eine Verschmelzung der Membranabschnürungen und die Bildung apoptotischer Körperchen möglich (DIAZ und SCHROIT, 1996). Phosphatidylserin fungiert gleichfalls als Rezeptor für die Phagozyten – speziell für Makrophagen aus der Peritonealhöhle. Durch die schnelle Phagozytose wird ein Austritt chemotaktischer Substanzen mit nachfolgender entzündlicher Reaktion verhindert (DIAZ und SCHROIT, 1996; VAN DEN EIJNDE et al., 1997a, b).

Eine Sichtbarmachung des nach außen verlegten PS wird durch die Anlagerung des Antikoagulans Annexin V (Synonyme: “Placental Protein 4” (PP4), “Vascular- Anticoagulant-a”) ermöglicht, welches an Fluoreszein-Isothiozyanat (FITC) oder Biotin gekoppelt ist, wodurch der direkte oder indirekte Nachweis möglich wird (KOOPMAN et al., 1994; VAN ENGELAND et al., 1998).

Anmerkungen

Kein Hinweis auf die Quelle. Referenzen werden mitübernommen.

Sichter
(SleepyHollow02), Hindemith

[46.] Ad/Fragment 056 01 - Diskussion
Bearbeitet: 7. July 2014, 23:49 Hindemith
Erstellt: 7. July 2014, 19:27 (SleepyHollow02)
Ad, Blazey 2002, Fragment, Gesichtet, KomplettPlagiat, SMWFragment, Schutzlevel sysop

Typus
KomplettPlagiat
Bearbeiter
SleepyHollow02
Gesichtet
Yes.png
Untersuchte Arbeit:
Seite: 56, Zeilen: 1-15
Quelle: Blazey 2002
Seite(n): 41, 42, Zeilen: 41: 24ff; 42: 1 ff.
Da bei der Nekrose ein Verlust der Plasmamembranintegrität innerhalb weniger Minuten eintritt, resultiert bei diesen Zellen eine Farbreaktion an der Membraninnenseite. Eine Zusatzfärbung mit Vitalfarbstoffen (z.B. Propidiumjodid) bietet eine zusätzliche Unterscheidungsmöglichkeit der Annexin-positiven Zellen, da bei apoptotischen Zellen die Vitalfarbstoffe nicht durch die langzeitig unversehrte Membran eindringen können. Bei nekrotischen Zellen wird dagegen der Zellkern angefärbt. Lebende unveränderte Zellen weisen weder die eine, noch die andere Markierung auf (KOOPMAN et al. 1994; MARTIN et al. 1995; VERMES et al. 1995; VAN ENGELAND et al. 1998). Ein Vorteil dieser leicht durchführbaren Nachweismethode ist, dass die Verlagerung von Phosphatidylserin frühzeitig während der Apoptose stattfindet, wenn sonst noch keine bzw. nur sehr feine Abweichungen von der normalen Zellmorphologie zu erkennen sind (MARTIN et al. 1995; VERMES et al. 1995; VAN DEN EIJNDE et al. 1997b; VAN ENGELAND et al. 1998). Die internukleosomale Degradierung der DNS setzt gleichfalls später ein, weshalb einige Zellen Annexin-positiv sind bevor Strangbrüche der DNS mit der TUNEL-Methode aufgezeigt werden können (VAN ENGELAND et al. 1998). Da bei der Nekrose ein Verlust der Plasmamembranintegrität innerhalb weniger Minuten eintritt, resultiert bei diesen Zellen eine Farbreaktion an der Membraninnenseite. Eine Zusatzfärbung mit Vitalfarbstoffen (z.B. Propidiumjodid) bietet eine zusätzliche Unterscheidungsmöglichkeit der Annexin-positiven Zellen, da bei apoptotischen Zellen die Vitalfarbstoffe nicht durch die langzeitig unversehrte Membran eindringen können. Bei nekrotischen Zellen wird dagegen der Zellkern angefärbt. Lebende unveränderte Zellen weisen weder die eine, noch die andere Markierung auf (KOOPMAN et al., 1994; MARTIN et al., 1995; VERMES et al., 1995; VAN ENGELAND et al., 1998).

[Seite 42:]

Ein Vorteil dieser leicht durchführbaren Nachweismethode ist, dass die Verlagerung von Phosphatidylserin frühzeitig während der Apoptose stattfindet, wenn sonst noch keine bzw. nur sehr feine Abweichungen von der normalen Zellmorphologie zu erkennen sind (MARTIN et al., 1995; VERMES et al., 1995; VAN DEN EIJNDE et al., 1997b; VAN ENGELAND et al., 1998). Die internukleosomale Degradierung der DNS setzt gleichfalls später ein, weshalb einige Zellen Annexin-positiv sind bevor Strangbrüche der DNS mit der TUNEL-Methode aufgezeigt werden können (VAN ENGELAND et al., 1998).

Anmerkungen

Kein Hinweis auf die Quelle. Referenzen werden mitübernommen.

Sichter
(SleepyHollow02), Hindemith

[47.] Ad/Fragment 056 17 - Diskussion
Bearbeitet: 7. July 2014, 23:49 Hindemith
Erstellt: 6. July 2014, 12:15 (SleepyHollow02)
Ad, Bente 2003, Fragment, Gesichtet, SMWFragment, Schutzlevel sysop, Verschleierung

Typus
Verschleierung
Bearbeiter
SleepyHollow02
Gesichtet
Yes.png
Untersuchte Arbeit:
Seite: 56, Zeilen: 17-29
Quelle: Bente 2003
Seite(n): 16, Zeilen: 3 ff.
2.16.1 Polymerasekettenreaktion nach reverser Transkription

Die Polymerase-Kettenreaktion (PCR, polymerase chain reaction) ist seit ihrer Entdeckung zu einer der wichtigsten Techniken in der modernen Biomedizin geworden (MULLIS & FALOONA 1987). Immer günstigere Reagenzien und eine stetige Vereinfachung und Automatisierung einzelner Teilschritte machen die Technik auch zunehmend für Routineuntersuchungen einsetzbar. Die PCR ist eine in vitro-Technik zur gezielten Vermehrung eines spezifischen DNA-Genomfragmentes, das zwischen zwei Regionen mit bekannter Nukleotidsequenz liegt. Die PCR ermöglicht die Amplifikation sehr geringer Nukleinsäuremengen aus den unterschiedlichsten Materialien (MULLIS & FALOONA 1987). Das Prinzip der PCR lässt sich wie folgt beschreiben (Abb.2): Zunächst erfolgt die Denaturierung der doppelsträngigen DNA (dsDNA), an welche sich am 5`- und 3`-Ende des zu amplifizierenden Bereichs spezifische Oligonukleotide, die Primer, anlagern. Dieser Vorgang wird als Annealing bezeichnet. Die Oligonukleotide werden von einer DNA [abhängigen DANN Polymerase in Anwesenheit freier Desoxynukleosid-Triphosphate (dNTPs) verlängert (Elongation).]

Die Polymerase-Kettenreaktion (PCR, polymerase chain reaction) ist seit ihrer Entdeckung vor 16 Jahren zu einer der wichtigsten Techniken in der modernen Biomedizin geworden (MULLIS u. FALOONA 1987). Immer günstiger werdende Reagenzien und eine stetige Vereinfachung und Automatisierung einzelner Teilschritte machen die Technik auch zunehmend für Routineuntersuchungen einsetzbar.

Die PCR ist eine in vitro Technik zur gezielten Vermehrung eines spezifischen DNA- Genomfragmentes, das zwischen zwei Regionen mit bekannter Nukleotidsequenz liegt. Die PCR ermöglicht die Vervielfältigug [sic] (Amplifikation) sehr geringer Nukleinsäuremengen aus den unterschiedlichsten Materialien (MULLIS u. FALOONA 1987). Das Prinzip der PCR lässt sich wie folgt beschreiben (Abb. 2.3): Zunächst erfolgt die Denaturierung der doppelsträngigen DNA (dsDNA), an welche sich am 5`- und 3`-Ende des zu amplifizierenden Bereichs spezifische Oligonukleotide, die Primer, anlagern. Dieser Vorgang wird als Annealing bezeichnet. Die Oligonukleotide werden von einer DNA-abhängigen DNA-Polymerase in Anwesenheit freier Desoxynukleosid-Triphosphate (dNTPs) verlängert (Elongation).

Anmerkungen

Kein Hinweis auf die Quelle.

Sichter
(SleepyHollow02) Singulus

[48.] Ad/Fragment 057 01 - Diskussion
Bearbeitet: 8. July 2014, 09:15 Hindemith
Erstellt: 6. July 2014, 12:40 (SleepyHollow02)
Ad, Bente 2003, Fragment, Gesichtet, SMWFragment, Schutzlevel sysop, Verschleierung

Typus
Verschleierung
Bearbeiter
SleepyHollow02
Gesichtet
Yes.png
Untersuchte Arbeit:
Seite: 57, Zeilen: 1-11, 12-15
Quelle: Bente 2003
Seite(n): 16, 17, Zeilen: 16: 15 ff.; 17: 1 f.
[Die Oligonukleotide werden von einer DNA] abhängigen DANN Polymerase [sic] in Anwesenheit freier Desoxynukleosid-Triphosphate (dNTPs) verlängert (Elongation). Die DNA-Polymerase verlängert den entstehenden DNA-Doppelstrang so lange, bis sie von der DNA „abfällt“ oder die Reaktion unterbrochen wird (Abb.2). Dieser Abbruch kann z.B. durch eine Erhöhung der Inkubationstemperatur auf 95 °C verbunden mit einer wiederholten Denaturierung der dsDNA erfolgen. Kühlt man den Reaktionsansatz in Anwesenheit freier Oligonukleotide auf 40-60 °C herunter, so binden diese in Abhängigkeit ihres mittleren Schmelzwertes (TM-Wertes) an die komplementäre Sequenz der DNA-Matrize. Die Synthese eines weiteren Doppelstranges kann nun wiederholt werden (ERLICH 1989; MULLIS & FALOONA 1987). Die Abfolge dieser drei Reaktionsschritte wird als Zyklus bezeichnet. Diese Zyklen werden zwischen 25 bis 40-mal wiederholt (MÜLHARDT 2002).

[ABBILDUNG]

Rein theoretisch verdoppelt sich in der PCR die Anzahl an DNA-Molekülen von Zyklus zu Zyklus. Aus einem Zielmolekül würden so innerhalb von dreißig Zyklen etwa eine Milliarde und nach vierzig Zyklen sogar 1012 [sic] Moleküle. Der rein theoretische Multiplikationsfaktor wäre hier also 2. Tatsächlich liegt der durchschnittliche Multiplikationsfaktor (bezogen auf [die Gesamtreaktion) je Zyklus bei ca. 1,6 bis 1,7 (KAINZ 2000).]

Die Oligonukleotide werden von einer DNA-abhängigen DNA-Polymerase in Anwesenheit freier Desoxynukleosid-Triphosphate (dNTPs) verlängert (Elongation). Die DNA-Polymerase verlängert den entstehenden DNA-Doppelstrang so lange, bis sie von der DNA „abfällt“ oder die Reaktion unterbrochen wird (Abb. 2.3). Dieser Abbruch kann z.B. durch eine Erhöhung der Inkubationstemperatur auf 95 °C verbunden mit einer wiederholten Denaturierung der dsDNA erfolgen. Kühlt man den Reaktionsansatz in Anwesenheit freier Oligonukleotide auf 40-60 °C herunter, so binden diese in Abhängigkeit ihres mittleren Schmelzwertes (TM-Wertes) an die komplementäre Sequenz der DNA-Matrize. Die Synthese eines weiteren Doppelstranges kann nun wiederholt werden (ERLICH 1989; MULLIS und FALOONA 1987). Die Abfolge dieser drei Reaktionsschritte wird als Zyklus bezeichnet. Diese Zyklen werden zwischen 25 bis 40-mal wiederholt (MÜLHARDT 2002).

[...]

Rein theoretisch verdoppelt sich in der PCR die Anzahl an DNA-Molekülen von Zyklus zu Zyklus. Aus einem Zielmolekül würden so innerhalb von dreißig Zyklen etwa eine Milliarde und nach vierzig Zyklen sogar eine Billionen Moleküle. Der rein theoretische Multiplikationsfaktor wäre hier also 2. Tatsächlich liegt der durchschnittliche

[Seite 17]

Multiplikationsfaktor (bezogen auf die Gesamtreaktion) je Zyklus bei ca. 1,6 bis 1,7 (KAINZ 2000)..

Anmerkungen

Kein Hinweis auf die Quelle.

Die Abbildung stammt nicht aus der hier dokumentierten Quelle.

Sichter
(SleepyHollow02), Hindemith

[49.] Ad/Fragment 058 01 - Diskussion
Bearbeitet: 9. July 2014, 11:38 Hindemith
Erstellt: 6. July 2014, 12:53 (SleepyHollow02)
Ad, Bente 2003, Fragment, Gesichtet, SMWFragment, Schutzlevel sysop, Verschleierung

Typus
Verschleierung
Bearbeiter
SleepyHollow02
Gesichtet
Yes.png
Untersuchte Arbeit:
Seite: 58, Zeilen: 1-5, 6-15
Quelle: Bente 2003
Seite(n): 16, 17, 18, Zeilen: 16: letzte Zeile, 17: 1 ff.; 18: 4 ff.
[Tatsächlich liegt der durchschnittliche Multiplikationsfaktor (bezogen auf] die Gesamtreaktion) je Zyklus bei ca. 1,6 bis 1,7 (KAINZ 2000). Dies liegt daran, dass die Vermehrungsrate am Ende der PCR geringer ist, als in der Mitte der Zyklenanzahl (Abb.3). Zu Beginn und in der Mitte der Reaktion ist der Multiplikationsfaktor 2 und die Vermehrungsrate ist exponentiell. Gegen Ende geht die Reaktion in eine lineare und schließlich in eine Plateau-Phase über (Abbildung 3; nach KAINZ 2000 modifiziert).

Ad 58a diss.png

Abbildung 3: Grafische Darstellung einer idealisierten PCR (nach KAINZ 2000 modifiziert).

[...]

Das Phänomen der Verringerung der Vermehrungsrate während einer PCR hat mehrere Ursachen. So wird zum einen die Aktivität der Polymerase durch die Bindung an neu synthetisierte Produkte (ab einer Konzentration von ca. 0,3-1 pmol; (MÜLHARDT 2002)) und anfallende Pyrophosphate reduziert. Es konnte diesbezüglich gezeigt werden, dass die Polymerase sequenzunspezifisch an diese neu synthetisierten Produkte bindet (KAINZ 2000). Wenn große Mengen an neu synthetisierten Produkt anfallen, ist die Wahrscheinlichkeit eines Reannealings des neu synthetisierten Produktes größer, als das Annealing zwischen DNAStrang und Primern. Dies wiederum senkt die Effektivität der PCR. Als zweites kommt es zur Zerstörung der Polymerase sowie der dNTPs durch wiederholt hohe Temperaturen während des Denaturierungsschritts. Auch werden im Verlauf der Reaktion dNTPs und Primer durch [Einbau in neusynthetisierte Produkte verbraucht. Diese Reduktion von Reaktionsprodukten führt ebenfalls zum Rückgang der Vermehrungsrate der PCR (KAINZ 2000).]


KAINZ P. (2000) : The PCR plateau phase - towards an understanding of its limitations. Biochim. Biophys. Acta ,1494, 23-7

Tatsächlich liegt der durchschnittliche

[Seite 17]

Multiplikationsfaktor (bezogen auf die Gesamtreaktion) je Zyklus bei ca. 1,6 bis 1,7 (KAINZ 2000). Dies liegt daran, dass die Vermehrungsrate am Ende der PCR geringer ist, als in der Mitte der Zyklenanzahl (Abb. 2.4). Zu Beginn und in der Mitte der Reaktion ist der Multiplikationsfaktor 2 und die Vermehrungsrate ist exponentiell. Gegen Ende geht die Reaktion in eine lineare und schließlich in eine Plateau-Phase über (Abb. 2.4; KAINZ 2000).

[Seite 18]

Ad 58a source.png

Abbildung 2-4: [...]

Das Phänomen der Verringerung der Vermehrungsrate während einer PCR hat mehrere Ursachen. So wird zum einen die Aktivität der Polymerase durch die Bindung an neu synthetisierte Produkte (ab einer Konzentration von ca. 0,3-1 pmol; MÜLHARDT 2002) und anfallende Pyrophosphate reduziert. Es konnte diesbezüglich gezeigt werden, dass die Polymerase sequenzunspezifisch an diese neu synthetisierten Produkte bindet (KAINZ 2000). Wenn große Mengen an neu synthetisierten Produkt anfallen, ist die Wahrscheinlichkeit eines Reannealings des neu synthetisierten Produktes größer, als das Annealing zwischen DNAStrang und Primern. Dies wiederum senkt die Effektivität der PCR. Als zweites kommt es zur Zerstörung der Polymerase sowie der dNTPs durch wiederholt hohe Temperaturen während des Denaturierungsschritts. Auch werden im Verlauf der Reaktion dNTPs und Primer durch Einbau in neusynthetisierte Produkte verbraucht. Diese Reduktion von Reaktionsprodukten führt ebenfalls zum Rückgang der Vermehrungsrate der PCR (KAINZ 2000).


KAINZ P. (2000): The PCR plateau phase - towards an understanding of its limitations. Biochim Biophys Acta, 1494, 23-7.

Anmerkungen

Kein Hinweis auf die Quelle.

Interessanterweise enthält die Publikation Kainz (2000) keine Abbildung, die der Abbildung 3 bei Ad (oder auch der Abbildung 2-4 bei Bente (2003)) in irgendeiner Weise ähnlich ist.

Sichter
(SleepyHollow02), Hindemith

[50.] Ad/Fragment 059 01 - Diskussion
Bearbeitet: 8. July 2014, 09:19 Hindemith
Erstellt: 6. July 2014, 13:44 (SleepyHollow02)
Ad, Bente 2003, Fragment, Gesichtet, KomplettPlagiat, SMWFragment, Schutzlevel sysop

Typus
KomplettPlagiat
Bearbeiter
SleepyHollow02
Gesichtet
Yes.png
Untersuchte Arbeit:
Seite: 59, Zeilen: 1-13
Quelle: Bente 2003
Seite(n): 18, 19, Zeilen: 18: 10 ff.; 19: 1 ff.
[Auch werden im Verlauf der Reaktion dNTPs und Primer durch] Einbau in neusynthetisierte Produkte verbraucht. Diese Reduktion von Reaktionsprodukten führt ebenfalls zum Rückgang der Vermehrungsrate der PCR (KAINZ 2000). Soll RNA in der PCR amplifiziert werden, muss mit dem Enzym Reverse Transkriptase (RNA-ahängige-DNA-Polymerase) zuerst eine komplementäre DNA synthetisiert werden, da RNA nicht als Matrize für die Polymerase geeignet ist. Die dabei entstehenden RNA-DNA-Heteroduplexe dienen als Ausgangsmatrize für eine Amplifikation mittels PCR. Als Primer für die Reverse Transkription kann man Oligo-dT-Primer, Hexamere oder spezifische Primer verwenden („spezifisches Priming“). Bei den Oligo-dT-Primern handelt es sich um kurze Nukleotide, die ausschließlich aus der Base Thymidin bestehen. Sie binden an den Poly-A-Schwanz von zellulären mRNAs und ermöglichen so eine gezielte Amplifikation der mRNAs. Die Reverse Transkription (cDNA-Synthese) ist ein wichtiger Teilschritt in der Amplifizierung der gewünschten Zielsequenz. Die Effizienz der cDNASynthese liegt zwischen 5 und 90 %, je nach Optimierung des Protokolls im Labor (RAPPOLEE 1990). Auch werden im Verlauf der Reaktion dNTPs und Primer durch Einbau in neusynthetisierte Produkte verbraucht. Diese Reduktion von Reaktionsprodukten führt ebenfalls zum Rückgang der Vermehrungsrate der PCR (KAINZ 2000).

[Seite 19]

Soll RNA in der PCR amplifiziert werden, muss mit dem Enzym Reverse Transkriptase (RNA-ahängige-DNA-Polymerase) zuerst eine komplementäre DNA synthetisiert werden, da RNA nicht als Matrize für die Polymerase geeignet ist (KAWASAKI 1989). Die dabei entstehenden RNA-DNA-Heteroduplexe dienen als Ausgangsmatrize für eine Amplifikation mittels PCR. Als Primer für die Reverse Transkription kann man Oligo-dT-Primer, Hexamere oder spezifische Primer verwenden („spezifisches Priming“). Bei den Oligo-dT-Primern handelt es sich um kurze Nukleotide, die ausschließlich aus der Base Thymidin bestehen. Sie binden an den Poly-A-Schwanz von zellulären mRNAs und ermöglichen so eine gezielte Amplifikation der mRNAs. Die Reverse Transkription (cDNA-Synthese) ist ein wichtiger Teilschritt in der Amplifizierung der gewünschten Zielsequenz. Die Effizienz der cDNASynthese liegt zwischen 5 und 90 %, je nach Optimierung des Protokolls im Labor (RAPPOLEE 1990).

Anmerkungen

Kein Hinweis auf die Quelle.

Sichter
(SleepyHollow02), Hindemith

[51.] Ad/Fragment 059 14 - Diskussion
Bearbeitet: 9. July 2014, 19:56 Hindemith
Erstellt: 7. July 2014, 13:48 (SleepyHollow02)
Ad, Becker 1999, Fragment, Gesichtet, SMWFragment, Schutzlevel sysop, Verschleierung

Typus
Verschleierung
Bearbeiter
SleepyHollow02
Gesichtet
Yes.png
Untersuchte Arbeit:
Seite: 59, Zeilen: 14-31
Quelle: Becker 1999
Seite(n): 20, 21 f, 23, Zeilen: 20 unten, 21: 1 ff; 21 unten - 22: 1 ff.; 23: 1 ff.
Mit der Einführung der PCR in die molekularbiologischen Techniken stand zum erstenmal eine dynamische Methode der DNA-Vermehrung zur Verfügung.

2.16.2 PCR-Methoden zur Quantifizierung

Kinetische PCR

Für das Design der PCR stehen verschiedene theoretische Ansätze zur Verfügung. Die einfachste Methode ist, die PCR in mehreren Ansätzen getrennt und mit variierenden Zyklenzahlen durchzuführen, die Produkte aufzutrennen und zu quantifizieren. Beim Plotting mehrerer Zyklen versus der Produktmenge kann man auf die Menge an gesuchter DNA (target-DNA) zurückzuschließen. Diese Methode wird auch als kinetische qPCR bezeichnet (KÖHLER et al. 1995)

Kompetitive PCR

Die kompetitive PCR ist eine der älteren etablierten Methoden in der Reihe der qPCRs. Einen Erstbeschreiber festzulegen, ist nicht ohne weiteres möglich. Die ersten Publikationen zu diesem Thema erschienen 1989. BECKER-ANDRE und HAHLBROCK 1989, koamplifizierten ein um ein Basenpaar verändertes DNA-Fragment. Sie führten damit eine neue Restriktionsschnittstelle ein, welche im Wildtyp nicht vorhanden war. Damit konnten sie die entstandenen Produkte über eine Restriktionsendonukleasebehandlung eindeutig als Standard oder Wildtyp identifizieren. KELLOGG et al., (1990), quantifizierten HIV I-DNA [durch Koamplifikation mit einer Sequenz des DQ alpha locus der HLA-Region.]

Mit der Einführung der PCR in die molekularbiologischen Techniken stand zum erstenmal eine dynamische Methode der Quantitierung zur

[Seite 21]

Verfügung.

[...]

1.4.3.1 Kinetische PCR

Für das Design der PCR stehen verschiedene theoretische Ansätze zur Verfügung. Die einfachste Methode ist, die PCR in mehreren Ansätzen getrennt und mit variierenden Zyklenzahlen durchzuführen, die Produkte aufzutrennen und zu

[Seite 22]

quantifizieren. Beim Plotting mehrerer Zyklen versus der Produktmenge kann man auf die Menge an target-DNA zurückzuschließen (s. a. Abbildung 2). Diese Methode wird auch als kinetische qPCR bezeichnet (Köhler, 1995, S.7f).

[Seite 23]

1.4.3.4 Kompetitive PCR

Die kompetitive PCR ist eine der älteren etablierten Methoden in der Reihe der qPCRs. Einen Erstbeschreiber festzulegen ist nicht ohne weiteres möglich. Die ersten Publikationen zu diesem Thema erschienen 1989. Becker-Andre, M. et al., 1989, koamplifizierten ein um ein Basenpaar verändertes DNA-Fragment. Sie führten damit eine neue Restriktionsschnittstelle ein, welche im Wildtyp nicht vorhanden war. Damit konnten sie die entstandenen Produkte über eine Restriktionsendonukleasebehandlung eindeutig als Standard oder Wildtyp identifizieren. Kellogg et al., 1990, quantitierten HIV I-DNA durch Koamplifikation mit einer Sequenz des DQ alpha locus der HLA-Region.

Anmerkungen

Kein Hinweis auf die Quelle.

Sichter
(SleepyHollow02) Schumann

[52.] Ad/Fragment 060 01 - Diskussion
Bearbeitet: 9. July 2014, 23:51 Hindemith
Erstellt: 7. July 2014, 14:04 (SleepyHollow02)
Ad, Becker 1999, Fragment, Gesichtet, KomplettPlagiat, SMWFragment, Schutzlevel sysop

Typus
KomplettPlagiat
Bearbeiter
SleepyHollow02
Gesichtet
Yes.png
Untersuchte Arbeit:
Seite: 60, Zeilen: 1 ff. (kpl.)
Quelle: Becker 1999
Seite(n): 22, 23, Zeilen: 22: 18 ff.; 23: 8 ff.
[KELLOGG et al., (1990), quantifizierten HIV I-DNA] durch Koamplifikation mit einer Sequenz des DQ alpha locus der HLA-Region. Es ist nicht von Relevanz, ob es sich ursprünglich um RNA oder DNA handelt, denn RNA muß praktisch immer zuerst durch reverse Transkription (RT) in DNA umgewandelt werden, um eine PCR

durchzuführen. Bei einer kompetitiven PCR gibt es zusätzlich zur target-DNA-Region eine zweite DNA-Sequenz (der sogenannte Standard), welche gleichzeitig in dem gleichen Reaktionsansatz amplifiziert wird. In den frühen Arbeiten über qPCR wurde oft ein endogenes housekeeping gene (Referenzgen) koamplifiziert. Später ging man meist zu künstlich hergestellten Fragmenten über. Man amplifiziert eine target-DNA gleichzeitig mit einem Standard. Dieser Standard muß gut von den Produkten der target-DNA separierbar sein. Dies wird meistens durch eine identische Sequenz mit einer künstlich eingebauten Deletion oder Insertion von einigen Basenpaaren erreicht. Dann lassen sich die DNAFragmente z.B. über ein Gel durch Laufzeitunterschiede auftrennen. Die Menge der zugesetzten Standard-DNA kann dann so variiert werden, daß in etwa gleiche Mengen an target-Produkt als auch Standard-Produkt entstehen. Unter der Voraussetzung, daß beide nur geringfügig unterschiedliche Fragmente mit einer vergleichbaren Effektivität amplifiziert werden, kann man sagen, dass beide in dergleichen Menge vor der PCR vorhanden waren. Diese Aussagen müssen mit Plotmethoden überprüft werden, damit man von einer gewissen Zuverlässigkeit dieser Methode ausgehen kann. Zu diesem Thema wurde mittlerweile eine Anzahl von theoretischen Ansätzen publiziert (RAEYMAEKERS 1993; CONNOLLY et al. 1995).

Limiting dilution PCR

Die PCR ist unter extrem optimierten Bedingungen fähig einzelne DNA-Moleküle zu Signal zu amplifizieren. 1992 wurde von SYKES et al. die Idee zur Quantifizierung unter dem Stichwort limiting dilution qPCR genutzt. Im Prinzip wird die zu quantifizierende Menge an target-DNA in entsprechend kleinen Schritten verdünnt und mit PCR amplifiziert. Bei einem oder auch mehr vorhandenen target-DNA-Molekülen wird ein PCR-Produkte erhalten. Ist die Verdünnung jedoch so stark, dass statistisch gesehen kein einziges DNA-Molekül vorhanden ist, gibt es keine PCR-Produkte mehr. Die Messergebnisse dieser Methode sind also diskrete Alles-oder-Nichts-Werte. Um diese Alles-oder-Nichts-Werte in reale Mengen umzuwandeln, verwendet man eine statistische Methode, die sogenannte Poisson-Verteilung. Die Poisson- Verteilung wird bei sehr seltenen, asymmetrischen und diskreten Ereignissen angewendet (Wissenschaftliche Tabellen. Geygy,1985, S.225)

1.4.3.3 Limiting dilution PCR

Die PCR ist unter extrem optimierten Bedingungen fähig einzelne DNA-Moleküle zu einem Signal zu amplifizieren. 1992 wurde von Sykes et al. die Idee zur Quantitierung unter dem Stichwort limiting dilution qPCR genutzt. Im Prinzip wird die zu quantitierende Menge an target-DNA in entsprechend kleinen Schritten verdünnt und mit PCR amplifiziert. Bei einem oder auch mehr vorhandenen target-DNA-Molekülen wird ein PCR-Produkte erhalten. Ist die Verdünnung jedoch so stark, daß statistisch gesehen kein einziges DNA-Molekül vorhanden ist, gibt es keine PCR-Produkte mehr. Die Messergebnisse dieser Methode sind also diskrete Alles-oder-Nicht-Werte. Um diese Alles-oder-Nicht-Werte in reale Mengen umzuwandeln, verwendet man eine statistische Methode die sogenannte Poisson-Verteilung. Die Poisson-Verteilung wird bei sehr seltenen, asymmetrischen und diskreten Ereignissen angewendet (Wissenschaftliche Tabellen Geigy,.1985, S. 225).

[Seite 23:]

Kellogg et al., 1990, quantitierten HIV I-DNA durch Koamplifikation mit einer Sequenz des DQ alpha locus der HLA-Region. Für unsere Überlegungen ist es nicht von Relevanz, ob es sich um RNA oder DNA handelt, denn RNA muß praktisch immer zuerst durch reverse Transkription (RT) in DNA umgewandelt werden, um eine PCR durchzuführen. Bei einer kompetitiven PCR gibt es zusätzlich zur target-DNA-Region eine zweite DNA-Sequenz (der sogenannte Standard), welche gleichzeitig in dem gleichen Reaktionsansatz amplifiziert wird. In den frühen Arbeiten über qPCR wurde oft ein endogenes housekeeping gene koamplifiziert. Später ging man meist zu künstlich hergestellten Fragmenten über.

Man amplifiziert eine target-DNA gleichzeitig mit einem Standard. Dieser Standard muß gut von den Produkten der target-DNA separierbar sein. Dies wird meistens durch eine identische Sequenz mit einer künstlich eingebauten Deletion oder Insertion von einigen Basenpaaren erreicht. Dann lassen sich die DNA-Fragmente z.B. über ein Gel durch Laufzeitunterschiede auftrennen. Die Menge der zugesetzten Standard- DNA kann dann so variiert werden, daß in etwa gleiche Mengen an target-Produkt als auch Standard-Produkt entstehen. Unter der Voraussetzung, daß beide nur geringfügig unterschiedliche Fragmente mit einer vergleichbaren Effektivität amplifiziert werden, kann man sagen, daß beide in dergleichen Menge vor der PCR vorhanden waren. Diese Aussagen müssen mit bestimmten Plotmethoden überprüft werden, damit man von einer gewissen Zuverlässigkeit dieser Methode ausgehen kann. Zu diesem Thema wurde mittlerweile eine Anzahl von theoretischen Ansätzen publiziert. (Raeymaekers, 1993; Connolly et al., 1995).

Anmerkungen

Kein Hinweis auf die Quelle.

Sichter
(SleepyHollow02), Hindemith

[53.] Ad/Fragment 061 01 - Diskussion
Bearbeitet: 9. July 2014, 23:53 Hindemith
Erstellt: 7. July 2014, 14:42 (SleepyHollow02)
Ad, Becker 1999, Fragment, Gesichtet, SMWFragment, Schutzlevel sysop, Verschleierung

Typus
Verschleierung
Bearbeiter
SleepyHollow02
Gesichtet
Yes.png
Untersuchte Arbeit:
Seite: 61, Zeilen: 1-23
Quelle: Becker 1999
Seite(n): 24, 25, Zeilen: 24: 1 ff.; 25: 1 ff.
2.16.3 Die Messwertbestimmung von PCR-Produkten (Quantifizierung)

Zur Bestimmung von Messwerten aus den PCR-Produkten gibt es verschiedene Verfahren mit unterschiedlichen Vorteilen und Problemen. Insgesamt gibt es auch im Forschungsbereich eine Tendenz zu toxikologisch unbedenklichen Verfahren, die dennoch durch gleichzeitig verbesserte Techniken immer sensitiver werden.

Radioaktivität

Eine der ersten Methoden zur Quantifizierung war die Verwendung von Radioaktivität. Am einfachsten ist die Zugabe einer geringen Menge eines radioaktiven dNTPs zur PCR. Das Nukleotid wird während der PCR in das Produkt eingebaut. Über einen Szintillationszähler kann die Radioaktivität danach gemessen werden (SEIBEL et al. 1991). Von der Verwendung von Radioaktivität ist man heute eher abgekommen. Nicht-radioaktive Methoden sind von vergleichbarer Qualität und umgehen die umständliche Handhabung sowie die Entsorgung.

ELISA

ALARD stellt 1993 eine qPCR-Methode vor, welche biotinylierte Primer verwendet. Diese werden dann über einen ELISA optisch quantifiziert. Sie konnten IL2 mRNA aus 40 Jurkat Zellen quantifizieren.

Anfärbung durch Fluoreszenzfarbstoffe und densitometrische Analyse

Die Auftrennung verschiedener DNA-Fragmente mit Hilfe eines Gels und anschließende Färbung mit einem Fluoreszenzfarbstoff, meist Ethidiumbromid, ist heute eine molekularbiologische Standardmethode. Diese Methode kann einfach zur Bestimmung bei der kompetitiven PCR eingesetzt werden (CHEHADEH et al. 1995). Wegen der mangelnden Sensitivität kann sie jedoch nicht zur Bestimmung von PCR-Produkten bei der kinetischen PCR eingesetzt werden.

1.4.4 Die Messwertbestimmung von PCR-Produkten (Quantifizierung)

Zur Bestimmung von Messwerten aus den PCR-Produkten gibt es verschiedene Verfahren mit unterschiedlichen Vorteilen und Problemen. Insgesamt gibt es auch im Forschungsbereich eine Tendenz zu toxikologisch unbedenklichen Verfahren, die dennoch durch gleichzeitig verbesserte Techniken immer sensitiver werden.

1.4.4.1 Radioaktivität

Eine der ersten Methoden zur Quantifizierung war die Verwendung von Radioaktivität. Am einfachsten ist die Zugabe einer geringen Menge eines radioaktiven dNTPs zur PCR. Das Nukleotid wird während der PCR in das Produkt eingebaut. Über einen Szintillationszähler kann die Radioaktivität danach gemessen werden (Seibel, et al., 1991 a). Von der Verwendung von Radioaktivität ist man heute eher abgekommen. Nicht-radioaktive Methoden sind von vergleichbarer Qualität und umgehen das umständliche handling sowie die Entsorgung.

1.4.4.2 Antikörper

Alard stellt 1993 eine qPCR-Methode vor, welche biotinylierte Primer verwendet. Diese werden dann über einen ELISA optisch quantifiziert. Sie konnten bis zu 16 pg eines 250 bp-Fragmentes nachweisen.

[Seite 25:]

1.4.4.4 Anfärbung durch Fluoreszenzfarbstoffe

Die Auftrennung verschiedener DNA-Fragment mit Hilfe eines Gels und anschließende Färbung mit einem Fluoreszenzfarbstoffs, meist Ethidiumbromid, ist heute eine molekularbiologische Standardmethode. Sie eignet sich zum Vergleichen etwa gleicher, großer Mengen an DNA. Diese Methode kann einfach zur Bestimmung bei der kompetitiven PCR eingesetzt werden (Chehadeh et al., 1995). Wegen der mangelnden Sensitivität kann sie jedoch nicht zur Bestimmung von PCR-Produkten bei der kinetischen PCR eingesetzt werden.

Anmerkungen

Kein Hinweis auf die Quelle.

Sichter
(SleepyHollow02), Hindemith

[54.] Ad/Fragment 061 24 - Diskussion
Bearbeitet: 8. July 2014, 09:23 Hindemith
Erstellt: 6. July 2014, 14:11 (SleepyHollow02)
Ad, Bente 2003, Fragment, Gesichtet, KomplettPlagiat, SMWFragment, Schutzlevel sysop

Typus
KomplettPlagiat
Bearbeiter
SleepyHollow02
Gesichtet
Yes.png
Untersuchte Arbeit:
Seite: 61, Zeilen: 24-31
Quelle: Bente 2003
Seite(n): 19, Zeilen: 26 ff.
Eine Quantifizierung der Ausgangsmenge an RNA bzw. DNA kann nach einer PCR durch die Bestimmung der Dicke der Banden im Agarose-Gel erfolgen. Diese Extrapolation ist nicht in jedem Fall korrekt. Es handelt sich hierbei um die Endpunktbetrachtung einer PCR. Die Kinetik der Reaktion (z.B. Variationen der Effektivität) wird dabei nicht beachtet. Die Effektivität kann durch unterschiedliche Faktoren beeinflusst werden wie z.B. Primer- und Pufferkonzentrationen. Auch der Zeitpunkt der Durchführung kann eine Rolle spielen. Variationen in der Qualität und in den Volumina der einzelnen Reaktionskomponenten (bedingt durch Pipettierfehler), sowie Variationen im Temperaturprofil des Thermocycler [führen zu einer Variation der Effektivität der PCR von Lauf zu Lauf.] Eine Quantifizierung der Ausgangsmenge an RNA bzw. DNA kann nach einer PCR durch die Bestimmung der Dicke der Banden im Agarose-Gel erfolgen. Diese Extrapolation ist nicht in jedem Fall korrekt. Es handelt sich hierbei um die Endpunktbetrachtung einer PCR. Die Kinetik der Reaktion (z.B. Variationen der Effektivität) wird dabei nicht beachtet. Die Effektivität kann durch unterschiedliche Faktoren beeinflusst werden: wie z.B. Primer- und Pufferkonzentrationen. Auch der Zeitpunkt der Durchführung kann eine Rolle spielen. Variationen in der Qualität und in den Volumina der einzelnen Reaktionskomponenten (bedingt durch Pipettierfehler), sowie Variationen im Temperaturprofil des Thermocyclers, führen zu einer Variation der Effektivität der PCR von Lauf-zu-Lauf.
Anmerkungen

Kein Hinweis auf die Quelle.

Sichter
(SleepyHollow02), Hindemith

[55.] Ad/Fragment 062 01 - Diskussion
Bearbeitet: 8. July 2014, 09:40 Hindemith
Erstellt: 6. July 2014, 14:22 (SleepyHollow02)
Ad, Bente 2003, Fragment, Gesichtet, SMWFragment, Schutzlevel sysop, Verschleierung

Typus
Verschleierung
Bearbeiter
SleepyHollow02
Gesichtet
Yes.png
Untersuchte Arbeit:
Seite: 62, Zeilen: 1 ff. (komplett)
Quelle: Bente 2003
Seite(n): 19 f., Zeilen: 19: 32 ff.; 20: 1 ff.
[Variationen in der Qualität und in den Volumina der einzelnen Reaktionskomponenten (bedingt durch Pipettierfehler), sowie Variationen im Temperaturprofil des Thermocyclers,] führen zu einer Variation der Effektivität der PCR von Lauf zu Lauf. Daher ist es durchaus möglich, dass eine Probe A mit einer geringeren Menge an Nukleinsäure aufgrund einer höheren Effektivität der PCR als Probe B bei der Auswertung eine stärkere Bande zeigt als Probe B (Abbildung 4).

Ad 62a diss.png

Abbildung 4: Problem der Endpunktquantifizierung in der PCR: Trotz einer größeren Menge an Ausgangsnukleinsäure wird am Ende der PCR für Probe B eine schwächere Bande im Agarose-Gel sichtbar als für Probe A.

Eine nahezu korrekte Quantifizierung der Ausgangsmenge ist daher nur in einer real-time Auswertung möglich, da die Kinetik der PCR hier direkt verfolgbar ist.

Variationen in der Qualität und in den Volumina der einzelnen Reaktionskomponenten (bedingt durch Pipettierfehler), sowie Variationen im Temperaturprofil des Thermocyclers, führen zu einer Variation der Effektivität der PCR von Lauf-zu-Lauf. Daher ist es durchaus möglich, dass eine Probe A mit einer geringeren Menge an Nukleinsäure aufgrund einer höheren Effektivität der PCR als Probe B bei der Auswertung eine stärkere Bande zeigt als Probe B (Abb. 2.5).

[Seite 20]

Ad 62a source.png

Abbildung 2-5: Problem der Endpunktquantifizierung in der PCR: Trotz einer größeren Menge an Ausgangsnukleinsäure wird am Ende der PCR für Probe B eine schwächere Bande im Agarose-Gel sichtbar als für Probe A.

Eine nahezu korrekte Quantifizierung der Ausgangsmenge ist daher nur in einer real-time Auswertung (vgl.2.3.8) möglich, da die Kinetik der PCR hier verfolgbar ist.

Anmerkungen

Kein Hinweis auf die Quelle.

Sichter
(SleepyHollow02), Hindemith

[56.] Ad/Fragment 063 01 - Diskussion
Bearbeitet: 10. July 2014, 14:21 Schumann
Erstellt: 6. July 2014, 14:29 (SleepyHollow02)
Ad, Bente 2003, Fragment, Gesichtet, KomplettPlagiat, SMWFragment, Schutzlevel sysop

Typus
KomplettPlagiat
Bearbeiter
SleepyHollow02
Gesichtet
Yes.png
Untersuchte Arbeit:
Seite: 63, Zeilen: 1 ff. (komplett)
Quelle: Bente 2003
Seite(n): 35, Zeilen: 1 ff.
2.16.4 Quantitative real-time Polymerasekettenreaktion (QRT-PCR)

Einleitung

Die quantitative real-time PCR ist eine relativ neue Technik, die zu Beginn der 1990er Jahre entwickelt wurde und seit ca. acht Jahren für den kommerziellen Markt verfügbar ist. Einen starken Anstieg der Nutzung dieser Methode gab es in den letzten drei Jahren. Während die Anzahl der Veröffentlichungen in der internationalen Datenbank Medline 1996 19, 1997 28 und 1998 52 betrug, stieg die Zahl 1999 auf 157, 2000 auf 409 und im Jahre 2001 sogar auf 551 (SCHMITTGEN 2001). Die Technologie kombiniert die DNA Amplifikation (PCR) mit der Detektion des Produktes in einem einzigen Reaktionsgefäß vom Ansatz bis zur Auswertung. Durch das Wegfallen der zeitaufwendigen Auswertung mittels Agarose- Gelelektrophorese bietet diese Methode ferner eine beachtliche Zeitersparnis. Bei der Entwicklung dieser Technik war die Grundidee der Versuch, die Amplifikation des PCR Produktes „live“ zu beobachten. Die ersten Ansätze bestanden darin, die PCR alle fünf Zyklen zu stoppen, ein Aliquot zu entnehmen und auszuwerten (GINZINGER 2001). Dieser Ansatz war, insbesondere bei hohem Probenaufkommen, sehr zeit- und arbeitsaufwendig und barg zudem ein hohes Kontaminationsrisko. Weiterführende Arbeiten beschäftigten sich mit der Markierung der DNA-Fragmente während der Reaktion. Anfang der 1990er wurde festgestellt, dass man über die 5` - 3`Exonuklease Aktivität der Taq-Polymerase eine indirekte Aussage über die Zunahme der Amplifikate während der PCR machen kann. Zu diesem Zweck wurden radioaktiv markierte Sonden verwendet, die mit den Amplifikaten hybridisierten und durch die Taq-Polymerase enzymatisch gespalten wurden (HOLLAND et al. 1991). Vier Jahre später konnten die radioaktiv markierten Sonden durch Fluorochrom-markierte Sonden ersetzt werden (LEE et al. 1995). Zur selben Zeit zeigte eine andere Forscher, dass auch eine direkte Messung der entstehenden Produkte während der PCR mittels Verwendung interkalierender Farbstoffe möglich ist (HIGUCHI et al.1992, 1993). Bei beiden Entwicklungen erfolgte die Auswertung durch Messung der Fluoreszenz vor und nach der PCR-Reaktion in einem separaten Gefäß. Durch die Kombination eines Thermocyclers mit einer Lichtquelle in Form einer Halogenlampe, eines Lasers oder LEDs (Licht emittierende Diode) sowie eines optischen Detektionsmoduls, konnte nur wenige Jahre später, die Fluoreszenz auch während der laufenden PCR gemessen werden. Eine Auswertung in [Echtzeit (engl.: real-time) war nun möglich (ISHIGURO et al. 1995; WITTWER et al.1997).]


SCHMITTGEN TD. (2001) : Real-time quantitative PCR. Methods ,253, 83-5

[...]

2.3 Quantitative real-time Polymerasekettenreaktion (QRT-PCR)

2.3.1 Einleitung

Die quantitative real-time PCR ist eine relativ neue Technik, die zu Beginn der 1990er Jahre entwickelt wurde und seit ca. sechs Jahren für den kommerziellen Markt verfügbar ist. Einen starken Anstieg der Nutzung dieser Methode gab es in den letzten drei Jahren. Während die Anzahl der Veröffentlichungen in der internationalen Datenbank Medline 1996 19, 1997 28 und 1998 52 betrug, stieg die Zahl 1999 auf 157, 2000 auf 409 und im Jahre 2001 sogar auf 551 (SCHMITTGEN 2002). Die Technologie kombiniert die DNA Amplifikation (PCR) mit der Detektion des Produktes in einem einzigen Reaktionsgefäß vom Ansatz bis zur Auswertung. Durch das Wegfallen der zeitaufwendigen Auswertung mittels Agarose- Gelelektrophorese bietet diese Methode ferner eine erhöhte Zeitersparnis. Bei der Entwicklung dieser Technik war die Grundidee der Versuch, die Amplifikation des PCR-Produktes „live“ zu beobachten. Die ersten Ansätze bestanden darin, die PCR alle fünf Zyklen zu stoppen, ein Aliquot zu entnehmen und auszuwerten (GINZINGER 2001). Dieser Ansatz war, insbesondere bei hohem Probenaufkommen, sehr zeit- und arbeitsaufwendig und barg zudem ein hohes Kontaminationsrisko. Weiterführende Arbeiten beschäftigten sich mit der Markierung der DNA-Fragmente während der Reaktion. Anfang der 1990er wurde festgestellt, dass man über die 5` - 3`Exonuklease Aktivität der Taq-Polymerase eine indirekte Aussage über die Zunahme der Amplifikate während der PCR machen kann. Zu die Zweck wurden radioaktiv markierte Sonden verwendet, die mit den Amplifikaten hybridisierten und durch die Taq-Polymerase enzymatisch gespalten wurden (HOLLAND et al. 1991). Vier Jahre später konnten die radioaktiv markierten Sonden durch Fluorochrom-markierte Sonden ersetzt werden (LEE et al. 1995). Zur selben Zeit zeigte eine andere Forschungsgruppe, dass auch eine direkte Messung der entstehenden Produkte während der PCR mittels Verwendung interkalierender Farbstoffe möglich ist (HIGUCHI et al. 1992, 1993). Bei beiden Entwicklungen erfolgte die Auswertung durch Messung der Fluoreszenz vor und nach der PCR-Reaktion in einem separaten Gefäß. Durch die Kombination eines Thermocyclers mit einer Lichtquelle in Form einer Halogenlampe, eines Lasers oder LEDs (Licht emittierende Diode) sowie eines optischen Detektionsmoduls, konnte nur wenige Jahre später, die Fluoreszenz auch während der laufenden PCR gemessen werden. Eine Auswertung in Echtzeit (engl.: real-time) war nun möglich (ISHIGURO et al. 1995; WITTWER et al. 1997).


SCHMITTGEN T. D. (2001): Real-time quantitative PCR. Methods, 25, 383-5.

Anmerkungen

Kein Hinweis auf die Quelle. Die Eigenleistung beschränkt sich auf eine Aktualisierung ("seit ca. 8 Jahren" statt "seit ca. sechs Jahren") und die Korrektur einer Quellenangabe.

Sichter
(SleepyHollow02), Hindemith

[57.] Ad/Fragment 064 01 - Diskussion
Bearbeitet: 8. July 2014, 09:57 Hindemith
Erstellt: 6. July 2014, 14:40 (SleepyHollow02)
Ad, Bente 2003, Fragment, Gesichtet, KomplettPlagiat, SMWFragment, Schutzlevel sysop

Typus
KomplettPlagiat
Bearbeiter
SleepyHollow02
Gesichtet
Yes.png
Untersuchte Arbeit:
Seite: 64, Zeilen: 1 ff. (komplett)
Quelle: Bente 2003
Seite(n): 35, 36, 38, Zeilen: 35: 30 ff.; 36: 1 ff.; 38: 11 ff.
[Eine Auswertung in] Echtzeit (engl.: real-time) war nun möglich (ISHIGURO et al. 1995; WITTWER et al.1997). Die Visualisierung des Amplikons ist grundsätzlich mit zwei verschiedenen Fluoreszenzdetektionssystemen möglich: Einem nicht spezifischen Detektionssystem, welches auf der Markierung des Amplikons durch interkalierende Farbstoffe basiert, und einem spezifischen Detektionssystem, das fluoreszenzmarkierte Sonden verwendet. Beide Detektionsmethoden beruhen auf der Tatsache, dass der Anstieg der Fluoreszenz proportional zum Anstieg der Konzentration des Amplifikationsproduktes ist. Aufgrund einer Proportionalität der Fluoreszenz und der entstehenden Amplifikate ist zudem eine Quantifizierung der Ausgangs-DNA möglich. Die während des Amplifikationsprozesses emittierte Fluoreszenz wird während jedes PCR-Zyklus gemessen und ermöglicht so eine graphische Darstellung der Amplifikation, die es dem Anwender erlaubt, die Reaktion in Echtzeit zu beobachten. Da sich die Kinetik der PCR-Reaktion beobachten lässt, wird manchmal auch der Begriff kinetische PCR verwendet (WALKER 2002; LEUTENEGGER 2001).

Detektionssystem mit interkalierenden Farbstoffen

Interkalierende Farbstoffe waren der erste Entwicklungsschritt zur Visualisierung des entstehenden Amplikons (HIGUCHI et al. 1992, 1993). Sie emittieren, nach Anregung durch energiereiches UV-Licht, Licht im sichtbaren energieärmeren Wellenlängenbereich (Fluoreszenz). Liegt der Farbstoff frei vor, ist die Emission sehr gering. Erst durch die Interkalierung des Farbstoffs in die kleine Windung der doppelsträngigen DNA wird die Lichtemission verstärkt (HIGUCHI et al. 1992, 1993). Die Fähigkeit des Farbstoffs zur Einlagerung in die kleinen Windungen der DNA ist auf seinen planaren Molekülaufbau zurückzuführen (Abb.5). Der für diese Zwecke als erstes genutzte Farbstoff war Ethidiumbromid. Inzwischen ist dieser Farbstoff von anderen Farbstoffen wie z.B. Hoechst 33258, Yo-Pro-1 oder SYBR Green™ (MOLECULAR PROBES INC.) aufgrund eines besseren Signal-Hintergrund-Verhältnisses ersetzt worden. Der am meisten verwendete Farbstoff ist SYBR Green™, der eine Anregungswellenlänge von 497 nm und eine Emissionswellenlänge von 520 nm besitzt (HIGUCHI et al. 1992, 1993).

Eine Auswertung in Echtzeit (engl.: real-time) war nun möglich (ISHIGURO et al. 1995; WITTWER et al. 1997).

Die Visualisierung des Amplikons ist grundsätzlich mit zwei verschiedenen Fluoreszenzdetektionssystemen möglich: einem nichtspezifisches Detektionssystem, welches auf der Markierung des Amplikons durch interkalierende Farbstoffe basiert, und einem spezifisches Detektionssystem, das fluoreszenzmarkierte Sonden verwendet. Beide Detektionsmethoden beruhen auf der Tatsache, dass der Anstieg der Fluoreszenz proportional zum Anstieg der Konzentration des Amplifikationsproduktes ist. Aufgrund einer

[Seite 36:]

Proportionalität der Fluoreszenz und der entstehenden Amplifikate ist zudem eine Quantifizierung der Ausgangs-DNA möglich. Die während des Amplifikationsprozesses emittierte Fluoreszenz wird während jedes PCR-Zyklus gemessen und ermöglicht so eine graphische Darstellung der Amplifikation, die es dem Anwender erlaubt, die Reaktion in Echtzeit zu beobachten. Da sich die Kinetik der PCR-Reaktion beobachten lässt, wird manchmal auch der Begriff kinetische PCR verwendet (WALKER 2002; LEUTENEGGER 2001).

[Seite 38:]

2.3.3.1 Interkalierende Farbstoffe

Interkalierende Farbstoffe waren der erste Entwicklungsschritt zur Visualisierung des entstehenden Amplikons (HIGUCHI et al. 1992, 1993). Sie emittieren, nach Anregung durch energiereiches UV-Licht, Licht im sichtbaren energieärmeren Wellenlängenbereich (Fluoreszenz). Liegt der Farbstoff frei vor, ist die Emission sehr gering. Erst durch die Interkalierung des Farbstoffs in die kleine Windung der doppelsträngigen DNA wird die Lichtemission stark verstärkt (HIGUCHI et al. 1992, 1993). Die Fähigkeit des Farbstoffs zur Einlagerung in die kleinen Windungen der DNA ist auf seinen planaren Molekülaufbau zurückzuführen (Abb. 2.6). Der für diese Zwecke als erstes genutzte Farbstoff war Ethidiumbromid. Inzwischen ist dieser Farbstoff von anderen Farbstoffen wie z.B. Hoechst 33258, Yo-Pro-1 oder SYBR Green™ (MOLECULAR PROBES INC.) aufgrund eines besseren Signal-Hintergrund-Verhältnisses ersetzt worden. Der am meisten verwendete Farbstoff ist SYBR Green™, der eine Anregungswellenlänge von 497 nm und eine Emissionswellenlänge von 520 nm besitzt (HIGUCHI et al. 1992, 1993).

Anmerkungen

Kein Hinweis auf die Quelle.

Sichter
(SleepyHollow02), Hindemith

[58.] Ad/Fragment 065 02 - Diskussion
Bearbeitet: 8. July 2014, 10:04 Hindemith
Erstellt: 6. July 2014, 14:53 (SleepyHollow02)
Ad, Bente 2003, Fragment, Gesichtet, SMWFragment, Schutzlevel sysop, Verschleierung

Typus
Verschleierung
Bearbeiter
SleepyHollow02
Gesichtet
Yes.png
Untersuchte Arbeit:
Seite: 65, Zeilen: 1-21
Quelle: Bente 2003
Seite(n): 39, Zeilen: 1 ff.
[ABBILDUNG]

Die Vorteile dieser Farbstoffe sind, dass sie preisgünstig sind und eine universelle Verwendbarkeit haben, da mit ihnen prinzipiell jede PCR verfolgt werden kann (BUSTIN 2000). Außerdem haben sie eine hohe Signalstärke, weil jedes DNA-Molekül mehrere Farbstoffmoleküle bindet. Aus den Vorteilen resultiert aber auch ein großer Nachteil: Durch diese Farbstoffe kann man prinzipiell nicht zwischen korrektem Produkt und Artefakten (wie z.B. Primerdimern) unterscheiden. Entstehende Primerdimer und andere Artefakte binden ebenfalls SYBR Green™ und führen somit zu einem unspezifischen Anstieg der Fluoreszenz auch in negativen Proben (VANDESOMPELE et al. 2002). Eine klare Differenzierung zwischen Primerdimer bzw. Artefakt und Zielfragment ist daher zwingend notwendig (VANDESOMPELE et al. 2002).

Diesem Umstand wurde bei den interkalierenden Farbstoffen mit Hilfe der Schmelzpunktanalyse entgegen gewirkt (Abb.6): Dazu wird eine Schmelzpunktanalyse des Produkts am Ende der eigentlichen PCR durchgeführt (RIRIE et al. 1997). Das Reaktionsgemisch wird dabei in 1 °C Schritten von 50 °C auf 95 °C erhitzt und kontinuierlich die Fluoreszenz gemessen. Der Punkt, an dem doppelsträngige DNA schmilzt, ist durch einen Abfall (Peak) der Fluoreszenz des interkalierenden Farbstoffes gekennzeichnet, da der interkalierenden Farbstoff von der einzelsträngigen DNA dissoziiert (Abb.6). Wenn die PCR optimal eingestellt ist, sollte ein Schmelzpunktpeak zu erwarten sein, der spitz zuläuft. Dieser Schmelzpunkt stellt das spezifische, zu erwartende Produkt dar. Unterschiedlich große Produkte und Produkte anderer Sequenz haben unterschiedliche Schmelzpunkte (Abbildung 6). Trägt man die Fluoreszenz gegen die Temperatur grafisch auf, so kann man den [Fluoreszenzabfall beider Produkte als zwei getrennte Schmelzpunkte wahrnehmen (Abbildung 6).]

Die Vorteile dieser Farbstoffe sind, dass sie preisgünstig sind und eine universelle Verwendbarkeit haben, da mit ihnen prinzipiell jede PCR verfolgt werden kann (BUSTIN 2000). Außerdem haben sie eine hohe Signalstärke, weil jedes DNA-Molekül mehrere Farbstoffmoleküle bindet. Aus den Vorteilen resultiert aber auch ein großer Nachteil: Durch diese Farbstoffe kann man prinzipiell nicht zwischen korrektem Produkt und Artefakten (wie z.B. Primerdimern) unterscheiden. Entstehende Primerdimer und andere Artefakte binden ebenfalls SYBR Green™ und führen somit zu einem unspezifischen Anstieg der Fluoreszenz auch in negativen Proben (VANDESOMPELE et al. 2002). Eine klare Differenzierung zwischen Primerdimer bzw. Artefakt und Zielfragment ist daher zwingend notwendig (VANDESOMPELE et al. 2002).

Diesem Umstand wurde bei den interkalierenden Farbstoffen mit Hilfe der Schmelzpunktanalyse entgegen gewirkt (Abb. 2.7): Dazu wird eine Schmelzpunktanalyse des Produkts am Ende der eigentlichen PCR durchgeführt (RIRIE et al. 1997). Das Reaktionsgemisch wird dabei in 1 °C Schritten von 50 °C auf 95 °C erhitzt und kontinuierlich die Fluoreszenz gemessen. Der Punkt, an dem doppelsträngige DNA schmilzt, ist durch einen Abfall (Peak) der Fluoreszenz des interkalierenden Farbstoffes gekennzeichnet, da der interkalierenden Farbstoff von der einzelsträngigen DNA dissoziiert (Abb. 2.7, 2). Wenn die PCR optimal eingestellt ist, sollte ein Schmelzpunktpeak zu erwarten sein, der spitz zuläuft. Dieser Schmelzpunkt stellt das spezifische, zu erwartende Produkt dar. Unterschiedlich große Produkte und Produkte anderer Sequenz haben unterschiedliche Schmelzpunkte (Abb. 2.7, 2). Trägt man die Fluoreszenz gegen die Temperatur graphisch auf, so kann man den Fluoreszenzabfall beider Produkte als zwei getrennte Schmelzpunkte wahrnehmen (Abb. 2.7, 1).

Anmerkungen

Kein Hinweis auf die Quelle.

Die Abbildung am Anfang der Seite stammt nicht aus der hier dokumentierten Quelle.

Sichter
(SleepyHollow02), Hindemith

[59.] Ad/Fragment 066 01 - Diskussion
Bearbeitet: 8. July 2014, 10:14 Hindemith
Erstellt: 6. July 2014, 15:03 (SleepyHollow02)
Ad, Bente 2003, Fragment, Gesichtet, SMWFragment, Schutzlevel sysop, Verschleierung

Typus
Verschleierung
Bearbeiter
SleepyHollow02
Gesichtet
Yes.png
Untersuchte Arbeit:
Seite: 66, Zeilen: 1 ff. (komplett)
Quelle: Bente 2003
Seite(n): 39, 40, 52, Zeilen: 39: 21 ff.; 40: 1 ff.; 52: 34ff
[Trägt man die Fluoreszenz gegen die Temperatur grafisch auf, so kann man den] Fluoreszenzabfall beider Produkte als zwei getrennte Schmelzpunkte wahrnehmen (Abbildung 6). Damit gewinnt dieses System an Spezifität und erlaubt es, ein spezifisches Produkt von Artefakten zu unterscheiden (RIRIE et al. 1997).

Andererseits ist eine Quantifizierung mittels eines SYBR Green™ Protokolls nur dann möglich, wenn es keine Artefakte oder Primerdimer gibt.

Ad 66a diss.png

Abbildung 6: Darstellung einer Schmelzpunktanalyse

Nach der eigentlichen PCR wird das Produkt von 50 °C an in 1 °C Temperaturschritten für jeweils 30 sek bis zu einer Endtemperatur von 95 °C erhitzt. Bei einer für das Produkt spezifischen Temperatur denaturiert der Doppelstrang. Es kommt zu einem Abfall der Fluoreszenz (Peak) 2. Die zwei PCR-Produkte (A,B) mit unterschiedlicher Länge schmelzen bei unterschiedlichen Temperaturen.

Auswertung der quantitativen real-time Polymerasekettenreaktion

Die real-time PCR ermöglicht eine zeitgleiche Auswertung der Reaktion während des eigentlichen Amplifikationsprozesses. Die Auswertung erfolgt in der real-time RT-PCR durch die Messung der emittierten Fluoreszenz eines Farbstoffs. Emittierte Fluoreszenz und [entstehendes Amplifikat sind linear proportional.]

Trägt man die Fluoreszenz gegen die Temperatur graphisch auf, so kann man den Fluoreszenzabfall beider Produkte als zwei getrennte Schmelzpunkte wahrnehmen (Abb. 2.7, 1). Damit gewinnt dieses System an Spezifität und erlaubt es, ein spezifisches Produkt von Artefakten zu unterscheiden (RIRIE et al. 1997). [...] Andererseits ist eine Quantifizierung mittels eines SYBR Green™ Protokolls nur dann möglich, wenn es keine Artefakte oder Primerdimer gibt.

[Seite 40:]

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Abbildung 2-8: 1. Darstellung einer Schmelzpunktanalyse: Nach der eigentlichen PCR wird das Produkt von 50 °C an in 1 °C Temperaturschritten für jeweils 30 sek bis zu einer Endtemperatur von 95 °C erhitzt. Bei einer für das Produkt spezifischen Temperatur denautriert [sic] der Doppelstrang. Es kommt zu einem Abfall der Fluoreszenz (Peak) 2. Die zwei PCR-Produkte (A,B) mit unterschiedlicher Länge schmelzen bei unterschiedlichen Temperaturen.

[Seite 52:]

2.3.6 Auswertung

Die real-time PCR ermöglicht eine zeitgleiche Auswertung der Reaktion während des eigentlichen Amplifikationsprozesses. Die Auswertung erfolgt in der real-time RT-PCR durch die Messung der emittierten Fluoreszenz eines Farbstoffs. Emittierte Fluoreszenz und entstehendes Amplifikat sind linear proportional.

Anmerkungen

Kein Hinweis auf die Quelle.

Sichter
(SleepyHollow02), Hindemith

[60.] Ad/Fragment 067 01 - Diskussion
Bearbeitet: 8. July 2014, 12:05 Hindemith
Erstellt: 6. July 2014, 15:28 (SleepyHollow02)
Ad, Bente 2003, Fragment, Gesichtet, KomplettPlagiat, SMWFragment, Schutzlevel sysop

Typus
KomplettPlagiat
Bearbeiter
SleepyHollow02
Gesichtet
Yes.png
Untersuchte Arbeit:
Seite: 67, Zeilen: 1 ff. (komplett)
Quelle: Bente 2003
Seite(n): 52, 53, Zeilen: 52 letzte 4 Zeilen; 53 : 1 ff.
[Die Auswertung erfolgt in der real-time RT-PCR durch die Messung der emittierten Fluoreszenz eines Farbstoffs. Emittierte Fluoreszenz und] entstehendes Amplifikat sind linear proportional. Durch diese Verhältnismäßigkeit lässt sich über die Messung der Fluoreszenz auf die entstehende Menge an Produkt schließen.

Grundsätzlich lassen sich zwei Auswertungsmöglichkeiten bei real-time PCR-Systemen unterscheiden: Die Endpunktmessung und die Echtzeitmessung. Bei der Endpunktmessung, die alle zurzeit erhältlichen Geräte anbieten, werden die Fluoreszenzwerte der Probe zu Beginn (bei einigen Geräten auch zusätzlich einmal in der Mitte der Zyklenanzahl) und am Ende gemessen. Mit dieser Art der Messung ist nur eine qualitative Aussage (Ja/Nein- Aussage) möglich, da nur ermittelt wird, ob es während der PCR-Reaktion zu einem Anstieg der Fluoreszenz gekommen ist. Eine Beobachtung der Ergebnisse während des Amplifikationsprozesses und eine Quantifizierung sind hier nicht möglich.

Bei der Echtzeitmessung wird die Fluoreszenz während jedes einzelnen Zyklus gemessen. Die während des Amplifikationsprozesses gemessene native Fluoreszenz des Reporterfarbstoffs wird als R bezeichnet. Wird die gemessene Fluoreszenz um den Fluoreszenzwert der Basislinie korrigiert, so wird dieser Wert als dR bezeichnet (Tab.3). Des Weiteren besteht die Möglichkeit, die gemessene Fluoreszenz mit der Fluoreszenz eines Referenzfarbstoffes abzugleichen (Rn). Der Referenzfarbstoff –meist ROX oder HEX– ist ein fluoreszierender Farbstoff, der allen Reaktionsansätzen in konstanter Menge zugegeben wird. Er dient zur Abgleichung möglicher Fluoreszenzunterschiede der Sonde, die aufgrund von unterschiedlichen Volumina (Pipettierfehlern) in den einzelnen Reaktionsgefäßen entstehen. Des Weiteren dient der Referenzfarbstoff zum Abgleich variierender Fluoreszenzwerte, die dadurch entstehen, dass die optische Detektionseinheit von Reaktionsgefäß zu Reaktionsgefäß fährt und so unterschiedliche Aberrationen des Lichtes entstehen können. Wird die gemessene Fluoreszenz mit Basislinie und Referenzfarbstoff korrigiert, so entsteht der Wert dRn (Tab.3).

Ad 67a diss.png

Tabelle 2: Die während einer real-time PCR gemessene native Fluoreszenz (RReporter) wird im Folgenden an die Fluoreszenz der Basislinie und der des Referenzfarbstoffs angepasst.

Das real-time System erzeugt aus den ermittelten Fluoreszenzwerten eine grafische Darstellung, die als Amplifikationsgrafik bezeichnet wird.

Die Auswertung erfolgt in der real-time RT-PCR durch die Messung der emittierten Fluoreszenz eines Farbstoffs. Emittierte Fluoreszenz und entstehendes Amplifikat sind linear proportional. Durch diese Verhältnismäßigkeit lässt sich über die Messung der Fluoreszenz auf die entstehende Menge an Produkt schließen.

[Seite 53]

Grundsätzlich lassen sich zwei Auswertungsmöglichkeiten bei real-time PCR-Systemen unterscheiden: Die Endpunktmessung und die Echtzeitmessung. Bei der Endpunktmessung, die alle zurzeit erhältlichen Geräte anbieten, werden die Fluoreszenzwerte der Probe zu Beginn (bei einigen Geräten auch zusätzlich einmal in der Mitte der Zyklenanzahl) und am Ende gemessen. Mit dieser Art der Messung ist nur eine qualitative Aussage (Ja/Nein- Aussage) möglich, da nur ermittelt wird, ob es während der PCR-Reaktion zu einem Anstieg der Fluoreszenz gekommen ist. Eine Beobachtung der Ergebnisse während des Amplifikationsprozesses und eine Quantifizierung sind hier nicht möglich.

Bei der Echtzeitmessung wird die Fluoreszenz während jedes einzelnen Zyklus gemessen. Ob Annealing- oder Elongationsschritt als Zeitpunkt der Messung definiert werden, ist von der Sondenart abhängig.

Die während des Amplifikationsprozesses gemessene native Fluoreszenz des Reporterfarbstoffs wird als R bezeichnet. Wird die gemessene Fluoreszenz um den Fluoreszenzwert der Basislinie korrigiert, so wird dieser Wert als dR bezeichnet (Abb. 2.15). Des Weiteren besteht die Möglichkeit, die gemessene Fluoreszenz mit der Fluoreszenz eines Referenzfarbstoffes abzugleichen (Rn). Der Referenzfarbstoff –meist ROX oder HEX– ist ein fluoreszierender Farbstoff, der allen Reaktionsansätzen in konstanter Menge zugegeben wird. Er dient zur Abgleichung möglicher Fluoreszenzunterschiede der Sonde, die aufgrund von unterschiedlichen Volumina (Pipettierfehlern) in den einzelnen Reaktionsgefäßen entstehen. Des Weiteren dient der Referenzfarbstoff zum Abgleich variierender Fluoreszenzwerte, die dadurch entstehen, dass die optische Detektionseinheit von Reaktionsgefäß zu Reaktionsgefäß fährt und so unterschiedliche Aberrationen des Lichtes entstehen können. Wird die gemessene Fluoreszenz mit Basislinie und Referenzfarbstoff korrigiert, so entsteht der Wert dRn (Abb. 2.16).

Ad 67a source.png

Abbildung 2-16: Die während einer real-time PCR gemessene native Fluoreszenz (RReporter ) wird im Folgenden an die Fluoreszenz der Basislinie und der des Referenzfarbstoffs angepasst

Das real-time System erzeugt aus den ermittelten Fluoreszenzwerten eine graphische Darstellung, die als Amplifikationsgrafik bezeichnet wird.

Anmerkungen

Kein Hinweis auf die Quelle.

Sichter
(SleepyHollow02), Hindemith

[61.] Ad/Fragment 068 01 - Diskussion
Bearbeitet: 8. July 2014, 12:08 Hindemith
Erstellt: 6. July 2014, 15:46 (SleepyHollow02)
Ad, Bente 2003, Fragment, Gesichtet, SMWFragment, Schutzlevel sysop, Verschleierung

Typus
Verschleierung
Bearbeiter
SleepyHollow02
Gesichtet
Yes.png
Untersuchte Arbeit:
Seite: 68, Zeilen: 1 ff. (komplett)
Quelle: Bente 2003
Seite(n): 53, 54, 55, Zeilen: 53 unten; 54: 1 ff.; 55: 1 ff.
[Zur veranschaulichenden] Darstellung wird die gemessene Fluoreszenz auf der Ordinate gegen die Zyklenanzahl, auf der Abszisse aufgetragen (Abb.7)

Ad 68a diss.png

Abbildung 7: Darstellung einer Amplifikationsgrafik.

Die gemessene Fluoreszenz (Ordinate) wird gegen die Zyklenzahl (Abszisse) aufgetragen. Dabei zeigt der Reaktionsansatz schon eine gewisse Grundfluoreszenz (GF), bevor es zur Amplifikation gekommen ist. Aus der Standardabweichung der Fluoreszenz zwischen Zyklus 3 und 15 multipliziert mit dem Faktor zehn, wird ein Fluoreszenzwert errechnet, der zur Grundfluoreszenz der Proben addiert wird. So ergibt sich der Schwellenwert (Threshold). Der Schnittpunkt zwischen Amplifikationsgraph und Schwellenwert wird als Cycle-threshold (CT) bezeichnet. Er markiert einen Anstieg der Fluoreszenz über den Schwellenwert.

Die bei der real-time PCR eingesetzten Fluoreszenzfarbstoffe weisen eine gewisse Grundfluoreszenz auf. Ferner haben auch die verschiedenen verwendeten Materialien, wie z.B. die Plastikreaktionsgefäße, bei Anregung eine gewisse Hintergrundfluoreszenz. Der Fluoreszenzwert, gemessen beim Start der Reaktion, ist daher nicht gleich Null. Im Falle einer negativen QRT-PCR verbleibt die gemessene Fluoreszenz unter dem Schwellenwert und verläuft in einer geraden Linie bis zum Ende (Tabelle 2). Im Falle einer positiven Reaktion kommt es zur Amplifikation des Produkts und damit zum Anstieg der Fluoreszenz im Laufe der Reaktion.

Vor dem Anstieg der Fluoreszenz verbleibt die gemessene Fluoreszenz für eine gewisse Anzahl an Zyklen unverändert und verläuft als gerade Linie parallel zur Abszisse. Dieser Bereich wird als Basislinie bezeichnet. In diesem Bereich der PCR kommt es zwar schon zur Produktsynthese, die entstehenden Produktmengen sind jedoch so gering, dass es noch nicht zum Anstieg der meßbaren Fluoreszenz kommt (Abb. 8).

Zur veranschaulichenden Darstellung wird die gemessene Fluoreszenz auf der Ordinate gegen die Zyklenanzahl, auf der Abzisse aufgetragen (Abb. 2.16).

[Seite 54:]

Ad 68a source.png

Abbildung 2-17: Darstellung einer Amplifikationsgrafik: Die gemessene Fluoreszenz (Ordinate) wird gegen die Zyklenzahl (Abzisse) aufgetragen. Dabei zeigt der Reaktionsansatz schon eine gewisse Grundfluoreszenz (GF), bevor es zur Amplifikation gekommen ist. Aus der Standardabweichung der Fluoreszenz zwischen Zyklus 3 und 15 multipliziert mit dem Faktor zehn, wird ein Fluoreszenzwert errechnet, der zur Grundfluoreszenz der Proben addiert wird. So ergibt sich der Schwellenwert (Threshold). Der Schnittpunkt zwischen Amplifikationsgraph und Schwellenwert wird als Cycle-threshold (CT) bezeichnet. Er markiert einen Anstieg der Fluoreszenz über den Schwellenwert.

Die bei der real-time PCR eingesetzten Fluoreszenzfarbstoffe weisen eine gewisse Grundfluoreszenz auf. Ferner haben auch die verschiedenen verwendeten Materialien, wie z.B. die Plastikreaktionsgefäße, bei Anregung eine gewisse Hintergrundfluoreszenz. Der Fluoreszenzwert, gemessen beim Start der Reaktion, ist daher nicht gleich Null. Im Falle einer negativen QRT-PCR verbleibt die gemessene Fluoreszenz unter dem Schwellenwert und verläuft in einer geraden Linie bis zum Ende (Abb. 2.16). Im Falle einer positiven Reaktion kommt es zur Amplifikation des Produkts und damit zum Anstieg der Fluoreszenz im Laufe der Reaktion.

[Seite 55:]

Vor dem Anstieg der Fluoreszenz verbleibt die gemessene Fluoreszenz für eine gewisse Anzahl an Zyklen unverändert und verläuft als gerade Linie parallel zur Abzisse. Dieser Bereich wird als Basislinie bezeichnet. In diesem Bereich der PCR kommt es zwar schon zur Produktsynthese, die entstehenden Produktmengen sind jedoch so gering, dass es noch nicht zum Anstieg der Fluoreszenz kommt (Abb. 2.17).

Anmerkungen

Kein Hinweis auf die Quelle.

Sichter
(SleepyHollow02), Hindemith

[62.] Ad/Fragment 069 01 - Diskussion
Bearbeitet: 8. July 2014, 12:11 Hindemith
Erstellt: 6. July 2014, 15:57 (SleepyHollow02)
Ad, Bente 2003, Fragment, Gesichtet, KomplettPlagiat, SMWFragment, Schutzlevel sysop

Typus
KomplettPlagiat
Bearbeiter
SleepyHollow02
Gesichtet
Yes.png
Untersuchte Arbeit:
Seite: 69, Zeilen: 1 ff. (komplett)
Quelle: Bente 2003
Seite(n): 55, 56, 57, Zeilen: 55: 6ff; 56: 1ff; 57: 1ff
Ad 69a diss.png

Abbildung 8: Relation der gemessenen Fluoreszenz zum entstehenden Produkt in einer real-time PCR.

Während schon in den ersten Zyklen PCR-Produkte entstehen, reicht die dabei entstehende Fluoreszenz nicht aus, um ein messbares Signal zu erzeugen.

Im Bereich der Basislinie kommt es immer zu leichten Schwankungen in der gemessenen Fluoreszenz. Diese beruhen auf Schwankungen der Fluoreszenz in der Probe (Abb.7). Es muss nun ein Punkt definiert werden, ab dem eine gemessene Fluoreszenz einer Probe klar von der Hintergrundfluoreszenz zu unterscheiden und als positiv zu werten ist. Hierfür wird ein Schwellenwert gesetzt (Threshold; Abbildung 7). Er stellt eine Trennlinie zur Unterscheidung zwischen signifikanter Zunahme der Fluoreszenz und der Hintergrundfluoreszenz dar. Er wird definiert als die Standardabweichung der Hintergrundfluoreszenz -gemessen zwischen Zyklus drei und 15- multipliziert mit dem Faktor 10.

Der Schnittpunkt zwischen der Fluoreszenz und dem Schwellenwert projiziert auf die Abszisse wird als Zyklen-Schwellenwert (Cycle-threshold (CT)) bezeichnet und stellt den niedrigsten messbaren positiven Wert einer QRT-PCR dar. Der CT-Wert gibt also eine Zyklenanzahl an. Er steht in direkter Beziehung zur Ausgangsmenge der eingesetzten DNA. Ist der CT-Wert niedrig, ist die eingesetzte Menge DNA groß. Ist der CT-Wert hoch, so ist die Ausgangsmenge an DNA klein. Der CT-Wert ist daher Grundlage für die Quantifizierung einer Reaktion.

Quantifizierung

Die Quantitative PCR kann für verschiedene Anwendungen genutzt werden, wie z.B. das Monitoring der Genexpression oder die Bestimmung der Viruslast im Rahmen von [Pathogenesestudien (BUSTIN 2000; FREEMAN et al. 1999; HALFORD 1999; HEID et al. 1996).]

Ad 69a source.png

Abbildung 2-18: Relation der gemessenen Fluoreszenz zum entstehenden Produkt in einer real-time PCR.

Während schon in den ersten Zyklen PCR-Produkte entstehen, reicht die dabei entstehende Fluoreszenz nicht aus, um ein messbares Signal zu erzeugen.

Im Bereich der Basislinie kommt es immer zu leichten Schwankungen in der gemessenen Fluoreszenz. Diese beruht auf Schwankungen der Fluoreszenz in der Probe (Abb. 2.16). Es muss nun ein Punkt definiert werden, ab dem eine gemessene Fluoreszenz einer Probe klar von der Hintergrundfluoreszenz zu unterscheiden und als positiv zu werten ist. Hierfür wird ein Schwellenwert gesetzt (Threshold; Abb. 2.16). Er stellt eine Trennlinie zur Unterscheidung zwischen signifikanter Zunahme der Fluoreszenz und der

[Seite 56:]

Hintergrundfluoreszenz dar. Er wird definiert als die Standardabweichung der Hintergrundfluoreszenz -gemessen zwischen Zyklus drei und 15- multipliziert mit dem Faktor 10. Der Schnittpunkt zwischen der Fluoreszenz und dem Schwellenwert projiziert auf die Abzisse wird als Cycle-threshold (CT) bezeichnet und stellt den niedrigsten messbaren positiven Wert einer QRT-PCR dar. Der CT-Wert gibt also eine Zyklenanzahl an. Er steht in direkter Beziehung zur Ausgangsmenge der eingesetzten DNA. Ist der CT-Wert niedrig, ist die eingesetzte Menge DNA groß. Ist der CT-Wert hoch, so ist die Ausgangsmenge an DNA klein. Der CT-Wert ist daher Grundlage für die Quantifizierung einer Reaktion (vgl. 2.3.8).

[...]

2.3.8 Quantifizierung

Die Quantitative PCR kann für verschiedene Anwendungen genutzt werden, wie z.B. das Monitoring der Genexpression oder die Bestimmung der Viruslast im Rahmen von

[Seite 57:]

Pathogenesestudien (BUSTIN 2000, FREEMAN et al. 1999, HALFORD 1999, HEID et al. 1996).

Anmerkungen

Kein Hinweis auf die Quelle.

Sichter
(SleepyHollow02), Hindemith

[63.] Ad/Fragment 070 01 - Diskussion
Bearbeitet: 9. July 2014, 12:34 Hindemith
Erstellt: 6. July 2014, 16:35 (SleepyHollow02)
Ad, Bente 2003, Fragment, Gesichtet, SMWFragment, Schutzlevel sysop, Verschleierung

Typus
Verschleierung
Bearbeiter
SleepyHollow02
Gesichtet
Yes.png
Untersuchte Arbeit:
Seite: 70, Zeilen: 1 ff. (komplett)
Quelle: Bente 2003
Seite(n): 56, 57, 58, Zeilen: 56: letzte Zeilen; 57: 1 ff.; 58: 1 ff.
[Die Quantitative PCR kann für verschiedene Anwendungen genutzt werden, wie z.B. das Monitoring der Genexpression oder die Bestimmung der Viruslast im Rahmen von] Pathogenesestudien (BUSTIN 2000; FREEMAN et al. 1999; HALFORD 1999; HEID et al. 1996).

Das Prinzip der Quantifizierung der Ausgangsmenge an Nukleinsäure mittels real-time RTPCR unterscheidet sich grundlegend von der Quantifizierung mit Hilfe einer konventionellen RT-PCR, da hier nicht die absolute Menge an PCR-Produkt, das bis zum Ende der Reaktion entsteht, gemessen wird. Bei der QRT-PCR wird der CT-Wert genutzt. Der CT-Wert verhält sich umgekehrt proportional zum Logarithmus der Ausgangsmenge an Nukleinsäure (HIGUCHI et al. 1993). Rein theoretisch könnte anhand des CT-Wertes auf die ursprüngliche Matrizenmenge zurückgeschlossen werden, wenn gleichzeitig die Vermehrungsrate der PCR bekannt wäre. Die Amplifikation eines bestimmten Fragments wird aber von vielen Faktoren beeinflusst, so dass es nicht möglich ist, die genaue Vermehrungsrate einer Reaktion zu ermitteln (BUSTIN 2000). Es ist daher einfacher, parallel zu den zu untersuchenden Proben, Proben mit bekannter Menge in Form eines Standards zu amplifizieren und die so ermittelten CT-Werte miteinander zu vergleichen. Die Quantifizierung kann relativ oder absolut erfolgen. Dies beruht auf unterscheidlichen Prinzipien des verwendeten Standards.

Grundsätzlich gibt es zwei Arten der Berechnung der relativen Menge: Die Standardkurven- Methode und die ΔΔCt-Methode (LIVAK & SCHMITTGEN 2001).


Beide Berechnungsmethoden benötigen neben der eigentlichen Zielsequenz auch eine „endogene Kontrolle“ (Referenzgen), die mit amplifiziert wird. Somit lässt sich anhand der m-RNA des Referenzgens die relative Menge an m-RNA des Zielgenes in einer RT-PCR Probe bestimmen. Als endogene Kontrolle sollten Gene verwendet werden, die ubiquitär und in einer konstanten Menge in den verwendeten Zellen vorkommen wie z.B. 18s rRNA, GAPDH (Glycerinaldehyd-3-phosphatdehydrogenase) oder β-Aktin. Sie sollten unter den verschieden experimentellen Bedingungen immer konstant exprimiert werden. Da 18s rRNA keinen Poly-A-Schwanz besitzt, kann sie nicht als endogene Kontrolle für eine RT-PCR eingesetzt werden, bei der Oligo-dTs für den Schritt der reversen Transkription verwendet werden. Allerdings konnte gezeigt werden, dass es zu einer unterschiedlichen Expression von Housekeeping Genen in Zellen kommen kann (LIVAK & SCHMITTGEN 2001). Die Verwendung z.B. von GAPDH ist daher kritisch zu sehen. β-Aktin stellt womöglich eine bessere Alternative dar. Vorab sollte immer evaluiert werden, wie hoch die Genexpression der gewählten endogenen Kontrolle in den verwendeten Zellen ist. Die erste Möglichkeit besteht darin, die zu untersuchende Probe aufzuteilen und die endogene Kontrolle und die Zielsequenz in zwei getrennten Reaktionsgefäßen auszuwerten. Die zweite Möglichkeit ist [das Housekeeping Gen und die Zielsequenz im selben Reaktionsgefäß zu messen. Man nennt dies Multiplex-Reaktion.]

Die Quantitative PCR kann für verschiedene Anwendungen genutzt werden, wie z.B. das Monitoring der Genexpression oder die Bestimmung der Viruslast im Rahmen von

[Seite 57:]

Pathogenesestudien (BUSTIN 2000, FREEMAN et al. 1999, HALFORD 1999, HEID et al. 1996).

Das Prinzip der Quantifizierung der Ausgangsmenge an Nukleinsäure mittels real-time RTPCR unterscheidet sich grundlegend von der Quantifizierung mit Hilfe einer konventionellen RT-PCR, da hier nicht die absolute Menge an PCR-Produkt, das bis zum Ende der Reaktion entsteht, gemessen wird. Bei der QRT-PCR wird der CT-Wert genutzt. Der CT-Wert verhält sich umgekehrt proportional zum Logarithmus der Ausgangsmenge an Nukleinsäure (HIGUCHI et al. 1993). Rein theoretisch könnte anhand des CT-Wertes auf die ursprüngliche Matrizenmenge zurückgeschlossen werden, wenn gleichzeitig die Vermehrungsrate der PCR bekannt wäre. Die Amplifikation eines bestimmten Fragments wird aber von vielen Faktoren beeinflusst, so dass es nicht möglich ist, die genaue Vermehrungsrate einer Reaktion zu ermitteln (BUSTIN 2000). Es ist daher einfacher, parallel zu den zu untersuchenden Proben, Proben mit bekannter Menge in Form eines Standards zu amplifizieren und die so ermittelten CT-Werte miteinander zu vergleichen. Die Quantifizierung kann relativ oder absolut erfolgen. Sie unterscheidet sich in einem unterschiedlichen Prinzip des verwendeten Standards.

[...]

Grundsätzlich gibt es zwei Arten der Berechnung der relativen Menge: Die Standardkurven- Methode und die ΔΔCt-Methode (LIVAK u. SCHUTTEN 2001).

Beide Berechnungsmethoden benötigen neben der eigentlichen Zielsequenz auch eine „endogene Kontrolle“ (Referenzgen), die mit amplifiziert wird. Diese endogene Kontrolle wird als Housekeeping Gene bezeichnet. Es ist eine aktive Referenz –eine Normalisierungwomit die Menge an Ziel-RNA im Verhältnis zu der insgesamt in der Probe vorhandenen RNA gesetzt wird. Als endogene Kontrolle sollten Gene verwendet werden, die ubiquitär und in einer konstanten Menge in den verwendeten Zellen vorkommen wie z.B. 18s rRNA, GAPDH (Glycerinaldehyd-3-phosphatdehydrogenase) oder β-Aktin. Sie sollten unter den verschieden experimentellen Bedingungen immer konstant exprimiert werden. Da 18s rRNA keinen Poly-A-Schwanz besitzt, kann sie nicht als endogene Kontrolle für eine RT-PCR eingesetzt werden, bei der Oligo-dTs für den Schritt der Reversen Transkription verwendet werden. Allerdings konnte gezeigt werden, dass es zu einer unterschiedlichen Expression von Housekeeping Genen in Zellen kommen kann (BUSTIN 2000). Die Verwendung z.B. von

[Seite 58:]

GAPDH ist daher kritisch zu sehen. β-Aktin stellt womöglich eine bessere Alternative dar. Vorab sollte immer evaluiert werden, wie hoch die Genexpression der gewählten endogenen Kontrolle in den verwendeten Zellen ist. Die erste Möglichkeit besteht darin, die zu untersuchende Probe aufzuteilen und die endogene Kontrolle und die Zielsequenz in zwei getrennten Reaktionsgefäßen auszuwerten. Die zweite Möglichkeit ist, das Housekeeping Gen und die Zielsequenz im selben Reaktionsgefäß zu messen. Man nennt dies Multiplex- Reaktion.

Anmerkungen

Kein Hinweis auf die Quelle.

Sichter
(SleepyHollow02), Hindemith

[64.] Ad/Fragment 071 01 - Diskussion
Bearbeitet: 8. July 2014, 15:35 Singulus
Erstellt: 6. July 2014, 16:47 (SleepyHollow02)
Ad, Bente 2003, Fragment, Gesichtet, KomplettPlagiat, SMWFragment, Schutzlevel sysop

Typus
KomplettPlagiat
Bearbeiter
SleepyHollow02
Gesichtet
Yes.png
Untersuchte Arbeit:
Seite: 71, Zeilen: 1 ff. (komplett)
Quelle: Bente 2003
Seite(n): 58, 60, Zeilen: 58: 5 ff.; 60: 14-19
[Die zweite Möglichkeit ist,] das Housekeeping Gen und die Zielsequenz im selben Reaktionsgefäß zu messen. Man nennt dies Multiplex-Reaktion. Die Verwendung von Sonden, die mit unterschiedlichen Fluorochromen markiert sind, erlaubt es prinzipiell, mehrere Fragmente in dem gleichen Reaktionsgefäß zu messen. Die Normalisierung der gemessenen Daten durch das Verhältnis zur endogenen Kontrolle verhindert Fehler, die auf gering veränderten PCR-Effektivitäten oder verschiedenen Ausgangskonzentrationen basieren.

1. Die Berechnung über eine Standardkurven-Methode:

Neben den zu untersuchenden Proben werden in der real-time PCR serielle Verdünnungen eines Housekeeping Gens und eines der Zielsequenz ähnlichen Standards zur Bestimmung der PCR-Effizienz mit analysiert. Genaue Konzentrationen müssen nicht bekannt sein. Ist die Effizienz der PCR-Reaktion von Standard und Housekeeping Gen gleich, so ist es ausreichend, für die weiteren Berechnungen nur die Standardkurve des Housekeeping Gens heranzuziehen. Im zweiten Schritt werden die CT-Werte für die zu untersuchenden Proben gegen die ermittelten Housekeeping Gen-CT-Werte „normalisiert“. Im letzten Schritt wird der resultierende niedrigere Wert als Kalibrator festgesetzt und gleich 1 gesetzt. So ergibt sich eine Relation beider Proben zu einander.

2. Alternativ können die CT-Werte miteinander verglichen werden; eine Standardkurve ist nicht nötig. Dies wird als ΔΔCt-Methode bezeichnet (LIVAK & SCHMITTGEN 2001). Grundlage hierfür ist eine gleiche Effizienz der Housekeeping Gen-PCR und der Zielsequenz- PCR. Die Formel für die Berechnung lautet:

2-ΔΔCt

ΔΔCT = ΔCtq – ΔCtcb

ΔCtq = CtX - CtR ; Normalisierter CT für die Probe

ΔCtb = CtX - CtR ; Normalisierter CT für den Kalibrator

CtX = CT der Zielsequenz der entsprechenden Probe

CtR = CT der Referenz der entsprechenden Probe

2.16.5 Vergleich real-time RT-PCR und konventionelle RT-PCR

Die quantitative real-time PCR beinhaltet zunächst alle Vorteile einer konventionellen PCR, nämlich die Schnelligkeit der Durchführung, die Sensitivität und die Nutzbarkeit einer Reihe von Ausgangsmaterialien. Durch das Entfallen der Agarose-Gel-Auswertung nach der PCR sowie das verkürzte Thermoprofil (Zwei-Schritt- anstatt Drei-Schritt-Programme), werden der [Zeit- und Arbeitsaufwand sowie das Kontaminationsrisiko für die Proben und für das Labor reduziert.]

Die zweite Möglichkeit ist, das Housekeeping Gen und die Zielsequenz im selben Reaktionsgefäß zu messen. Man nennt dies Multiplex-Reaktion. Die Verwendung von Sonden, die mit unterschiedlichen Fluorochromen markiert sind, erlaubt es prinzipiell, mehrere Fragmente in dem gleichen Reaktionsgefäß zu messen.

Die Normalisierung der gemessenen Daten durch das Verhältnis zur endogenen Kontrolle verhindert Fehler, die auf gering veränderten PCR-Effektivitäten oder verschiedenen Ausgangskonzentrationen basieren.

1. Die Berechnung über eine Standardkurven-Methode:

Neben den zu untersuchenden Proben werden in der real-time PCR serielle Verdünnungen eines Housekeeping Gens und eines der Zielsequenz ähnlichen Standards zur Bestimmung der PCR-Effizienz mit analysiert. Genaue Konzentrationen müssen nicht bekannt sein. Ist die Effizienz der PCR-Reaktion von Standard und Housekeeping Gen gleich, so ist es ausreichend, für die weiteren Berechnungen nur die Standardkurve des Housekeeping Gens heranzuziehen. Im zweiten Schritt werden die CT-Werte für die zu untersuchenden Proben 1 und 2 gegen die ermittelten Housekeeping Gen-CT-Werte „normalisiert“. Im letzten Schritt wird der resultierende niedrigere Wert als Kalibrator festgesetzt und gleich 1 gesetzt. So ergibt sich eine Relation beider Proben zu einander.

2. Alternativ können die CT-Werte miteinander verglichen werden; eine Standardkurve ist nicht nötig. Dies wird als ΔΔCt-Methode bezeichnet (LIVAK u. SCHUTTEN 2001). Grundlage hierfür ist eine gleiche Effizienz der Housekeeping Gen-PCR und der Zielsequenz- PCR. Die Formel für die Berechnung lautet:

ΔΔCT = ΔCtq – ΔCtcb

ΔCtq = CtX - CtR ; Normalisierter CT für die Probe

ΔCtq = CtX - CtR ; Normalisierter CT für den Kalibrator

CtX = CT der Zielsequenz der entsprechenden Probe

CtR = CT der Referenz der entsprechenden Probe

[Seite 60]

Die quantitative real-time PCR beinhaltet zunächst alle Vorteile einer konventionellen PCR, nämlich die Schnelligkeit der Durchführung, die Sensitivität und die Nutzbarkeit einer Reihe von Ausgangsmaterialien. Durch das Entfallen der Agarose-Gel-Auswertung nach der PCR sowie das verkürzte Thermoprofil (Zwei-Schritt- anstatt Drei-Schritt-Programme), werden der Zeit- und Arbeitsaufwand sowie das Kontaminationsrisiko für die Proben und für das Labor reduziert.

Anmerkungen

Kein Hinweis auf die Quelle.

Sichter
(SleepyHollow02) Schumann

[65.] Ad/Fragment 072 01 - Diskussion
Bearbeitet: 9. July 2014, 12:42 Hindemith
Erstellt: 6. July 2014, 16:55 (SleepyHollow02)
Ad, Bente 2003, Fragment, Gesichtet, KomplettPlagiat, SMWFragment, Schutzlevel sysop

Typus
KomplettPlagiat
Bearbeiter
SleepyHollow02
Gesichtet
Yes.png
Untersuchte Arbeit:
Seite: 72, Zeilen: 1 ff. (komplett)
Quelle: Bente 2003
Seite(n): 60, 61, Zeilen: 60: 16ff; 61: 1 ff.
[Durch das Entfallen der Agarose-Gel-Auswertung nach der PCR sowie das verkürzte Thermoprofil (Zwei-Schritt- anstatt Drei-Schritt-Programme), werden der] Zeit- und Arbeitsaufwand sowie das Kontaminationsrisiko für die Proben und für das Labor reduziert. Die Agarose-Gelelektrophorese braucht nicht automatisiert werden, denn sie ist bei den real-time PCRs nicht notwendig.

Viele der zurzeit erhältlichen real-time PCR-Systeme bieten zudem einen hohen Probendurchsatz. So können in den meisten Geräten 96 Proben, in einigen auch 384 Proben auf einmal analysiert werden. Dies bedeutet wiederum eine Zeitersparnis gegenüber der Standard PCR.

Die Sensitivität der QRT-PCR ist laut BUSTIN und MACKAY 100 bis 1000-fach höher als in der konventionellen PCR. So liegt die Nachweisgrenze eines Amplifikates im Agarose-Gel bei 2 bis 4 ng, während in der real-time PCR Nachweisgrenzen von 2 bis 20 pg postuliert werden (BUSTIN 2000; MACKAY et al. 2002 ).

Die Real-time PCR ermöglicht eine exaktere Quantifizierung des Ausgangsproduktes als die konventionelle PCR, da im Gegensatz zur Standard PCR im exponentiellen Bereich der Reaktion gemessen wird. Dies ermöglicht zudem eine Quantifizierung in einem weiteren Bereich als bei der konventionellen PCR.

Als nachteilig gestaltet sich die Inkompatibilität einiger real-time PCR Geräte für die Verwendung bestimmter Sondensysteme, sowie die noch stark eingeschränkte Multiplexfähigkeit der meisten Geräte (MACKAY 2002).

Ein weiterer Nachteil sind die Programme, die für die Auswertung der real-time PCR verwendet werden. So wird auf den derzeit erhältlichen Geräten unterschiedlichste Software mit unterschiedlichen Betriebssystemen genutzt. Dies erschwert die Vergleichbarkeit der ermittelten Ergebnisse, im Speziellen der gemessenen Fluoreszenzdaten und der CT-Werte. Die zur Kalkulation der Werte verwendeten Algorithmen sind einheitlich und standardisiert, doch werden die ermittelten Daten unterschiedlich präsentiert und aufgearbeitet. In diesem Zusammenhang gestaltet sich auch die klare Definition des Schwellenwertes (Threshold) schwierig. Derzeit ist nur definiert, dass die zur Berechnung des Schwellenwertes genutzte Fluoreszenz zwischen Zyklus 3-15 gemessen werden muss. Die derzeitige Definition lässt durchaus Spielraum für Modifikationen.

Durch das Entfallen der Agarose-Gel-Auswertung nach der PCR sowie das verkürzte Thermoprofil (Zwei-Schritt- anstatt Drei-Schritt-Programme), werden der Zeit- und Arbeitsaufwand sowie das Kontaminationsrisiko für die Proben und für das Labor reduziert. Die Agarose-Gelelektrophorese kann nicht automatisiert werden, denn sie ist bei den real-time PCRs nicht notwendig.

Viele der zurzeit erhältlichen real-time PCR-Systeme bieten zudem einen hohen Probendurchsatz. So können in den meisten Geräten 96 Proben, in einigen auch 384 Proben auf einmal analysiert werden. Dies bedeutet wiederum eine Zeitersparnis gegenüber der Standard PCR.

[...]

Die Sensitivität der QRT-PCR ist laut BUSTIN und MACKAY 100 bis 1000-fach höher als in der konventionellen PCR. So liegt die Nachweisgrenze eines Amplifikates im Agarose-Gel bei 2 bis 4 ng, während in der real-time PCR Nachweisgrenzen von 2 bis 20 pg postuliert werden (BUSTIN 2000; MACKAY 2002).

Die Real-time PCR ermöglicht eine exaktere Quantifizierung des Ausgangsproduktes als die konventionelle PCR, da im Gegensatz zur Standard PCR im exponentiellen Bereich der Reaktion gemessen wird. Dies ermöglicht zudem eine Quantifizierung in einem weiteren Bereich als bei der konventionellen PCR.

[Seite 61:]

Als nachteilig gestaltet sich die Inkompatibilität einiger real-time PCR Geräte für die Verwendung bestimmter Sondensysteme, sowie die noch stark eingeschränkte Multiplexfähigkeit der meisten Geräte (MACKAY 2002).

[...]

Ein weiterer Nachteil sind die Programme, die für die Auswertung der real-time PCR verwendet werden. So wird auf den derzeit erhältlichen Geräten unterschiedlichste Software mit unterschiedlichen Betriebssystemen genutzt. Dies erschwert die Vergleichbarkeit der ermittelten Ergebnisse, im Speziellen der gemessenen Fluoreszenzdaten und der CT-Werte. Die zur Kalkulation der Werte verwendeten Algorithmen sind einheitlich und standardisiert, doch werden die ermittelten Daten unterschiedlich präsentiert und aufgearbeitet. In diesem Zusammenhang gestaltet sich auch die klare Definition des Schwellenwertes (Threshold) schwierig. Derzeit ist nur definiert, dass die zur Berechnung des Schwellenwertes genutzte Fluoreszenz zwischen Zyklus 3-15 gemessen werden muss. Die derzeitige Definition lässt durchaus Spielraum für Modifikationen.

Anmerkungen

Kein Hinweis auf die Quelle.

Sichter
(SleepyHollow02), Hindemith

[66.] Ad/Fragment 077 25 - Diskussion
Bearbeitet: 14. July 2014, 19:37 PlagProf:-)
Erstellt: 10. July 2014, 21:15 (Graf Isolan)
Ad, Fragment, Gesichtet, König 2003, SMWFragment, Schutzlevel sysop, Verschleierung

Typus
Verschleierung
Bearbeiter
Graf Isolan
Gesichtet
Yes.png
Untersuchte Arbeit:
Seite: 77, Zeilen: 25-35
Quelle: König 2003
Seite(n): 39-40, Zeilen: 39:30-38 - 40:1-3
3.2.4 Material für die Separation und Kultivierung von Leukozyten

Lymphozytenseparationsmedium (Ficollpräparation)

Das Lymphozytenseparationsmedium Ficoll® (s. 3.2.2) ist Lösung eines hochmolekularen Zuckers. Bei 10°C weist das kommerzielle Separationsmedium eine Dichte von 1,077 g/ml auf. In dieser Arbeit wurde diese Ficollpräparation unverdünnt verwendet.

Percoll™

Dieses synthetische hypotone Sol, bestehend aus Polyvinyl-Pyrrolidon-beschichteten Silikatpartikeln, hat bei 20°C ein spezifisches Gewicht von 1,130 g/ml. In dieser Arbeit wurde 100%iges Percoll™ (s. 3.1.2) durch Zugabe von kristallinem NaCl (s. 3.2.2; 0,9 g/100 ml Percoll™) in einen isotonen Zustand gebracht und durch Zugabe von 0,9%iger NaCl-Lösung (s. 3.2.2) zu 76% bzw 58%igem Percoll™ verdünnt

[Seite 39]

3.1.4 Materialien für die Separation und Kultivierung von Leukozyten

Lymphozytenseparationsmedium (Ficollpräparation)

Das Lymphozytenseparationsmedium (s. 3.1.2) besteht aus Natriumdiatrizoat und Ficoll, einer Lösung eines hochmolekularen Zuckers. Bei 10°C weist das Separationsmedium eine Dichte von 1,077 g/mL auf. In dieser Arbeit wurde das Lymphozytenseparationsmedium unverdünnt verwendet.

Percoll™

Dieses synthetische Sol, bestehend aus Polyvinyl-Pyrrolidon-beschichteten Silikatpartikeln, hat bei 20°C ein spezifisches Gewicht von 1,130 g/mL. In dieser Arbeit

[Seite 40]

wurde 100%iges Percoll™ (s. 3.1.2) durch Zugabe von kristallinem NaCl (s. 3.1.2; 0,9 g/100 mL Percoll™) in einen isotonen Zustand gebracht und durch Zugabe von 0,9%iger NaCl-Lösung (s. 3.1.3) zu 70%igem Percoll™ verdünnt.

Anmerkungen

Ohne Hinweis auf eine Übernahme.

Sichter
(Graf Isolan), PlagProf:-)

[67.] Ad/Fragment 078 01 - Diskussion
Bearbeitet: 11. July 2014, 07:13 Singulus
Erstellt: 10. July 2014, 20:44 (Graf Isolan)
Ad, Fragment, Frank 2000, Gesichtet, SMWFragment, Schutzlevel sysop, Verschleierung

Typus
Verschleierung
Bearbeiter
Graf Isolan
Gesichtet
Yes.png
Untersuchte Arbeit:
Seite: 78, Zeilen: 1-5
Quelle: Frank 2000
Seite(n): 42, Zeilen: 4-9
Interleukin-8 übt als Chemokin eine primär chemotaktische Wirkung auf neutrophile Granulozyten aus. Zum Einsatz kam rekombinantes humanes, lyophilisiertes Interleukin-8 (rhIL-8, 8,4 kDa, 72 Aminosäuren, s. 3.2.2), das in PBS (3.2.2) mit 0,1% BSA (3.2.2) auf 1 μg/ml verdünnt und in aliquoten Teilen zu 1 ml bei –20°C eingefroren wurde. Vor Gebrauch wurde diese Lösung auf die benötigte Endkonzentration (0,1 μg/ml) mit PBS eingestellt. Interleukin-8 (s. 3.1.2) übt als Chemokin eine primär chemotaktische Wirkung auf neutrophile Granulozyten aus, wobei ihm noch weitere Funktionen zugeschrieben werden (s. 2.5.2). Zum Einsatz kam rekombinantes humanes, lyophilisiertes Interleukin-8 (rhIL-8, 8,0 kDa, 72 Aminosäuren), das in PBS mit 0,1% BSA (s. 3.1.2) auf 1 μg/ml verdünnt und in

aliquoten Teilen zu 100 μl oder 200 μl bei –20°C eingefroren wurde. Vor Gebrauch wurde diese Lösung auf die benötigte Endkonzentration (10-100 ng/ml) in R0+ eingestellt.

Anmerkungen

Ohne Hinweis auf eine Übernahme.

Sichter
(Graf Isolan), SleepyHollow02

[68.] Ad/Fragment 079 01 - Diskussion
Bearbeitet: 11. July 2014, 07:10 Singulus
Erstellt: 10. July 2014, 20:19 (Graf Isolan)
Ad, Fragment, Frank 2000, Gesichtet, SMWFragment, Schutzlevel sysop, Verschleierung

Typus
Verschleierung
Bearbeiter
Graf Isolan
Gesichtet
Yes.png
Untersuchte Arbeit:
Seite: 79, Zeilen: 1-8
Quelle: Frank 2000
Seite(n): 45, Zeilen: 13-20
Das Fluorochrom Propidiumjodid (PJ, s. 3.2.2) gelangt nur bei Membrandefekten ins Innere der Zelle und interkaliert dort mit der doppelsträngigen DNA, so dass es nicht mehr aus der Zelle austreten kann. Folglich diente Propidiumjodid als Hilfsmittel zur Beurteilung der morphologischen Integrität der untersuchten Zellen und damit ihrer Vitalität. Aus der

kristallinen Trockensubstanz wurde mit Hilfe von PBS (3.2.2) die Gebrauchslösung (100 μg/ml) hergestellt, die in aliquoten Teilen zu 1 ml bei –20°C eingefroren wurde. Bei durchflusszytometrischen Messungen wurden jeder 20 μl PJ-Gebrauchslösung pro ml Untersuchungssuspension zugesetzt, was einer Endkonzentration von 2 μg PJ/ml entsprach.

Das Fluorochrom Propidiumjodid (Pj, s. 3.1.2) gelangt nur bei Membrandefekten ins Innere der Zelle und interkaliert dort mit der doppelsträngigen DNA. Somit dient Propidiumjodid als Hilfsmittel zur Beurteilung der morphologischen Integrität der untersuchten Zellen und damit ihrer Vitalität. Aus der kristallinen Trockensubstanz wurde mit Hilfe von PBS die Gebrauchslösung (100 μg/ml) hergestellt, die in aliquoten Teilen zu 1 ml bei –20°C eingefroren wurde. Bei durchflußzytometrischen Messungen enthielt jede Probe eine Konzentration von 20 μl Pj-Gebrauchslösung pro ml Untersuchungssuspension, was einer Endkonzentration von 2 μg Pj/ml entspricht.
Anmerkungen

Ohne Hinweis auf eine Übernahme.

Sichter
(Graf Isolan), SleepyHollow02

[69.] Ad/Fragment 079 15 - Diskussion
Bearbeitet: 11. July 2014, 07:11 Singulus
Erstellt: 10. July 2014, 20:37 (Graf Isolan)
Ad, Fragment, Frank 2000, Gesichtet, SMWFragment, Schutzlevel sysop, Verschleierung

Typus
Verschleierung
Bearbeiter
Graf Isolan
Gesichtet
Yes.png
Untersuchte Arbeit:
Seite: 79, Zeilen: 15-27
Quelle: Frank 2000
Seite(n): 45, Zeilen: 21-33
Referenzzellen zur Zellzahlbestimmung

Verwendung fanden bovine, mononukleäre Zellen (MNC), die gemäß der unter 0 zur Gewinnung mononukleärer Zellen beschriebenen Methode mit einer Reinheit von über 98% gewonnen wurden. Nach dem dritten Waschgang wurde die Zellsuspension mit dem monoklonalen Antikörper (mAk) Bo1 (500 μl unverdünnte Lösung) versetzt und für 30 Minuten bei 4°C inkubiert. Es folgten drei weitere Waschgänge (jeweils 300 x g, 8 Minuten, 4°C) mit MIF-Puffer (s. 3.2.4) und eine weitere Inkubation bei 4°C für 30 Minuten mit dem konjugierten Antikörper (DTAF - ZgαM – IgG + M (H + L), 500 μl, 1:100 verdünnt, s. 3.2.2). Nach weiteren drei Waschgängen (s. oben) wurden die Zellen mit Paraformaldehyd (4% in PBS, s. 3.2.4) 12–24 Stunden lichtgeschützt bei 4°C fixiert. Nach der Fixation wurden die Zellen dreimal mit MIF-Puffer gewaschen (s. oben) und dann in einer Endkonzentration von 3 bis 6 x 104 Zellen/50 μl Sheath fluid-Propidiumjodid-Lösung (2 μg PJ/ml Sheath fluid(3.2.5), bei 4°C lichtgeschützt gelagert.

Referenzzellen zur Zellzahlbestimmung

Verwendung fanden bovine, mononukleäre Zellen, die mit Hilfe eines Ficoll®-Dichtegradienten mit einer Reinheit von über 98% aus EDTA-Blut gewonnen wurden. Nach hypotoner Lyse und zwei Waschgängen mit PBS (jeweils 300 x g, 8 min, 4°C) wurde die Zellsuspension mit dem mAk Bo1 (500 μl unverdünnte Lösung, s. 3.1.5) versetzt und für 30 min bei 4°C inkubiert. Es folgten drei weitere Waschgänge (jeweils 300 x g, 8 min, 4°C) mit MIF-Puffer (s. 3.1.3.1) und eine weitere Inkubation bei 4°C für 30 min mit dem konjugierten Antikörper (DTAF - Zg? M – IgG + M (H + L), 500 μl, 1:100 verdünnt, s. 3.1.5). Nach weiteren drei Waschgängen (s. oben) wurden die Zellen mit 4%igem Paraformaldehyd (gelöst in PBS, s. 3.1.2) 12–24 Stunden lichtgeschützt bei 4°C fixiert. Nach der Fixation wurden die Zellen dreimal mit MIF-Puffer gewaschen (s. oben) und dann in einer Endkonzentration von 4–6 x 104 Zellen/50μl Sheath fluid-Propidiumjodid-Lösung (2 ng Pj/ml Sheath fluid, siehe unten) bei 4°C lichtgeschützt gelagert.

Anmerkungen

Ohne Hinweis auf eine Übernahme.

Sichter
(Graf Isolan), SleepyHollow02

[70.] Ad/Fragment 080 01 - Diskussion
Bearbeitet: 11. July 2014, 07:03 Singulus
Erstellt: 8. July 2014, 23:41 (Graf Isolan)
Ad, Fragment, Frank 2000, Gesichtet, SMWFragment, Schutzlevel sysop, Verschleierung

Typus
Verschleierung
Bearbeiter
Graf Isolan
Gesichtet
Yes.png
Untersuchte Arbeit:
Seite: 80, Zeilen: 1-21
Quelle: Frank 2000
Seite(n): 41, Zeilen: 15-35
Die Erfassung der Fähigkeit von Leukozyten zu phagozytieren, erfordert für die durchflusszytometrische Messung eine Fluoreszenzmarkierung der Ingestionspartikel. Hierzu wurden 1,5 ml mikrobieller Partikel Suspension (MIM) mit 3,5 ml FITC-Puffer (FITC-Endkonzentration 0,00066%) und 50 μl 10%igem Natriumazid (Endkonzentration 0,05%,) in lichtgeschützten Eppendorf-Reaktionsgefäßen (s.3.2.1) für 20 Stunden bei Raumtemperatur im Überkopfschüttler durchmischt. Danach wurde diese Suspension dreimal mit PBS (3.2.4) bei 14.000 x g für 1 Minute gewaschen und dann auf ca 2 x 108 Mikroben/ml PBS (Zellzählkammer nach Bürker (3.1), Fluoreszenzmikroskop (3.1) eingestellt. In aliquoten Teilen zu 1 ml wurde diese Suspension bei –20°C gelagert.

Serum zur Opsonisierung der Mikroben

Zur Opsonisierung der mikrobiellen Partikel wurde natives gepooltes Pferdeserum verwendet, das von 3 gesunden Pferden unter keimarmen Bedingungen (Vacutainer ohne Gerinnungshemmer, 3.2.1) gewonnen wurde. Das Blut wurde bei Raumtemperatur stehengelassen, bis eine deutliche Koagulation sichtbar war. Die Verbindung zwischen der Röhrchenwand und dem Koagulat wurde mit Hilfe einer sterilen Pasteurpipette gelöst. Dann wurden die Röhrchen für 15 Min mit 2000 x g bei Raumtemperatur zentrifugiert. Um noch verbliebene korpuskuläre Bestandteile zu entfernen, wurde der Überstand gewonnen und bei 3.500 x g für 10 Min zentrifugiert. Danach wurde das Serum der drei Tiere zu gleichen Anteilen zusammengegeben (gepoolt). Die Lagerung erfolgte in aliquoten Teilen zu 100 μl, 200 μl und 1 ml bei –80°C. Zum Einsatz kam eine 1:10 mit PBS (3.2.4) verdünnte Gebrauchslösung.

Die Erfassung der Phagozytosefähigkeit von PMN erfordert für die durchflußzytometrische Messung eine Fluoreszenzmarkierung der Ingestionspartikel. Hierzu wurden 3 ml einer standardisierten Streptokokken-Lösung (Omnisorb®, s. 3.1.2) mit 7 ml FITC-Puffer (s. 3.1.3.1, FITC-Endkonzentration 0,015%) und 50 μl 10%igem Natriumazid (Endkonzentration 0,05%, s. 3.1.2) in lichtgeschützten Eppendorf-Reaktionsgefäßen (s. 3.1.1) für 20 Stunden bei Raumtemperatur im Überkopfrüttler durchmischt. Danach wurde diese Suspension dreimal mit PBS bei 14.000 x g für 1 min gewaschen und dann auf 2 x 108 Bakterien/ml PBS (Zellzählkammer nach Bürkner, Fluoreszenzmikroskop s.3.1.1) eingestellt. In aliquoten Teilen zu 1 ml wurde diese Suspension bei –20°C gelagert.

Serum zur Opsonisierung der Streptokokken

Zur Opsonisierung der Bakterien wurde natives Serum verwendet, das aus dem Blut von drei Kühen der Arbeitsgruppe Immunologie der Tierärztlichen Hochschule Hannover unter keimarmen Bedingungen (Vacutainer ohne Gerinnungshemmer, s. 3.1.1) gewonnen wurde. Das Blut wurde bei Raumtemperatur stehengelassen, bis eine deutliche Koagulation sichtbar war. Die Verbindung zwischen der Röhrchenwand und dem Koagulat wurde mit Hilfe einer Pasteurpipette gelöst. Dann wurden die Röhrchen 15 min mit 2.000 x g bei Raumtemperatur zentrifugiert. Um noch verbliebene korpuskuläre Bestandteile zu entfernen, wurde der Überstand gewonnen und bei 3.500 x g für 10 min zentrifugiert. Danach wurde das Serum der drei Tiere zu gleichen Anteilen zusammengegeben (gepoolt). Die Lagerung erfolgte in aliquoten Teilen zu 100μl, 200μl und 1ml bei –80°C. Zum Einsatz kam eine 1:10 mit PBS verdünnte Gebrauchslösung.

Anmerkungen

Im wesentlichen werden hier nur aus "Kühen" "Pferde" und aus "Bakterien" "mikrobielle Partikel".

Kein Hinweis auf eine Übernahme.

Sichter
(Graf Isolan), (Hindemith), (SleepyHollow02)

[71.] Ad/Fragment 083 01 - Diskussion
Bearbeitet: 8. July 2014, 17:55 Hindemith
Erstellt: 8. July 2014, 10:28 (Graf Isolan)
Ad, Fragment, Gesichtet, Rohwer 2004, SMWFragment, Schutzlevel sysop, Verschleierung

Typus
Verschleierung
Bearbeiter
Graf Isolan
Gesichtet
Yes.png
Untersuchte Arbeit:
Seite: 83, Zeilen: 1-14
Quelle: Rohwer 2004
Seite(n): 55, 56, Zeilen: 55:19-26; 56:1-7
3.2.9 Tiere

Für die Untersuchungen standen neben Einsendungen von Blutproben von Patientenbesitzern eine Herde aus 37 Isländerstuten im Alter zwischen 3 und 11 Jahren zur Verfügung. Unter gleichen Haltungsbedingungen waren 14 an Sommerekzem erkrankte, 9 gesunde und 3 Jungtiere mit noch unbekanntem Status untergebracht. An den Probanden wurde eine Beurteilung der klinischen Symptome und deren Entwicklung im Jahresverlauf vorgenommen. Zu den Arbeiten am Tier gehören die Herdenkontrolle des Gesundheitszustandes, sowie die regelmäßige Entnahme von Blutproben.

3.3 Methoden

3.3.1 Blutentnahme

Die Blutentnahme zur Gewinnung und Untersuchung von Leukozyten in vitro erfolgte unter keimarmen Bedingungen mit einem Vacutainersystem (s.3.2.1) durch Punktion der rechten oder linken Vena jugularis. Das Blut wurde in Vacutainerröhrchen aufgenommen und bis zur Verarbeitung, die maximal 24 Stunden nach Entnahme erfolgte, bei Raumtemperatur gelagert.

[Seite 55]

3.2.8 Tiere

Für die Untersuchungen steht neben Einsendungen von Blutproben von Patientenbesitzern eine Herde aus 37 Isländerstuten im Alter zwischen 3 und 11 Jahren zur Verfügung. Unter gleichen Haltungsbedingungen sind 14 an Sommerekzem erkrankte, 9 gesunde und 3 Jungtiere mit noch unbekanntem Status untergebracht (Datenerhebung: Besitzerinformation und FIT, s. 3.3.9). An den Probanden wird eine Beurteilung der klinischen Symptome und deren Entwicklung im Jahresverlauf vorgenommen. Zu den Arbeiten am Tier gehören die Herdenkontrolle des Gesundheitszustandes, sowie die regelmäßige Entnahme von Blutproben.

[Seite 56]

3.3 Methoden

3.3.1 Blutentnahme

Die Blutentnahme zur Gewinnung und Untersuchung von Leukozyten in vitro erfolgte unter keimarmen Bedingungen mit einem Vacutainersystem (s. 3.2.1) durch Punktion der rechten oder linken Vena jugularis. Das Blut wurde in Ka-EDTA Vacutainerröhrchen aufgenommen und bis zur Verarbeitung, die maximal 24 Stunden nach Entnahme erfolgte, bei Raumtemperatur gelagert.

Anmerkungen

Ohne Hinweis auf eine Übernahme.

Sichter
(Graf Isolan) Schumann

[72.] Ad/Fragment 085 12 - Diskussion
Bearbeitet: 11. July 2014, 07:06 Singulus
Erstellt: 10. July 2014, 19:31 (Graf Isolan)
Ad, BauernOpfer, Fragment, Frank 2000, Gesichtet, SMWFragment, Schutzlevel sysop

Typus
BauernOpfer
Bearbeiter
Graf Isolan
Gesichtet
Yes.png
Untersuchte Arbeit:
Seite: 85, Zeilen: 10-31
Quelle: Frank 2000
Seite(n): 56-57, Zeilen: 56: 7-15 - 57: 1-12
Für die Gewinnung von PMN in sehr hoher Reinheit folgte der 30-minütigen Erythrozyten-Sedimentation und anschließender hypotoner Erythrolyse (s.3.3.2.1) eine selektive Transmigration equiner PMN auf rhIL-8 nach FRANK (2000). In vivo führen chemotaktische Stimuli zum Anhaften der zirkulierenden PMN an Gefäßendothelzellen und zur Diapedese. Diese Durchwanderung der Kapillarwand soll hier durch eine künstliche Barriere in Form einer Polycarbonatmembran mit 3 μm großen Poren (s.3.2.1) simuliert werden.

Reinigung der Transmigrationskammer (s.3.1)

Vor der Testdurchführung wurden die Acrylanteile der Kammer in einmolarer Natriumhydroxid-Lösung (s.3.2.2) und die Silikondichtungsmatte (s.3.1) in Aqua tridest. gelegt (60°C, 30 min). Danach wurden sie dreimal mit Aqua tridest. gespült und dann für 30 min zum Trocknen in einen Brutschrank (37°C) gestellt.

Nach der Testdurchführung wurden die Kammerteile zweimal mit Aqua tridest. gespült und in Aqua tridest. gelegt (30 min, Raumtemperatur). Danach wurden sie mit Papiertüchern abgetrocknet und trocken gelagert. Aufgrund von möglichen Veränderungen in Struktur und Oberfläche der Transmigrationskammer empfiehlt der Hersteller keine Autoklavierung derselben durchzuführen. Auch viele Reinigungs- und Desinfektionsmittel sollten nicht verwendet werden (s. Produktinformationen vom Hersteller).

Beschicken der Kammer

Als Orientierungspunkte dienten das aufgestanzte Zeichen „np“ auf den Acrylanteilen der Kammer und die abgeschnittene Ecke der Silikonmatte (s.3.1). Sie befanden sich immer übereinander in der rechten oberen Ecke der Kammer. In die Vertiefungen der Bodenplatte wurden 300μl SFM3 Medium (s.3.2.3) mit Zusatz von 100ng/ml rhIL-8 (s.3.2.4) blasenfrei [einpipettiert.]


FRANK J. (2000) :
Wanderungsverhalten neutrophiler Granulozyten in einem Transmigrationsverfahren
Tierärztliche Hochschule Hannover, Dissertation

[Seite 56]

In vivo führen chemotaktische Stimuli zum Anhaften der zirkulierenden PMN an Gefäßendothelzellen und zur Diapedese. Diese Durchwanderung der Kapillarwand soll hier durch eine künstliche Barriere in Form einer Polycarbonatmembran mit 3 μm großen Poren simuliert werden.

Reinigung der Transmigrationskammer

Vor der Testdurchführung wurden die Acrylanteile der Kammer in einmolarer Natriumhydroxid-Lösung (s. 3.1.2 u. 3.1.8.5) und die Silikondichtungsmatte in Aqua tridest. gelegt (60°C, 30 min). Danach wurden sie dreimal mit Aqua tridest. gespült und dann für eine 30 min zum Trocknen in einen Brutschrank (37°C) gestellt.

[Seite 57]

Nach der Testdurchführung wurden die Kammerteile zweimal mit Aqua tridest. gespült und in Aqua tridest. gelegt (30 min, Raumtemperatur). Danach wurden sie mit Papiertüchern abgetrocknet und trocken gelagert. Aufgrund von möglichen Veränderungen in Struktur und Oberfläche der Transmigrationskammer empfiehlt der Hersteller keine Autoklavierung derselben durchzuführen. Auch viele Reinigungs- und Desinfektionsmittel sollten nicht verwendet werden (siehe Produktinformationen vom Hersteller).

Testdurchführung

Beschicken der Kammer: Als Orientierungspunkte dienten das aufgestanzte Zeichen „np“ auf den Acrylanteilen der Kammer und die abgeschnittene Ecke der Silikonmatte (s. 3.1.8.2). Sie befanden sich immer übereinander in der rechten oberen Ecke der Kammer. In die Vertiefungen der Bodenplatte wurden 300 μl der chemoattraktiven Substanz blasenfrei pipettiert.

Anmerkungen

Wortwörtliche Übernahme ohne jede Kennzeichnung.

Sichter
(Graf Isolan), SleepyHollow02

[73.] Ad/Fragment 086 01 - Diskussion
Bearbeitet: 11. July 2014, 07:08 Singulus
Erstellt: 10. July 2014, 19:57 (Graf Isolan)
Ad, BauernOpfer, Fragment, Frank 2000, Gesichtet, SMWFragment, Schutzlevel sysop

Typus
BauernOpfer
Bearbeiter
Graf Isolan
Gesichtet
Yes.png
Untersuchte Arbeit:
Seite: 86, Zeilen: 1 ff. (komplett)
Quelle: Frank 2000
Seite(n): 57-58, Zeilen: 57: 12 ff. - 58: 5-10
Diese Flüssigkeit wurde mit 115 μl unverdünntem Percoll® (s.3.2.4) unterschichtet, das als eine Art „Auffangkissen“ und somit zur Verminderung der Adhärenz der gewanderten Zellen diente. Das Gesamtvolumen von 415 μl führte zur Bildung eines geringgradig positiven Flüssigkeitsmeniskus, um Luftblasen beim Auflegen der Membran zu vermeiden. Bei der Polycarbonatmembran (s.3.2.1) muß beachtet werden, dass diese eine glänzende (PVP-beschichtete) und eine matte, unbeschichtete Seite besitzt. Nach Angaben des Vertreibers der Membranen (Cytogen, Ober-Mörlen) adhärieren Zellen stärker an PVP als an das unbeschichtete Polycarbonat. Damit die Zellen nicht nach der Migration an der Unterseite der Membran verstärkt adhärieren, zeigte die PVP-Seite in allen Versuchsansätzen nach oben. Die trockene Polycarbonatmembran wurde vorsichtig auf die Vertiefungen gelegt, wobei man die zwei Enden der Membran mit zwei anatomischen Pinzetten (s.3.1) faßte. Die Membran muß dabei U-förmig durchhängen, um sie mittig beginnend nach außen luftblasenfrei auslegen zu können. Anschließend wurde die Silikondichtung aufgelegt, der zweite Acrylanteil der Kammer aufgedrückt und unter leichtem Druck festgeschraubt. Zuletzt wurde die Zellsuspension (200 μl, meist 2 x 107 Zellen/ml SFM10 (s.3.2.3)) in die obere Vertiefung gegeben.

Inkubation

Zur Inkubation wurde die Transmigrationskammer in eine feuchte Kammer gestellt (s.3.1) und diese für den gewünschten Zeitraum, meist für 3 Stunden, bei 37°C und 5% CO2, in einem Brutschrank inkubiert.

Gewinnung der PMN

Die Zellsuspension in den oberen Wells (= nicht gewanderte Zellen) wurde durch gründliches Pipettieren resuspendiert, um adhärente Zellen von der Oberseite der Membran zu lösen und dann vollständig entnommen, ohne dabei die Membran zu beschädigen. Dabei setzt man die Pipettenspitze möglichst am Rand der Membran vorsichtig auf, damit ein Durchstoßen der Membran vermieden wird. Die entnommene Zellsuspension wurde verworfen und die Membran mit einem sterilen Wattetupfer vorsichtig getrocknet. Nach Entfernung der Schraubenmuttern wurde der obere Kammerteil möglichst waagerecht und zügig abgehoben. Hierbei löst sich die Silikonmatte und die Membran mit ab. Nach guter Durchmischung der Zellsuspension (=gewanderte Zellen) und des Percolls® wurde jede der Vertiefungen der unteren Platte geleert. Die Zellsuspension (435 μl, etwa 15 μl Flüssigkeitsverlust pro Well durch das Abheben der Membran) wurde dann in etwa 12 ml PBS (s.3.2.4) in ein 14 ml Röhrchen übertragen, gut durchpipettiert und einmal bei 100 x g und 4°C für 8 Min [zentrifugiert, um Percoll® und andere lösliche Komponenten zu entfernen.]

[Seite 57]

Diese Flüssigkeit wurde mit 115 μl unverdünntem Percoll® (s. 3.1.4) unterschichtet, das als eine Art „Auffangkissen“ und somit zur Verminderung der Adhärenz der gewanderten Zellen diente. Das Gesamtvolumen von 415 μl führte zur Bildung eines geringgradig positiven Flüssigkeitsmeniskus, um Luftblasen beim Auflegen der Membran zu vermeiden. Bei der Polycarbonatmembran (s. 3.1.1 u. 3.1.8.3) muß beachtet werden, daß diese eine glänzende (PVP-beschichtete) und eine matte, unbeschichtete Seite besitzt. Nach Angaben des Vertreibers der Membranen (Cytogen, Ober-Mörlen) adhärieren Zellen stärker an PVP als an das unbeschichtete Polycarbonat. Damit die Zellen nicht nach der Migration an der Unterseite der Membran verstärkt adhärieren, zeigt die PVP-Seite in allen Versuchsansätzen nach oben. Die trockene Polycarbonatmembran wurde vorsichtig auf die Vertiefungen gelegt, wobei man die zwei Enden der Membran mit zwei anatomischen Pinzetten (s. 3.1.1) faßte. Die Membran muß dabei U-förmig durchhängen, um sie mittig beginnend nach außen luftblasenfrei auslegen zu können. Anschließend wurde die Silikondichtung aufgelegt, der zweite Acrylanteil der Kammer aufgedrückt und unter leichtem Druck festgeschraubt. Falls nicht andere Versuchsvorgaben zu berücksichtigen waren, wurde zuletzt die Zellsuspension (200 μl, meist 2 x 107 Zellen/ml R0+ ) in die obere Vertiefung gegeben.

Inkubation: Zur Inkubation wurde die Transmigrationskammer in eine feuchte Kammer gestellt (s. 3.1.8.4) und diese für den gewünschten Zeitraum, normalerweise für 2 Stunden, bei 37°C und 5% CO2, in einem Brutschrank inkubiert.

Gewinnung der Zellfraktionen: Die Zellsuspension in den oberen Wells (= nicht gewanderte Zellen) wurde durch gründliches Pipettieren resuspendiert, um adhärente Zellen von der Oberseite der Membran zu lösen, und dann entnommen. Dabei setzt man die Pipettenspitze möglichst am Rand der Membran vorsichtig auf, damit ein Durchstoßen der Membran vermieden wird. Die entnommene Zellsuspension wurde in ein Probenröhrchen für die Auswertung im Durchflußzytometer gegeben.

Da sich an der Unterseite der Polycarbonatmembran noch Zellen befinden und diese in benachbarte Wells gelangen könnten, wurde nach Entfernung der Schraubenmuttern der obere Teil der Kammer möglichst waagerecht und zügig abgehoben. Hierbei löst sich die Silikonmatte und die Membran mit ab. Nach guter Durchmischung der Zellsuspension (= gewanderte Zellen) und des Percolls® wurde die Vertiefung der unteren Platte geleert.

[Seite 58]

[...] Der nicht für die Zellzahlbestimmung benötigte Teil der Zellsuspension (350 μl, etwa 15 μl Flüssigkeitsverlust pro Well durch das Abheben der Membran) wurde dann in etwa 12 ml PBS in ein 14 ml Röhrchen gegeben und einmal bei 100 x g und 4°C für 8 min zentrifugiert, um Percoll® und andere lösliche Komponenten zu entfernen.

Anmerkungen

Ohne Hinweis auf eine Übernahme. Fortsetzung von Ad/Fragment_085_12. Der ursprüngliche Autor wird einmal auf der vorangegangenen Seite en passant erwähnt.

Sichter
(Graf Isolan), SleepyHollow02

[74.] Ad/Fragment 087 01 - Diskussion
Bearbeitet: 11. July 2014, 07:09 Singulus
Erstellt: 10. July 2014, 20:11 (Graf Isolan)
Ad, BauernOpfer, Fragment, Frank 2000, Gesichtet, SMWFragment, Schutzlevel sysop

Typus
BauernOpfer
Bearbeiter
Graf Isolan
Gesichtet
Yes.png
Untersuchte Arbeit:
Seite: 87, Zeilen: 1-2
Quelle: Frank 2000
Seite(n): 58, Zeilen: 5-11
[Die Zellsuspension (435 μl, etwa 15 μl Flüssigkeitsverlust pro Well durch das Abheben der Membran) wurde dann in etwa 12 ml PBS (s.3.2.4) in ein 14 ml Röhrchen übertragen, gut durchpipettiert und einmal bei 100 x g und 4°C für 8 Min] zentrifugiert, um Percoll® und andere lösliche Komponenten zu entfernen. Der Überstand wurde verworfen und das Zellsediment resuspendiert. Der nicht für die Zellzahlbestimmung benötigte Teil der Zellsuspension (350 μl, etwa 15 μl Flüssigkeitsverlust pro Well durch das Abheben der Membran) wurde dann in etwa 12 ml PBS in ein 14 ml Röhrchen gegeben und einmal bei 100 x g und 4°C für 8 min zentrifugiert, um Percoll® und andere lösliche Komponenten zu entfernen. Der Überstand wurde verworfen und das Zellsediment resuspendiert.
Anmerkungen

Ohne Hinweis auf eine Übernahme. Fortsetzung von Ad/Fragment_085_12 und Ad/Fragment 086 01. Der ursprüngliche Autor wird einmal auf Seite 85 en passant erwähnt.

Sichter
(Graf Isolan), SleepyHollow02

[75.] Ad/Fragment 087 04 - Diskussion
Bearbeitet: 8. July 2014, 17:55 Hindemith
Erstellt: 8. July 2014, 10:37 (Graf Isolan)
Ad, Fragment, Gesichtet, Rohwer 2004, SMWFragment, Schutzlevel sysop, Verschleierung

Typus
Verschleierung
Bearbeiter
Graf Isolan
Gesichtet
Yes.png
Untersuchte Arbeit:
Seite: 87, Zeilen: 4-26
Quelle: Rohwer 2004
Seite(n): 70, Zeilen: 10-32
3.3.3 Durchflusszytometrie

In einem Durchflusszytometer (s.3.1) werden Einzelzellen in einem Probenführungssystem an einem Laserstrahl vorbei geleitet. Gestreutes Licht einer Wellenlänge (hier 488 nm) wird in Richtung des Strahls als so genanntes Vorwärtsstreulicht (Forward Scatter, FSC) oder im 90° Winkel dazu, als Seitwärtsstreulicht (Side Scatter, SSC) erfasst. Durch die Vorwärtsstreuung werden die Größe des Partikels und dessen Refraktionsindex, durch die Seitwärtsstreuung die Komplexität (Oberflächenbeschaffenheit und Granularität) charakterisiert. Die Signale werden von Photomultiplieren aufgefangen und an den angeschlossenen Computer weitergeleitet. Mit Hilfe dieses Computers werden die Geräteeinstellungen kontrolliert, Messereignisse erfasst und gespeichert.

Bei dem für diese Versuche verwendeten Durchflusszytometer handelt es sich um ein FACScan® (s. 3.1) mit einem Argonlaser, der Licht einer Wellenlänge von 488 nm erzeugt. Das Gerät erfasst mit entsprechenden Detektoren (FL-1, FL-2, FL-3) zusätzlich Fluoreszenzlichtemissionen in drei verschiedenen Wellenlängenbereichen (Grünfluoreszenz: 515-545 nm; Orangefluoreszenz: 564-606 nm; Rotfluoreszenz: >650 nm). Jede Zelle oder jedes Partikel wird als Messereignis festgehalten und insgesamt durch fünf verschiedene Parameter (FSC, SSC, FL-1, FL-2, FL-3) charakterisiert.

Mit Hilfe der Software „WinMDI Version 2.8“ erfolgte die Computer gestützte Auswertung der Daten. Ergebnisse wurden einparametrisch als Histogramm oder mehrparametrisch als korrelierte Punkte-, Dichte- oder Konturdiagramme dargestellt. Da die Werte einzelner Parameter stark von den Einstellungen für die FSC, SSC und Fluoreszenzdetektoren abhängen, wurden nur solche Messungen miteinander verglichen, die mit identischen Geräteeinstellungen erfasst wurden.

3.3.13 Durchflusszytometrie

In einem Durchflusszytometer werden Einzelzellen in einem Probenführungssystem an einem Laserstrahl vorbei geleitet. Gestreutes Licht einer Wellenlänge (hier 488 nm) wird in Richtung des Strahls als so genanntes Vorwärtsstreulicht (Forward Scatter, FSC) oder im 90° Winkel dazu, als Seitwärtsstreulicht (Side Scatter, SSC) erfasst. Durch die Vorwärtsstreuung werden die Größe des Partikels und dessen Refraktionsindex, durch die Seitwärtsstreuung die Komplexität (Oberflächenbeschaffenheit und Granularität) charakterisiert. Die Signale werden aufgefangen und an den angeschlossenen Computer weitergeleitet. Mit Hilfe dieses Computers werden die Geräteeinstellungen kontrolliert, Messereignisse erfasst und gespeichert.

Bei dem für diese Versuche verwendeten Durchflusszytometer handelt es sich um ein FACScan® (s. 3.1) mit einem Argonlaser, der Licht einer Wellenlänge von 488 nm erzeugt. Das Gerät erfasst mit entsprechenden Detektoren (FL-1, FL-2, FL-3) Fluoreszenzlichtemissionen in drei verschiedenen Wellenlängenbereichen (Grünfluoreszenz: 515-545 nm; Orangefluoreszenz: 564-606 nm; Rotfluoreszenz: >650 nm). Jede Zelle oder jedes Partikel wird folglich durch fünf verschiedene Parameter (FSC, SSC, FL-1, FL-2, FL-3) charakterisiert und als ein Messereignis festgehalten.

Mit Hilfe der Software „WinMDI Version 2.8“ (TROTTER 1999) erfolgte die computergestützte Auswertung der Daten. Ergebnisse wurden einparametrisch als Histogramm oder mehrparametrisch als korrelierte Punkte-, Dichte- oder Konturdiagramme dargestellt. Da die Werte einzelner Parameter stark von den Einstellungen für die FSC, SSC und Fluoreszenzdetektoren abhängen, wurden nur solche Messungen miteinander verglichen, die mit identischen Geräteeinstellungen erfasst wurden.


TROTTER, J (1999)
WinMDI, version 2.8, free software for the analysis of flow cytometric data.
[Internet: ftp.facs.scripps.edu.]

Anmerkungen

Ohne Hinweis auf eine Übernahme.

Sichter
(Graf Isolan) Schumann

[76.] Ad/Fragment 088 01 - Diskussion
Bearbeitet: 10. July 2014, 00:48 Hindemith
Erstellt: 8. July 2014, 14:14 (Graf Isolan)
Ad, BauernOpfer, Fragment, Gesichtet, Rohwer 2004, SMWFragment, Schutzlevel sysop

Typus
BauernOpfer
Bearbeiter
Graf Isolan
Gesichtet
Yes.png
Untersuchte Arbeit:
Seite: 88, Zeilen: 1ff (komplett)
Quelle: Rohwer 2004
Seite(n): 71, 72, Zeilen: 71: 1ff; 72: 1ff
3.3.3.1 Durchflusszytometrische Leukozytendifferenzierung

Die einzelnen Leukozyzenpopulationen unterscheiden sich in ihrer Größe und Komplexität. Die im peripheren Blut vorliegenden monozytoiden Zellen sowie deren Vorläufer erscheinen im Durchflusszytometer als die größten Zellen (höchster Wert im FSC). Demgegenüber nehmen Lymphozyten und Granulozyten einen ähnlichen Wert im FSC an. Diese beiden Populationen kann man über die innere Beschaffenheit der Zellen, also ihre Komplexität oder Diversität, gemessen im SSC, voneinander abgrenzen (s. Abbildung 9)

Ad 88a diss.png

Abbildung 9: Leukozytendifferenzierung mit dem Durchflusszytometer: Darstellung equiner Leukozyten links als Punktdiagramm („Dot Plot“) und rechts als Konturdiagramm („Contour Plot“) (ROHWER 2004).

In den hier gewählten Darstellungen werden die morphologischen Eigenschaften einer gemischten Leukozytenpopulation dargestellt. Der forward scatter (FSC) Wert ist ein (relatives) Maß für die Zellgröße, der side scatter (SSC) entspricht dem Grad der Zellkomplexität (äußere sowie innere Strukturvielfalt). Die Größe der Werte wird mit „height“ angegeben und ist dimensionslos. In der linken Abbildung werden die Zellen als Punktdiagramm dargestellt. Die Wolke mit dem höchsten Wert für SSC entspricht polymorphkernigen Granulozyten (PMN), diejenige mit dem höchsten Wert für FSC den monozytoiden Zellen. Unten links in der Darstellung befinden sich eingekreist lymphoide mononukleäre Zellen (MNC). Die nicht eingekreisten Punkte ganz links unten stehen für Zellfragmente (Zelldetritus). Jeder Punkt im Diagramm entspricht einem Messereignis im Durchflusszytometer. Die rechte Abbildung zeigt ein Konturdiagramm der identischen Leukozytenpopulation. Jede Linie umfasst einen Bereich definierter, farblich codierter Zelldichte.

Zur Definition einzelner Untergruppen der Messereignisse („Events“) wurden nach der Messung software-gestützt elektronische „Fenster“ (so genannte „Gates“) gesetzt und zum Teil mehrere Fenster logisch miteinander verknüpft.

Durchflusszytometrische Leukozytendifferenzierung

Die einzelnen Leukozyzenpopulationen unterscheiden sich in ihrer Größe und Komplexität. Die im peripheren Blut vorliegenden monozytoiden Zellen sowie deren Vorläufer erscheinen im Durchflusszytometer als die größten Zellen (höchster Wert im FSC). Demgegenüber nehmen Lymphozyten und Granulozyten einen ähnlichen Wert im FSC an. Diese beiden Populationen kann man über die innere Beschaffenheit der Zellen, also ihre Komplexität oder Diversität, gemessen im SSC, voneinander abgrenzen (s. Abb. 3)

Ad 88a source.png

Abb. 3 Leukozytendifferenzierung mit dem Durchflusszytometer: Darstellung equiner Leukozyten als Punktdiagramm („Dot Plot“) und Konturdiagramm („Contour Plot“)

In den hier gewählten Darstellungen werden die morphologischen Eigenschaften einer gemischten Leukozytenpopulation dargestellt. Der forward scatter (FSC) Wert ist ein (relatives) Maß für die Zellgröße, der side scatter (SSC) entspricht dem Grad der Zellkomplexität (äußere sowie innere Strukturvielfalt). Die Größe der Werte wird mit height angegeben und ist einheitslos. In der linken Abbildung werden die Zellen als Punktdiagramm dargestellt. Die Wolke mit dem höchsten Wert für SSC entspricht polymorphkernigen Granulozyten (PMN), diejeinge [sic] mit dem höchsten Wert für FSC den monozytoiden Zellen (Monos) (vgl. Abb. 6). Unten links in der Darstellung befinden sich lymphoide, mononukleäre Zellen (MNC). Jeder Punkt im Diagramm entspricht einem Messereignis im Durchflusszytometer. Die rechte Abbildung zeigt ein Konturdiagramm der identischen Leukozytenpopulation. Jede Linie umfasst einen Bereich definierter, farblich codierter Zelldichte.

Zur Definition einzelner Untergruppen der Messereignisse („Events“) wurden nach der Messung software-gestützt elektronische „Fenster“ (so genannte „Gates“) gesetzt und zum

[Seite 72]

Teil mehrere Fenster logisch miteinander verknüpft.

Anmerkungen

Einzig die Abbildung wird (einigermaßen) korrekt referenziert. Dass der umgebende Text (nicht nur der Bildlegende) auch vollständig aus Rohwer [2004] stammt, wird in keiner Weise ersichtlich (gemacht).

Das Fragment wirft die Frage auf, warum eine Quellenangabe nur für die Abbildung erfolgte.

Sichter
(Graf Isolan), Hindemith

[77.] Ad/Fragment 089 01 - Diskussion
Bearbeitet: 10. July 2014, 00:55 Hindemith
Erstellt: 8. July 2014, 15:25 (SleepyHollow02)
Ad, BauernOpfer, Fragment, Gesichtet, Rohwer 2004, SMWFragment, Schutzlevel sysop

Typus
BauernOpfer
Bearbeiter
SleepyHollow02
Gesichtet
Yes.png
Untersuchte Arbeit:
Seite: 89, Zeilen: 1-12
Quelle: Rohwer 2004
Seite(n): 72, Zeilen: 1 ff.
[So wurden bspw. in Mischungen aus] PMN und MNC die PMN anhand ihrer charakteristischen Morphologie im FSC/SSC-Punktediagramm identifiziert (Abbildung 10 R1: Region 1) und im FL 3/SSC-Punktediagramm die vitalen Zellen (R2: Region 2). Eine Verknüpfung von R1 und R2 bot somit ein „Fenster“ auf vitale PMN (Abbildung 10).

Ad 89a diss.png

Abbildung 10: Logische Verknüpfung durchflusszytometrischer Daten am Beispiel vitaler equiner PMN (ROHWER 2004).

Im ersten Fenster links sind die morphologisch trennbaren Populationen kernhaltiger Zellen aus dem peripheren Blut von Pferden dargestellt (s 3.2.9). Über eine Software gestützte Markierung werden in diesem Beispiel nur die PMN ausgewählt. Das mittlere Bild differenziert zwischen Zellen, deren DNA Propidiumjodid eingelagert haben (membrandefekte Zellen, rechte Hälfte des mittleren Bildes) und vitalen Zellen (linker Rand). Im Fenster rechts werden nur noch die lebenden PMN morphologisch dargestellt und können so qualitativ und quantitativ (s.3.3.3) ausgewertet werden.

So wurden bspw. in Mischungen aus PMN und MNC die PMN anhand ihrer charakteristischen Morphologie im FSC/SSC-Punktediagramm identifiziert (R1: Region 1) und im FL-3/SSC-Punktediagramm die vitalen Zellen (R2: Region 2). Eine Verknüpfung von R1 und R2 bot somit ein „Fenster“ auf vitale PMN (s. Abb. 4).

Ad 89a source.png

Abb. 4 Logische Verknüpfung durchflusszytometrischer Daten am Beispiel vitaler equiner PMN

Im ersten Fenster links sind die morphologisch trennbaren Populationen kernhaltiger Zellen aus dem peripheren Blut von Pferden dargestellt (s. 3.3.7). Über eine software-gestützte Markierung werden in diesem Beispiel nur die PMN ausgewählt. Das mittlere Bild differenziert zwischen Zellen, deren DNA Propidiumjodid eingelagert haben (membrandefekte Zellen, rechter Rand des mittleren Bildes) und vitalen Zellen. Im Fenster rechts werden nur noch die lebenden PMN morphologisch dargstellt.

Anmerkungen

Quelle ist beim Abbildungsnachweis benannt, nicht aber beim Text davor und danach.

Sichter
(SleepyHollow02), Hindemith

[78.] Ad/Fragment 091 05 - Diskussion
Bearbeitet: 10. July 2014, 07:34 Singulus
Erstellt: 9. July 2014, 11:30 (Graf Isolan)
Ad, Fragment, Gesichtet, SMWFragment, Scheibner 2000, Schutzlevel sysop, Verschleierung

Typus
Verschleierung
Bearbeiter
Graf Isolan
Gesichtet
Yes.png
Untersuchte Arbeit:
Seite: 91, Zeilen: 5-26
Quelle: Scheibner 2000
Seite(n): 69-70, Zeilen: 69: 2-3, 24-25, 27-28, 70: 1-16
3.3.4.3 Präparation der RNA aus equinen Leukozyten mit dem Machery&Nagel Nucleo Spin RNA

KitDas [sic] beim Machery & Nagel Nucleo Spin RNA Kit eingesetzte Prinzip nutzte die Bindung von Nukleinsäuren an Glasfaseroberflächen, wie bei den Kits der Firma Qiagen (s.unten) besprochen. Das Machery&Nagel Nucleo Spin RNA II Kit enthielt zusätzlich DNase I und den dazugehörigen Reaktionspuffer. 400 μl Puffer RA1 (Kitbestandteil) und 4 μl ß Mercaptoäthanol wurden in einem 1,6 ml Reaktionsgefäß vorgelegt und zur 4 x 103 Zellen wurden hinzugefügt [sic] und durch mehrmaliges Auf- und Abpipettieren gut gemischt. Anschließend wurden 250 μl 96 % Äthanol hinzugefügt und der Isolierungsansatz auf einem Schüttler gut durchmischt. Die Nucleo Spin Säule (Kitbestandteil) wurde in ein 2 ml Auffanggefäß gestellt, mit 750 μl RNA-Isolierungsansatz beladen und für 1 Min bei 10.000 x g zentrifugiert. Der Durchfluss wurde verworfen, die Nucleo Spin Säule in ein neues Auffanggefäß überführt und für 1 Min bei 8000 g zentrifugiert. 10 μl rekonstitutierter DNase I (Kitbestandteil) und 90 μl DNase-Reaktionspuffer (Kitbestandteil) wurden miteinander gemischt und davon 95 μl direkt auf die Nucleo Spin Säulchen-Membran pipettiert und 15 min bei 24 °C inkubiert. Anschließend wurden 500 μl Puffer RA2 (Kitbestandteil) auf die Nucleo-Spin Säule gegeben. Es folgte 1 min Zentrifugation bei 8.000 x g. Danach wurden Durchfluß und Auffanggefäß verworfen und die Nucleo Spin Säule in ein neues 2 ml Auffanggefäß umgesetzt. 600 μl Puffer RA3 (Kitbestandteil) wurden auf die Nucleo Spin Säule pipettiert und 1 min bei 8.000 x g zentrifugiert. Der Durchfluß wurde entsorgt. 250 μl Puffer RA3 wurden auf die Nucleo Spin Säule pipettiert und 2 min bei 10.000 x g zentrifugiert. Danach wurde die Nucleo Spin Säule vorsichtig in ein neues 1,6 ml Reaktionsgefäß überführt und 50 μl RNase freies Wasser (s.3.2.8) dazugegeben. Die RNA wurde durch 1 min Zentrifugation bei 10.000 x g eluiert.

[Seite 69]

Das beim Machery&Nagel Nucleo Spin RNA Kit eingesetzte Prinzip nutzte die Bindung von Nukleinsäuren an Glasfaseroberflächen, wie bei den Kits der Firma Qiagen besprochen.

Mit dem Machery&Nagel Nucleo Spin RNA Kit wurde entsprechend der Vorschrift "Isolierung aus biologischen Flüssigkeiten" RNA isoliert. 400 μl Puffer RA1 und 4 μl ß Mercaptoethanol wurden in einem 1.6 ml Reaktionsgefäß vorgelegt. 100 μl Probe wurden hinzugefügt und durch mehrmaliges Auf- und Abpipettieren gut gemischt.

[...]

Das Machery&Nagel Nucleo Spin RNA II Kit enthielt zusätzlich DNase I und den dazugehörigen Reaktionspuffer.

Das eingesetzte Herstellerprotokoll lautete wie folgt:

400 μl Puffer RA1 und 4 μl ß Mercaptoethanol wurden in einem 1,6 ml Reaktionsgefäß vorgelegt. 100 μl Probe wurden hinzugefügt und durch mehrmaliges Auf- und Abpipettieren

[Seite 70]

gut gemischt. Anschließend wurden 250 μl 96 % Ethanol hinzugefügt und der Isolierungsansatz auf einem Schüttler geschüttelt. Die Nucleo Spin Säule wurde in ein 2 ml Auffanggefäß gegeben und mit 750 μl RNA-Isolierungsansatz beladen. Anschließend wurde 1 min bei 8000 x g zentrifugiert. Der Durchfluß wurde verworfen und die Nucleo Spin Säule in ein neues Auffanggefäß überführt und 1 min bei maximaler Zentrifugengeschwindigkeit zentrifugiert. 10 μl rekonstitutierter DNase I und 90 μl DNase-Reaktionspuffer wurden miteinander gemischt und davon 95 μl direkt auf die Nucleo Spin Säulchen-Membran pipettiert und 15 min bei 24 °C inkubiert. Anschließend wurden 500 μl Puffer RA2 auf die Nucleo Spin Säule gegeben. Es folgte 1 min Zentrifugation bei 8000 x g. Danach wurden Durchfluß und Auffanggefäß verworfen und die Nucleo Spin Säule in ein neues 2 ml Auffanggefäß umgesetzt. 600 μl Puffer RA3 wurden auf die Nucleo Spin Säule pipettiert und 1 min bei 8000 x g zentrifugiert. Der Durchfluß wurde entsorgt. 250 μl Puffer RA3 wurden auf die Nucleo Spin Säule pipettiert und 2 min bei Maximalgeschwindigkeit zentrifugiert. Danach wurde die Nucleo Spin Säule vorsichtig in ein neues 1,6 ml Reaktionsgefäß überführt und 50 μl RNase freies Wasser dazugegeben. Die RNA wurde durch 1 min Zentrifugation bei Maximalgeschwindigkeit eluiert.

Anmerkungen

Ohne Hinweis auf eine Übernahme.

Warum kann nicht wie im Original bei einer derartigen wörtlichen Übereinstimmung auf das "Herstellerprotokoll" verwiesen werden?

Interessanterweise sind an einer Stelle gegenüber der Vorlage die Zentrifugengeschwindigkeiten vertauscht und statt 1 min mit der "maximalen Zentrifugengeschwindigkeit" wird nur bei "8000 g" zentrifugiert.

Sichter
(Graf Isolan), SleepyHollow02

[79.] Ad/Fragment 092 01 - Diskussion
Bearbeitet: 10. July 2014, 07:32 Singulus
Erstellt: 9. July 2014, 00:20 (Graf Isolan)
Ad, Fragment, Gesichtet, SMWFragment, Scheibner 2000, Schutzlevel sysop, Verschleierung

Typus
Verschleierung
Bearbeiter
Graf Isolan
Gesichtet
Yes.png
Untersuchte Arbeit:
Seite: 92, Zeilen: 1-21
Quelle: Scheibner 2000
Seite(n): 66-67, Zeilen: 66:23-28 - 67:1-14
Das Kit basiert auf dem Prinzip, dass Nukleinsäuren in Gegenwart eines chaotropen Salzes an

Glasoberflächen binden. Ein anschließender Waschvorgang entfernt die Verunreinigungen. (VOGELSTEIN & GILLESPIE 1979; BOOM et al. 1990; COLPAN 1992).

In Anlehnung an die Originalanleitung des RNeasy Mini Kits wurde RNA folgendermaßen isoliert: 400 μl Puffer RLT und 4 μl ß-Mercaptoethanol wurden in ein 1,6 ml Reaktionsgefäß vorgelegt, 4 x 103 Zellen zugegeben und durch mehrmaliges Auf- und Abpipettieren gemischt.

Danach wurden 400 μl 70 % Äthanol zur Probe hinzugefügt und alles durch starkes Schütteln mit einem elektrischen Schüttler gut gemischt. Die RNeasy-Säule wurde in ein 2 ml Auffanggefäß gegeben und mit 700 μl des Probenansatzes beladen. Es wurde bei 7.500 x g für 15 sekunden zentrifugiert. Der Durchfluss wurde verworfen. Anschließend wurde der verbliebene Rest an Probenansatz auf die RNeasy-Säule gegeben und wiederum 15 sek bei 7.500 x g zentrifugiert. Der Durchfluss wurde verworfen. 700 μl Puffer RW1 wurden auf die RNeasy-Säule aufgebracht und bei 7.500 x g 15 sek zentrifugiert. Durchfluss und Auffanggefäß wurden verworfen und die RNeasy-Säule in ein neues Auffanggefäß gegeben. 500 μl Puffer RPE wurden zugegeben und bei 7.500 x g für 15 sek zentrifugiert. Der Durchfluss wurde verworfen. Es erfolgte eine erneute Zugabe von 500 μl Puffer RPE. Danach wurde 2 Min bei 17.000 x g. zentrifugiert, um den Puffer RPE vollständig zu entfernen. Die RNeasy-Säule wurde anschließend vorsichtig in ein steriles 1,5 ml Mikroreaktionsgefäß gegeben. 50 μl RNase-freies Wasser wurden auf die RNeasy-Säule pipettiert und 1 Min bei 10.000 g. zentrifugiert.


BOOM R, SOL CJA, SALIMANS MMM, JANSEN CL, WERTHEIM-VANDILLEN PME & VAN DER NOORDAA J. (1990) :
Rapid and Simple Method for Purification of Nucleic Acids.
J. Clin. Microbiol. ,28, 495-503

COLPAN M. (1992) :
Vorrichtung und Verfahren zur Isolierung und Reinigung von Nukleinsäuren.
Eur. Pat. Appl. ,17, 56-68

VOGELSTEIN B & GILLESPIE D. (1979) :
Preparative and analytical purification of DNA from agarose.
Proc. Natl. Acad. Sci. USA,76, 615-619

[Seite 66]

Das Kit basiert auf dem Prinzip, dass Nukleinsäuren im Gegenwart eines chaotropen Salzes an Glasoberflächen binden. Ein anschließender Waschvorgang entfernt die Verunreinigungen. (VOGELSTEIN u. GILLESPIE 1979; BOOM et al. 1990; COLPAN 1992).

In Anlehnung an die Originalanleitung des RNeasy Mini Kits wurde folgendermaßen RNA isoliert. 400 μl Puffer RLT und 4 μl ß-Mercaptoethanol wurden in ein 1,6 ml Reaktionsgefäß vorgelegt, 100 μl Probe zugegeben und durch mehrmaliges Auf- und Abpipettieren gemischt.

[Seite 67]

Danach wurden 400 μl 70 % Ethanol zur Probe hinzugefügt und alles durch starkes Schütteln mit einem elektrischen Schüttler gut gemischt. Die RNeasy-Säule wurde in ein 2 ml Auffanggefäß gegeben und mit 700 μl des Probenansatzes beladen. Es wurde bei 7500 x g 15 sek zentrifugiert. Der Durchfluß wurde verworfen. Anschließend wurde der verbliebene Rest an Probenansatz auf die RNeasy-Säule gegeben und wiederrum 15 sek bei 7500 x g zentrifugiert. Der Durchfluß wurde verworfen. 700 μl Puffer RW1 wurden auf die RNeasy- Säule aufgebracht und bei 7500 x g 15 sek zentrifugiert. Durchfluß und Auffanggefäß wurden verworfen und die RNeasy-Säule in ein neues Auffanggefäß gegeben. 500 μl Puffer RPE wurden zugegeben und bei 7500 x g 15 sek zentrifugiert. Der Durchfluß wurde verworfen. Es erfolgte eine erneute Zugabe von 500 μl Puffer RPE. Danach wurde 2 min bei Maximalgeschwindigkeit zentrifugiert, um den Puffer RPE vollständig zu entfernen. Die RNeasy-Säule wurde anschließend vorsichtig in ein steriles 1,5 ml Mikroreaktionsgefäß gegeben. 50 μl RNase-freies Wasser wurden auf die RNeasy-Säule pipettiert und 1 min bei Maximalgeschwindigkeit zentrifugiert.


BOOM, R., SOL, C.J.A., SALIMANS, M.M.M., JANSEN, C.L., WERTHEIM-VAN DILLEN, P.M.E. u. VAN DER NOORDAA, J. (1990):
Rapid and Simple Method for Purification of Nucleic Acids.
J Clin Microbiol, 28:495-503.

COLPAN, M. (1992):
Vorrichtung und Verfahren zur Isolierung und Reinigung von Nukleinsäuren.
Eur Pat Appl No 616639

VOGELSTEIN, B. u. GILLESPIE, D. (1979):
Preparative and analytical purification of DNA from agarose.
Proc Natl Acad Sci USA, 76:615-619

Anmerkungen

Ohne Hinweis auf eine Übernahme.

Sichter
(Graf Isolan), SleepyHollow02

[80.] Ad/Fragment 097 28 - Diskussion
Bearbeitet: 8. July 2014, 17:44 Hindemith
Erstellt: 7. July 2014, 14:47 (SleepyHollow02)
Ad, Becker 1999, Fragment, Gesichtet, SMWFragment, Schutzlevel sysop, Verschleierung

Typus
Verschleierung
Bearbeiter
SleepyHollow02
Gesichtet
Yes.png
Untersuchte Arbeit:
Seite: 97, Zeilen: 28-31
Quelle: Becker 1999
Seite(n): 92, Zeilen: 8-15
Um Missverständnisse auszuschließen, sei erwähnt, dass dieses Verfahren nicht mit der serial dilution PCR (syn. limiting dilution PCR) identisch oder auch nur ähnlich ist, bis auf die Tatsache, dass in beiden Methoden DNA-Verdünnungen eingesetzt werden. Bei der limiting dilution PCR wird die DNA wesentlich stärker verdünnt (bis keine Amplifikationsprodukte [mehr entstehen können!) und die Auswertung erfolgt in Form von diskreten Ja-Nein-Ereignissen über eine Poisson-Verteilung.] Nur um Mißverständnisse zur neuen Plotmethode auszuschließen, sei noch einmal erwähnt, daß dieses Verfahren nicht mit der serial dilution PCR (syn. limiting dilution PCR) identisch oder auch nur ähnlich ist, bis auf die Tatsache, daß in beiden Methoden DNA-Verdünnungen eingesetzt werden. Bei der limiting dilution PCR wird die DNA

wesentlich stärker verdünnt (bis keine Amplifikationsprodukte mehr entstehen können!) und die Auswertung erfolgt in Form von diskreten Ja-Nein-Ereignissen über die Poisson-Verteilung, (s. a. Kapitel 1.4.3.3).

Anmerkungen

Kein Hinweis auf die Quelle.

Sichter
(SleepyHollow02) Schumann

[81.] Ad/Fragment 098 01 - Diskussion
Bearbeitet: 10. July 2014, 00:14 Hindemith
Erstellt: 7. July 2014, 14:50 (SleepyHollow02)
Ad, Becker 1999, Fragment, Gesichtet, SMWFragment, Schutzlevel sysop, Verschleierung

Typus
Verschleierung
Bearbeiter
SleepyHollow02
Gesichtet
Yes.png
Untersuchte Arbeit:
Seite: 98, Zeilen: 1-16, 19-30
Quelle: Becker 1999
Seite(n): 47, 57, 59, 73, 92, Zeilen: 47: 18ff; 57: 2 ff.; 59: 3 ff.; 73: 11 ff.; 92: 12ff
[Bei der limiting dilution PCR wird die DNA wesentlich stärker verdünnt (bis keine Amplifikationsprodukte] mehr entstehen können!) und die Auswertung erfolgt in Form von diskreten Ja-Nein-Ereignissen über eine Poisson-Verteilung.

3.3.4.10 Fotodokumentation und Quantifizierung

Zur Quantifizierung von PCR-Produkten werden digitale Aufnahmen von Agarosegelen verwendet. Das Programm „Gel-Pro Analyzer“ ermöglicht eine Quantifizierung von eindimensionalen Gelaufnahmen und die Darstellung der Bandenintensität In OD (Optische Dichte, oder Extinktion in der Photometrie).

Optische Dichte ist die logarithmische Funktion der Transmission. Während bei der Photometrie direkt die OD bestimmt wird (z.B. bei der photometrischen Quantifizierung der DNA), ist dies bei einer Kamera oder einem Scanner nicht möglich. Alle erhaltenen Werte sind relative Aussagen, weil es sich sehr schwierig gestaltet, ein Aufnahmesystem optimal einzustellen und zu kalibrieren, um die Absolutmengen berechnen zu können.

Die Aufnahmen zeigten oft geringfügig dunklere Werte im Außenbereich als in der Mitte. Dieser Fehler ist wahrscheinlich von den optischen Linsen erzeugt, da er radiär erscheint. Diese Inhomogenität würde einen systematischen, leicht zu umgehenden Fehler erzeugen. Banden in der Mitte hätten andere Werte als die gleiche DNA-Menge in einer Randzone. [...]

Alle Aufnahmen von Gelen haben neben den fluoreszierenden DNA-Banden auch einen nicht ganz schwarzen Hintergrund durch die unspezifische Fluoreszenz der verwendeten Farbstoffe. Dieser Hintergrund muß optisch oder rechnerisch entfernt werden, um die DNA-Banden eines Gels auswerten zu können. Der Hintergrund einer Aufnahme läßt sich mit Gel-Pro Analyzer automatisch subtrahieren. Dabei wird ein sogenanntes „Join Valleys“ Tool mit einem vorher bestimmten Durchmesser über das Bild gefahren und aus diesen Daten der Hintergrund von den Bandenintensitäten unterschieden und gleichzeitig subtrahiert.

Bei der Quantifizierung großer DNA-Mengen auf einem Gel zeigt sich oft ein sogenannter Halo. Um die eigentliche Bande herum befindet sich ein Lichthof in der Aufnahme. Dieser entsteht, besonders bei dickeren Gelen, durch Streustrahlung der gefärbten DNA horizontal in das Gel. Dieses Phänomen zeigt sich deutlich sowohl auf der Aufnahme als auch auf dem Quantifizierungsplot. Eine theoretische Lösung dieses Problems konnte nicht gezeigt werden.

[Seite 47:]

Zur Quantifizierung von PCR-Produkten werden Videoaufnahmen von Agarosegelen verwendet. Es wurden im Laufe der Zeit zwei verschiedene Systeme eingesetzt.

[Seite 57:]

Alle Aufnahmen von Gelen haben neben den fluoreszierenden DNA-Banden auch einen nicht ganz schwarzen Hintergrund durch die unspezifische Fluoreszenz der verwendeten Farbstoffe (s. a. Abbildung 3 in Kapitel 4.7). Dieser Hintergrund muß optisch oder rechnerisch entfernt werden, um die DNA-Banden eines Gels auswerten zu können.

Der Hintergrund einer Aufnahme läßt sich mit NIH Image automatisch subtrahieren. Dabei wird ein sogenannter rolling ball mit einem vorher bestimmten Durchmesser über das Bild gefahren und aus diesen Daten der Hintergrund von den Bandenintensitäten unterschieden und gleichzeitig subtrahiert.

[...]

Optische Dichte (OD, oder Extinktion in der Photometrie) ist die logarithmische Funktion der Transmission. Während bei der Photometrie direkt die OD bestimmt wird (z.B. bei der photometrischen Quantifizierung der DNA), ist dies bei einer CCDKamera oder einem Scanner nicht möglich. Alle erhaltenen Werte sind relative Aussagen, deshalb muß immer ein Standard auf der gleichen Aufnahme mitbestimmt werden, um die Absolutmengen berechnen zu können.

[Seite 59:]

Die Aufnahmen zeigten geringfügig dunklere Werte (10 von 256) im Aussenbereich als in der Mitte. Dieser Fehler ist wahrscheinlich von den optischen Linsen erzeugt, da er radiär erscheint. Diese Inhomogenität würde einen systematischen, leicht zu umgehenden Fehler erzeugen. Banden in der Mitte hätten andere Werte als die gleiche DNA-Menge in einer Randzone.

[Seite 73:]

Bei der Quantifizierung großer DNA-Mengen auf einem Gel (ab ca. 20 ng pro Spur) zeigt sich oft ein sogenannter Halo. Um die eigentliche Bande herum befindet sich ein Lichthof in der Aufnahme. Dieser entsteht, besonders bei dickeren Gelen, durch Streustrahlung der gefärbten DNA horizontal in das Gel. Dieses Phänomen zeigt sich deutlich sowohl auf der Aufnahme als auch auf dem Quantifizierungsplot.

Eine theoretische Lösung dieses Problems konnte nicht gezeigt werden. In dieser Arbeit wurde es als Artefakt gewertet und zusammen mit dem sonstigen Hintergrund geometrisch in dem Quantifizierungsplot abgetrennt.

[Seite 92:]

Bei der limiting dilution PCR wird die DNA wesentlich stärker verdünnt (bis keine Amplifikationsprodukte mehr entstehen können!) und die Auswertung erfolgt in Form von diskreten Ja-Nein-Ereignissen über die Poisson-Verteilung, (s. a. Kapitel 1.4.3.3).

Anmerkungen

Kein Hinweis auf die Quelle.

Sichter
(SleepyHollow02), Hindemith

[82.] Ad/Fragment 099 01 - Diskussion
Bearbeitet: 8. July 2014, 17:45 Hindemith
Erstellt: 7. July 2014, 15:02 (SleepyHollow02)
Ad, Becker 1999, Fragment, Gesichtet, SMWFragment, Schutzlevel sysop, Verschleierung

Typus
Verschleierung
Bearbeiter
SleepyHollow02
Gesichtet
Yes.png
Untersuchte Arbeit:
Seite: 99, Zeilen: 1-2
Quelle: Becker 1999
Seite(n): 73, Zeilen: 16-18
In dieser Arbeit wurde es als Artefakt gewertet und zusammen mit dem sonstigen Hintergrund geometrisch in dem Quantifizierungsplot abgetrennt. In dieser Arbeit wurde es als Artefakt gewertet und zusammen mit dem sonstigen Hintergrund geometrisch in dem Quantifizierungsplot abgetrennt.
Anmerkungen

Kein Hinweis auf die Quelle.

Die Übernahme beginnt auf der Vorseite.

Sichter
(SleepyHollow02) Schumann

[83.] Ad/Fragment 100 08 - Diskussion
Bearbeitet: 9. July 2014, 23:27 Hindemith
Erstellt: 6. July 2014, 17:22 (SleepyHollow02)
Ad, Bente 2003, Fragment, Gesichtet, SMWFragment, Schutzlevel sysop, Verschleierung

Typus
Verschleierung
Bearbeiter
SleepyHollow02
Gesichtet
Yes.png
Untersuchte Arbeit:
Seite: 100, Zeilen: 8-20
Quelle: Bente 2003
Seite(n): 80 f., Zeilen: 80. 24 ff.; 81 1 ff.
3.3.5 SYBR Green TM real-time PCR

Für die Etablierung eines Sybr Green™ PCR-Protokolls wurde das Brilliant™ SYBR Green QPCR Master Mix™ Kit (s.3.2.2) verwendet.

Die Synthese der cDNA erfolgte nach gleichem Protokoll (s.3.3.4.6) wie für konventionelle PCR. Für die SYBR Green™ PCR wurden 4 μl der synthetisierten cDNA mit 25 μl des zweifach konzentrierten Mastermixes, sowie 1 μl eines Primers (10 pmol), 0,75 μl des vorher 1 zu 500 verdünnten Referenzfarbstoffes ROX (Endkonzentration 30 nM) und 18,25 μl sterilen Wassers (s.3.2.2) vorsichtig in einem 0,5 ml QRT-PCR Reaktionsgefäß (s.3.2.1) gemischt. Der Mastermix beinhaltete dabei folgendes: MgCl2, dNTPs, Tris-HCl, KCl, SureStart™ Taq-Polymerase. Angaben zur Konzentration dieser Ionen wurden vom Hersteller nicht gemacht. Nach der Mischung aller Reaktionskomponenten wurde das Reaktionsgefäß in das real-time PCR Gerät (Mx 4000, STRATAGENE; s.3.1) überführt und folgendes Programm gestartet:

Ad 100a diss.png

3.2.7 SYBR Green™ real-time PCR

Für die Etablierung eines Sybr Green™ PCR-Protokolls wurde das Brilliant™ SYBR Green QPCR Master Mix™ Kit (9.2.1) verwendet.

Die Synthese der cDNA erfolgte nach einem laboreigenen optimierten Protokoll (siehe Protokoll 6) in einem 40 μl Reaktionsansatz in 0,5 ml-Reaktionsgefäßen. Für die SYBR Green™ PCR wurden 6 μl für Protokoll 2 und 4 μl für Protokoll 6 der synthetisierten cDNA mit 25 μl des zweifach konzentrierten Mastermixes, sowie 1 μl eines Primers ([10 pmol] - Protokoll 2; [50 pmol] - Protokoll 6), 0,75 μl des vorher 1 zu 500 verdünnten Referenzfarbstoffes ROX (Endkonzentration 30 nM) und 16,25 μl bzw. 18,25 μl sterilen Wassers (9.3.6) vorsichtig in einem 0,5 μl QRT-PCR Reaktionsgefäß (9.6.2) gemischt. Der Mastermix beinhaltete dabei folgende Ionen: MgCl2, dNTPs, Tris-HCl, KCl, SureStart™ Taq-Polymerase. Angaben zur Konzentration dieser Ionen wurden vom Hersteller nicht gemacht (9.2.1).

[Seite 81:]

Nach der Mischung aller Reaktionskomponenten wurde das Reaktionsgefäß in das real-time PCR Gerät (Mx 4000, STRATAGENE; 9.7) überführt und folgendes Programm gestartet:

Ad 100a source.png

Anmerkungen

Kein Hinweis auf die Quelle.

Sichter
(SleepyHollow02), Hindemith

[84.] Ad/Fragment 101 01 - Diskussion
Bearbeitet: 9. July 2014, 23:30 Hindemith
Erstellt: 6. July 2014, 17:29 (SleepyHollow02)
Ad, Bente 2003, Fragment, Gesichtet, SMWFragment, Schutzlevel sysop, Verschleierung

Typus
Verschleierung
Bearbeiter
SleepyHollow02
Gesichtet
Yes.png
Untersuchte Arbeit:
Seite: 101, Zeilen: 1-10
Quelle: Bente 2003
Seite(n): 81, 85, 86, Zeilen: 81: 3-7; 85: unten; 86: 1 ff.
Während des Programms erfolgte die Auswertung anhand einer Schmelzpunktanalyse. Dazu

wurde das PCR-Produkt von 50 °C auf 95 °C erhitzt und kontinuierlich die Fluoreszenz in 1 °C Schritten (30 sec. je 1 °C) gemessen.

3.3.5.1 Auswertung und Quantifizierung der SYBR Green tm real-time PCR

Die Anregung des SYBR Greens™ erfolgte bei 497 nm, die Anregung des Referenzfarbstoffs ROX bei 584 nm. Die emittierte Fluoreszenz des SYBR Greens™ wurde während des Annealingschritts bei 520 nm gemessen. Die emittierte Fluoreszenz des Referenzfarbstoffs ROX wurde ebenso während des Annealingschritts bei 612 nm gemessen. Die Auswertung des Laufs wurde mittels eines Dell Computers (Microsoft Windows 98 als Betriebssystem) mit der Software Mx4000 v3.00 Build 95, Schema 38 der Fa. STRATAGENE durchgeführt.

Während des Programms erfolgte die Auswertung (siehe 3.2.9.1). An dieses Programm

anschließend erfolgte eine Schmelzpunktanalyse. Dazu wurde das PCR-Produkt von 50 °C auf 95 °C erhitzt und kontinuierlich die Fluoreszenz in 1 °C Schritten (Dauer je 1 °C jeweils 30 sec) gemessen.

[Seite 85:]

3.2.9.1 Auswertung der SYBR Green™ real-time PCR

Die Anregung des SYBR Greens™ erfolgte bei 497 nm, die Anregung des Referenzfarbstoffs ROX bei 584 nm. Die emittierte Fluoreszenz des SYBR Greens™ wurde während des Annealingschritts bei 520 nm gemessen. Die emittierte Fluoreszenz des Referenzfarbstoffs

[Seite 86:]

ROX wurde ebenso während des Annealingschritts bei 612 nm gemessen. Die Auswertung des Laufs wurde mittels eines Dell Computers (Microsoft Windows 98 als Betriebssystem) mit der Software Mx4000 v3.00 Build 95, Schema 38 der Fa. STRATAGENE durchgeführt.

Anmerkungen

Kein Hinweis auf die Quelle.

Sichter
(SleepyHollow02), Hindemith

[85.] Ad/Fragment 101 16 - Diskussion
Bearbeitet: 10. July 2014, 07:37 Singulus
Erstellt: 9. July 2014, 21:42 (Graf Isolan)
Ad, Fragment, Frank 2000, Gesichtet, SMWFragment, Schutzlevel sysop, Verschleierung

Typus
Verschleierung
Bearbeiter
Graf Isolan
Gesichtet
Yes.png
Untersuchte Arbeit:
Seite: 101, Zeilen: 16-27
Quelle: Frank 2000
Seite(n): 55, Zeilen: 1 ff.
3.3.6 Bestimmung der Phagozytosekapazität

Zur Bestimmung der Phagozytosekapazität kam ein von ZERBE (1994) etabliertes durchflusszytometrisches Verfahren in modifizierter Form zur Anwendung. Es ermöglicht Aussagen über den Anteil der phagozytierenden Leukozyten einer Zellsuspension und die mittlere Fluoreszenzintensität der Phagozytose-positiven Zellen als Maß für die Menge der phagozytierten Partikel als Ausdruck der Phagozytosestärke.

Testdurchführung

Als Phagozytosepartikel kamen die in (s.3.2.7) beschriebenen FITC-markierten Mikroben zum Einsatz. Die Mikrobensuspension (2 x 108 mikrobelle Partikel/ml PBS) in den Vorratsröhrchen wurden nach dem Auftauen resuspendiert und auf zwei 1,5 ml Reaktionsgefäße (Cups) verteilt. Diese wurden dann bei 14.800 x g für 60 Sekunden bei Raumtemperatur zentrifugiert.


ZERBE H (1994)
Funktionelle und phänotypische Untersuchungen polymorphkerniger neutrophiler Granulozyten aus Blut und Uterus des Rindes.
Dissertation Tierärztliche Hochschule Hannover

3.2.8 Bestimmung der Phagozytosekapazität

Zur Bestimmung der Phagozytosekapazität kam eine von ZERBE (1994) etablierte, durchflußzytometrische Testmethode mit Modifikationen zur Anwendung. Sie ermöglicht Aussagen über den Anteil der phagozytierenden Granulozyten einer Zellsuspension und die mittlere Fluoreszenzintensität der phagozytose-positiven PMN als Maß für die Menge der phagozytierten Partikel.

Testdurchführung

Als Phagozytosepartikel kamen die in 3.1.7 beschriebenen FITC-markierten Streptokokken zum Einsatz. Die Vorratsröhrchen mit 1 ml Bakteriensuspension (2 x 108 Bakterien/ml PBS) wurden bei 15.000 x g für 60 Sekunden bei Raumtemperatur zentrifugiert.


ZERBE, H. (1994):
Funktionelle und phänotypische Untersuchung polymorphkerniger neutrophiler Granulozyten aus Blut und Uterus des Rindes.
Hannover, Tierärztl. Hochsch., Diss.

Anmerkungen

Adaptiert, vielfach mit weitgehend wörtlicher Übereinstimmung, dennoch ohne Hinweis auf eine Übernahme.

Sichter
(Graf Isolan), SleepyHollow02

[86.] Ad/Fragment 102 02 - Diskussion
Bearbeitet: 10. July 2014, 07:35 Singulus
Erstellt: 9. July 2014, 21:15 (Graf Isolan)
Ad, Fragment, Frank 2000, Gesichtet, SMWFragment, Schutzlevel sysop, Verschleierung

Typus
Verschleierung
Bearbeiter
Graf Isolan
Gesichtet
Yes.png
Untersuchte Arbeit:
Seite: 102, Zeilen: 2-21
Quelle: Frank 2000
Seite(n): 55, Zeilen: 16-34
Diese Ansätze wurden anschließend für 45 Min im Brutschrank inkubiert (37°C, 5% CO2).

Nach Resuspension wurden die Wells einer 96-Loch-Rundbodenmikrotiterplatte (s. 3.2.1) mit je 50 μl dieser Mikrobensuspensionen beschickt. Diesen Ansätzen wurden je 150 μl einer Zellsuspension mit einer Dichte von 0,66 x 106 Leukozyten/ml PBS hinzugegeben. Somit lag ein Zellen zu mikrobiellen Partikel-Verhältnis von ca 1:100 vor. Die Probensuspensionen wurden 30 Sekunden auf dem Mikrotiterplattenrüttler durchmischt und dann für 30 Min in einer feuchten Kammer (s. 3.1) im Brutschrank bei 37°C und 5% CO2 inkubiert (s. 3.1). Nach erneuter Durchmischung auf dem Plattenrüttler, um optimale Zell-Mikroben-Kontakte zu gewährleisten, wurde die 30minütige Inkubation fortgesetzt. Abschließend wurde die Platte für 10 Min auf Eis gestellt, um die Reaktion zu stoppen. Die Proben wurden dann in 100 μl Sheath fluid-PJ-Gemisch (s.3.2.5) in Röhrchen für die Durchflusszytometrie überführt.

Auswertung

Pro Ansatz wurden 10.000 Partikel durchflusszytometrisch gemessen. Unter ihnen befanden sich neben Leukozyten auch Mikrobenaggregate, die mit gemessen wurden. Diese Bakterienaggregate werden bei der Auswertung mit dem Programm WinMDI© (TROTTER 1999) aufgrund ihrer hohen Fluoreszenzintensität in FL1 (Abbildung 9) und ihrer FSC-SSC Werte (Abbildung 9) erkannt und von der Auswertung ausgeschlossen. Es wurden nur PJ-negative Leukozyten bewertet. Es wurde ermittelt, welcher Prozentsatz der Zellen phagozytierte.


Zur Opsonisierung wurden die Streptokokken für 15 min im Brutschrank (37°C, 5% CO2) inkubiert. Nach Resuspension wurden die Vertiefungen einer 96-Well-Rundboden-Mikrotiterplatte (s. 3.1.1) mit 100 μl dieser Bakteriensuspensionen beschickt. Diesen Ansätzen wurden 100 μl einer Zellsuspension mit einer Dichte von 2 x 106 Leukozyten/ml PBS hinzugegeben. Somit lag ein Zellen-Bakterien-Verhältnis von 1:100 vor. Die

Probensuspensionen wurden 30 Sekunden auf dem Mikrotiterplattenrüttler durchmischt und dann für 30 min in einer feuchten Kammer (s. 3.1.8.4) im Brutschrank bei 37°C und 5% CO2 inkubiert. Nach erneuter Durchmischung auf dem Plattenrüttler, um optimale Zell-Bakterien-Kontakte zu gewährleisten, wurde die 30minütige Inkubation wiederholt. Daraufhin wurde die Platte in Eiswasser gestellt, um die Reaktion zu stoppen. Die Proben wurden in 100 μl Sheath fluid mit 6 μg Propidiumjodid/ml (s. 3.1.9) aufgenommen.

Auswertung

Pro Ansatz wurden 5.000 Partikel durchflußzytometrisch gemessen. Unter ihnen befanden sich neben Leukozyten Bakterienaggregate, die im „lifegate“ (s. 3.2.2) mitgemessen wurden. Diese Bakterienaggregate werden aber bei der Auswertung mit dem Programm WinMDI (TROTTER 1998) aufgrund ihrer hohen Fluoreszenzintensität in FL 3 (s. 3.2.2) genauso wie Pj-positive Zellen erkannt und von der Auswertung ausgeschlossen. Es wurden nur Pj-negative Granulozyten bewertet. Zum einen wurde ermittelt, welcher Prozentsatz der Granulozyten phagozytierte (Abb. 5, Population B).


TROTTLER, J. (1998):

„WinMDI“ Auswertungsprogramm für Durchflußzytometerdaten, Version 2.4 (Freeware)
FTP://ftp.flosum.salk.edu/pub/ct oder
http://www.flosun.salk.edu/software.html oder
http://facs.scripps.edu/

Anmerkungen

Ohne Hinweis auf eine Übernahme.

Im Literaturverzeichnis von Ad findet sich weder ein Verweis auf Trotter (1998) noch auf Trottler (1998). Korrekt wäre übrigens "Joe Trotter".

Sichter
(Graf Isolan), SleepyHollow02

[87.] Ad/Fragment 102 22 - Diskussion
Bearbeitet: 10. July 2014, 01:10 Hindemith
Erstellt: 9. July 2014, 05:43 (SleepyHollow02)
Ad, Fragment, Gesichtet, Rohwer 2004, SMWFragment, Schutzlevel sysop, Verschleierung

Typus
Verschleierung
Bearbeiter
SleepyHollow02
Gesichtet
Yes.png
Untersuchte Arbeit:
Seite: 102, Zeilen: 22 ff.
Quelle: Rohwer 2004
Seite(n): 74, Zeilen: 1 ff.
3.3.7 Statistische Verfahren

Zur Abschätzung der Wahrscheinlichkeit von Differenzen zwischen Datengruppen wurden der Dunnett's Multiple Comparison Test genutzt oder der Tukey's Multiple Comparison Test eingesetzt.

Die Inter-assay-varianz ist ein Maß für die Streuung der Messwerte eines Parameters in zeitlich verschiedenen Untersuchungen und beschreibt die Wiederholbarkeit der Ergebnisse von Test zu Test. Für ein biologisches System in vitro, dessen Reaktionslage in Abhängigkeit von vielen Faktoren prinzipiell inter- und intraindividuell zu Schwankungen neigt, war eine gute Reproduzierbarkeit der Werte für die einzelnen Parameter unterschiedlicher Tests nicht zu erwarten. Die angegebenen Fehlerbalken entsprechen dem SEM (standard error of mean).

3.3.15 Statistische Verfahren

Zur Abschätzung der Wahrscheinlichkeit von Differenzen zwischen Datengruppen wurden der zweiseitige Student´s t-Test oder der gepaarte t-Test (STEEL & TORRIE 1980) eingesetzt. Wenn nicht normal verteilte Populationen analysiert wurden, wird dort gesondert im Text darauf hingewiesen.

Die Inter-assay-varianz ist ein Maß für die Streuung der Messwerte eines Parameters in zeitlich verschiedenen Untersuchungen und beschreibt die Wiederholbarkeit der Ergebnisse von Test zu Test. Für ein biologisches System, dessen Reaktionslage in Abhängigkeit von vielen Faktoren prinzipiell inter- und intraindividuell zu Schwankungen neigt, war eine gute Reproduzierbarkeit der Werte für die einzelnen Parameter unterschiedlicher Tests nicht zu erwarten. Dennoch werden in dieser Arbeit Datensätze gezeigt, die einen Zeitraum von 7 Monaten bis zu 2 Jahren umfassen. Die dort angegebenen Fehlerbalken entsprechen dem SEM (standard error of mean).

Anmerkungen

Kein Hinweis auf die Quelle.

Sichter
(SleepyHollow02), Hindemith

[88.] Ad/Fragment 103 01 - Diskussion
Bearbeitet: 10. July 2014, 01:17 Hindemith
Erstellt: 9. July 2014, 05:51 (SleepyHollow02)
Ad, BauernOpfer, Fragment, Gesichtet, Rohwer 2004, SMWFragment, Schutzlevel sysop

Typus
BauernOpfer
Bearbeiter
SleepyHollow02
Gesichtet
Yes.png
Untersuchte Arbeit:
Seite: 103, Zeilen: 1 ff. (komplett)
Quelle: Rohwer 2004
Seite(n): 74, 75, Zeilen: 74: 18ff; 75: 1ff
3.3.8 Statistische Darstellung als Box Chart

Im Ergebnisteil werden einige Daten in Form von Box Charts dargestellt. Der Box Chart dient der Darstellung statistischer Auswertungen der Verteilung von Messwerten (SACHS 1997). In Abbildung 12 ist ein symbolischer Box Chart zur Erläuterung dargestellt. Auf der linken Seite der Abbildung sind die Einzelwerte dargestellt, die in dem Box Chart zusammengefasst sind. Der Stern unter dem Box Chart zeigt den minimalen Messwert, die untere horizontale Linie die 5% Grenze. In der Box selbst liegen 50% aller Messwerte.

Zusätzlich kann an der Box das arithmetische Mittel aller Messwerte abgelesen werden (kleines Quadrat in der Box). Das obere Ende der vertikalen Linie entspricht der Grenze, die 95% aller Ereignisse beinhaltet. Der obere Stern entspricht schließlich dem maximalen Messwert. Anhand der 50% Linie kann bereits abgeschätzt werden, ob sich die Population normal verteilt (50% Marke liegt mittig in der Box), oder ob eine Schiefe zu erwarten ist (symbolisch dargestellt ist eine Rechtsschiefe in der Population).

Ad 103a diss.png

Abbildung 12: Symbolischer Aufbau eines Box Charts (ROHWER 2004)

Dargestellt ist die Form eines Box Charts sowie die statistischen Angaben, die ihm zu entnehmen sind.

Statistische Darstellung als Box Chart

Im Ergebnisteil werden einige Daten in Form von Box Charts dargestellt. Der Box Chart dient der Darstellung statistischer Auswertungen der Verteilung von Messwerten (SACHS 1997). In Abb. 5 ist ein symbolischer Box Chart zur Erläuterung dargestellt. Auf der linken Seite der Abbildung sind die Einzelwerte dargestellt, die in dem Box Chart zusammengefasst sind. Der Stern unter dem Box Chart zeigt den minimalen Messwert, die untere horizontale Linie die 5% Grenze. In der Box selbst liegen 50% aller Messwerte.

Zusätzlich kann an der Box das arithmetische Mittel aller Messwerte abgelesen werden (kleines Quadrat in der Box). Das obere Ende der vertikalen Linie entspricht der Grenze, die 95% aller Ereignisse beinhaltet. Der obere Stern entspricht schließlich dem maximalen Messwert. Anhand der 50% Linie kann bereits abgeschätzt werden, ob sich die Population normal verteilt (50% Marke liegt mittig in der Box), oder ob eine Schiefe zu erwarten ist (symbolisch dargestellt ist eine Rechtsschiefe in der Population).

[Seite 75]

Ad 103a source.png

Abb. 5 Symbolischer Aufbau eines Box Charts

Dargestellt ist die Form eines Box Charts sowie die statistischen Angaben, die ihm zu entnehmen sind (s. Erläuterungen im Text unten).

Anmerkungen

Bei der Abbildung ist die Quelle genannt. Dass der Text auch aus der Quelle stammt ist aber nicht klar.

Sichter
(SleepyHollow02), Hindemith

[89.] Ad/Fragment 168 04 - Diskussion
Bearbeitet: 10. July 2014, 01:20 Hindemith
Erstellt: 9. July 2014, 15:08 (Graf Isolan)
Ad, BauernOpfer, Fragment, Gesichtet, Krueger 2001, SMWFragment, Schutzlevel sysop

Typus
BauernOpfer
Bearbeiter
Graf Isolan
Gesichtet
Yes.png
Untersuchte Arbeit:
Seite: 168, Zeilen: 4-31
Quelle: Krueger 2001
Seite(n): 105-106, Zeilen: 105:29-32 - 106:1-19.23-35
5.1.3 Die Quantifizierung des Zelltodes

Wie beurteilt man am zuverlässigsten Vitalitäts-beeinflussende Effekte auf Zellen in vitro? Unterstellt man, dass in der überwiegenden Mehrzahl der Fälle die Apoptose von Zellen induziert oder gehemmt wird, so könnte der positive Nachweis apoptotischer Merkmale von Zellen ausreichend erscheinen. So wird in Untersuchungen anderer Arbeitsgruppen sehr häufig die Bindung von Fluorochrom-markiertem Annexin V an das Phosphatidylserin in der Membran apoptotischer Zellen verwendet (FADOK et al. 2000). Die Induktion der Apoptose wurde auch durch den Nachweis der Caspase-Aktivitäten mit Hilfe Fluorochrom-markierter Caspase-Substrate durchflußzytometrisch gemessen (ALAM et al. 1999). LUNDQVIST-GUSTAFSSON & BENGTSSON. (1999) identifizierten Apoptose in ihrer Arbeit anhand einer durchflußzytometrisch bestimmten Größenabnahme (geringerer FSC) der Zellen.

Der Grund, in dieser Arbeit von einem direkten Apoptose-Nachweis abzusehen, lag in der Beobachtung, dass apoptotische Zellen in vitro relativ schnell sekundär nekrotisch werden können (WALSH et al. 1998), was somit den Nachweis einer primären Apoptose-Induktion erschwert hätte. Zudem sind die Zeitfenster, in dem Unterschiede in der Apoptose in den verschiedenen Ansätzen in vitro nachweisbar sind, oft sehr kurz, und bergen (bei falscher Wahl der Meßzeitpunkte oder unterschiedlichen Apoptose-Kinetiken) die Gefahr von Fehlinterpretationen. Sekundär nekrotische Zellen stellen sich nach durchflußzytometrischer Analyse als Propidiumiodid-positiv dar. Solche noch als Zellen zu identifizierende Ereignisse desintegrieren jedoch sehr rasch (Membran-, Kernfragmente) (KRÜGER 2001), so dass auch dieser Parameter nur bedingt zum Nachweis eines induzierten Zelltodes geeignet schien.

Auf diesen Überlegungen basierte die Auswahl des dargestellten quantitativen durchflußzytometrischen Verfahrens zur Prüfung der Modulation der Zellvitalität. Prinzipiell wurden die, nach bestimmten Zeiten in vitro noch nachweisbaren, vitalen Zellen gezählt und als verläßlichster Parameter der Zellvitalität in vitro angesehen. Es kann aus den dargelegten Gründen nicht mit Bestimmtheit festgelegt werden, ob das im folgenden beschriebene beschleunigte Absterben auf der Induktion von Apoptose oder der Nekrose beruht, oder ob eventuell sogar beide Mechanismen des Zelltodes daran beteiligt sind. Allerdings wird für den spontanen und den induzierten Zelltod von PBL in vivo und in vitro generell die Induktion [der Apoptose verantwortlich gemacht (HASLETT et al. 1985, PAYNE et al. 1994, GASMI et al. 1996, WALZOG et al. 1997, HANNAH et al. 1998).]


ALAM A, COHEN LY, AOUAD S & SÉKALY RP. (1999) :
Early activation of caspases during T lymphocyte stimulation results in selective substrate cleavage in nonapoptotic cells.
J. Exp. Med. ,190, 1879-90

FADOK VA, BRATTON DL, ROSE DM, PEARSON A, EZEKEWITZ RA, HENSON PM. (2000) :
A receptor for phosphatidylserine-specific clearance of apoptotic Cells.
Nature ,405, 85-90

GASMI L , MCLENNAN AG & EDWARDS SW. (1996) :
The diadenosine polyphosphates Ap3A and Ap4A and adenosine triphosphate interact with granulocyte-macrophage colony-stimulating factor to delay neutrophil apoptosis: implications for neutrophil: platelet interactions during inflammation.
Blood ,87, 3442-3449

HANNAH S, NADRA I, DRANSFIELD I, PRYDE JG, ROSSI AG & HASLET C. (1998) :
Constitutive neutrophil apoptosis in culture is modulated by cell density independently of beta2 integrin-mediated adhesion.
FEBS Lett. ,421, 141-146

HASLETT C, GUTHRIE LA, KOPANIAK RB JOHNSTON & HENSON PM. (1985) :
Modulation of multiple neutrophil functions by preparative methods or trace concentrations of bacterial lipopolysaccharide.
Am. J. Pathol., 119, 101-110

KRÜGER C. (2001) :
Funktionelle Charakterisierung der Interaktion zwischen bakteriellen Superantigenen und bovinen neutrophilen Granulozyten
Dissertation ,Tierärztliche Hochschule Hannover

LUNDQVIST-GUSTAFSSON H & BENGTSSON T. (1999) :
Activation of the granule pool of the NADPH oxidase accelerates apoptosis in human neutrophils.
J. Leukoc. Biol . ,65, 196-204

PAYNE CM, GLASSER L, TISCHLER ME, WYCKOFF D, CROMEY D, FIEDERLEIN E & BOHNERT O. (1994) :
Programmed cell death of the normal human neutrophil: an in vitro model of senescence.
Microsc. Res. Tech. ,28, 327-344

WALSH GM, DEWSON G, WARDLAW AJ, LEVI-SCHAFFER F & R MOQBEL. (1998) :
A comparative study of different methods for the assessment of apoptosis and necrosis in human eosinophils.
J. Immunol. Meth. ,217, 153-163

WALZOG B, JEBLONSKI F, ZAKRZEWICZ A & GAEHTGENS P. (1997) :
Beta2 integrins. (CD11/CD18) : promote apoptosis of human neutrophils.
FASEB J. ,11, 1177-1186

[Seite 105]

5.1.1 Methodischer Ansatz

Wie beurteilt man am zuverlässigsten Vitalitäts-mindernde Effekte von Toxinen, Superantigenen oder zellulären Mediatoren auf Zellen in vitro? Unterstellt man, daß in der überwiegenden Mehrzahl der Fälle die Apoptose von Zellen induziert oder gehemmt wird, so könnte der positive Nachweis apoptotischer Merkmale von Zellen (vgl. Abb. 1)

[Seite 106]

ausreichend erscheinen. So wird in Untersuchungen anderer Arbeitsgruppen sehr häufig die Bindung von Fluorochrom-markiertem Annexin V an das Phosphatidylserin in der Membran apoptotischer Zellen verwendet (s. 2.4.1, FADOK et al. 1992). Die Induktion der Apoptose wurde auch durch den Nachweis der Caspase-Aktivitäten mit Hilfe Fluorochrom-markierter Caspase-Substrate durchflußzytometrisch gemessen (ALAM et al. 1999). LUNDQVIST-GUSTAFSSON & BENGTSSON (1999) identifizierten Apoptose in ihrer Arbeit anhand einer durchflußzytometrisch bestimmten Größenabnahme (geringerer FSC) der Zellen.

Der Grund, in dieser Arbeit von einem direkten Apoptose-Nachweis abzusehen, lag in der Beobachtung, daß apoptotische Zellen in vitro relativ schnell sekundär nekrotisch werden können (WALSH et al. 1998), was somit den Nachweis einer primären Apoptose-Induktion erschwert hätte. Zudem sind die Zeitfenster, in dem Unterschiede in der Apoptose - in den verschiedenen Ansätzen - in vitro nachweisbar sind, oft sehr kurz, und bergen (bei falscher Wahl der Meßzeitpunkte oder unterschiedlichen Apoptose-Kinetiken) die Gefahr von Fehlinterpretationen. Sekundär nekrotische Zellen stellen sich nach durchflußzytometrischer Analyse als Propidiumiodid-positiv dar (vgl. auch Abb. 5). Solche, noch als Zellen zu identifizierende, Ereignisse desintegrieren jedoch sehr rasch (Membran-, Kernfragmente), so daß auch dieser Parameter nur bedingt zum Nachweis eines induzierten Zelltodes geeignet schien. [...]

Auf diesen Überlegungen basierte die Auswahl des dargestellten quantitativen durchflußzytometrischen Verfahrens zur Prüfung der Modulation der Zellvitalität. Prinzipiell wurden die, nach bestimmten Zeiten in vitro noch nachweisbaren, vitalen Zellen gezählt und als verläßlichster Parameter der Zellvitalität in vitro angesehen. Es kann aus den dargelegten Gründen nicht mit Bestimmtheit festgelegt werden, ob das im folgenden beschriebene beschleunigte Absterben der neutrophilen Granulozyten auf der Induktion von Apoptose oder der Nekrose beruht, oder ob eventuell sogar beide Mechanismen des Zelltodes daran beteiligt sind. Allerdings wird für den spontanen und den induzierten Zelltod polymorphkerniger Granulozyten in vivo und in vitro generell die Induktion der Apoptose verantwortlich gemacht (HASLETT et al. 1985, PAYNE et al. 1994, GASMI et al. 1996, WALZOG et al. 1997, HANNAH et al. 1998), obgleich über die einzelnen, regulierenden Kontrollmechanismen immer noch wenig bekannt ist (WALZOG et al. 1997, TSUCHIDA et al. 1995).


ALAM, A., L.Y. COHEN, S. AOUAD & R.-P. SÉKALY (1999)
Early activation of caspases during T lymphocyte stimulation results in selective substrate cleavage in nonapoptotic cells.
J. Exp. Med. 190, 1879-1890

FADOK, V.A., D.R. VOELKER, P.A. CAMPBELL, J.J. COHEN, D.L. BRATTON & P.M. HENSON (1992)
Exposure of phosphatidylserine on the surface of apoptotic lymphocytes triggers specific recognition and removal by macrophages.
J. Immunol. 148, 2207-2216

GASMI, L., A.G. MCLENNAN & S.W. EDWARDS (1996)
The diadenosine polyphosphates Ap3A and Ap4A and adenosine triphosphate interact with granulocyte-macrophage colony-stimulating factor to delay neutrophil apoptosis: implications for neutrophil: platelet interactions during inflammation.
Blood 87, 3442-3449

HANNAH, S., I. NADRA, I. DRANSFIELD, J.G. PRYDE, A.G. ROSSI & C. HASLETT (1998)
Constitutive neutrophil apoptosis in culture is modulated by cell density independently of beta2 integrin-mediated adhesion.
FEBS Lett. 421, 141-146

HASLETT, C., L.A. GUTHRIE, M.M.KOPANIAK, R.B. JOHNSTON & P.M. HENSON (1985)
Modulation of multiple neutrophil functions by preparative methods or trace concentrations of bacterial lipopolysaccharide.
Am. J. Pathol. 119, 101-110

LUNDQVIST-GUSTAFSSON, H., & T. BENGTSSON (1999)
Activation of the granule pool of the NADPH oxidase accelerates apoptosis in human neutrophils.
J. Leukoc. Biol. 65, 196-204

PAYNE, C.M., L. GLASSER, M.E. TISCHLER, D. WYCKOFF, D. CROMEY, R. FIEDERLEIN & O. BOHNERT (1994)
Programmed cell death of the normal human neutrophil: an in vitro model of senescence.
Microsc. Res. Tech. 28, 327-344

TSUCHIDA, H., Y. TAKEDA, H. TAKEI, H. SHINZAWA, T. TAKAHASHI & F. SENDO (1995)
In vivo regulation of rat neutrophil apoptosis occuring spontaneously or induced with TNF-α or Cycloheximide.
J. Immunol. 154, 2403-2412

WALSH, G.M., G. DEWSON, A.J. WARDLAW, F. LEVI-SCHAFFER & R. MOQBEL (1998)
A comparative study of different methods for the assessment of apoptosis and necrosis in human eosinophils.
J. Immunol. Meth. 217, 153-163

WALZOG, B., F. JEBLONSKI, A. ZAKRZEWICZ P. GAEHTGENS (1997)
Beta2 integrins (CD11/CD18) promote apoptosis of human neutrophils.
FASEB J. 11, 1177-1186

Anmerkungen

Ohne Hinweis auf eine Übernahme, die Quelle ist in der Mitte des wörtlich übernommenen Texts genannt.

Sichter
(Graf Isolan), Hindemith

[90.] Ad/Fragment 169 01 - Diskussion
Bearbeitet: 10. July 2014, 01:22 Hindemith
Erstellt: 9. July 2014, 20:47 (Graf Isolan)
Ad, BauernOpfer, Fragment, Gesichtet, Krueger 2001, SMWFragment, Schutzlevel sysop

Typus
BauernOpfer
Bearbeiter
Graf Isolan
Gesichtet
Yes.png
Untersuchte Arbeit:
Seite: 169, Zeilen: 1-2
Quelle: Krueger 2001
Seite(n): 106, Zeilen: 30-35
[Allerdings wird für den spontanen und den induzierten Zelltod von PBL in vivo und in vitro generell die Induktion] der Apoptose verantwortlich gemacht (HASLETT et al. 1985, PAYNE et al. 1994, GASMI et al. 1996, WALZOG et al. 1997, HANNAH et al. 1998).

GASMI L , MCLENNAN AG & EDWARDS SW. (1996) :
The diadenosine polyphosphates Ap3A and Ap4A and adenosine triphosphate interact with granulocyte-macrophage colony-stimulating factor to delay neutrophil apoptosis: implications for neutrophil: platelet interactions during inflammation.
Blood ,87, 3442-3449

HANNAH S, NADRA I, DRANSFIELD I, PRYDE JG, ROSSI AG & HASLET C. (1998) :
Constitutive neutrophil apoptosis in culture is modulated by cell density independently of beta2 integrin-mediated adhesion.
FEBS Lett. ,421, 141-146

HASLETT C, GUTHRIE LA, KOPANIAK RB JOHNSTON & HENSON PM. (1985) :
Modulation of multiple neutrophil functions by preparative methods or trace concentrations of bacterial lipopolysaccharide.
Am. J. Pathol., 119, 101-110

PAYNE CM, GLASSER L, TISCHLER ME, WYCKOFF D, CROMEY D, FIEDERLEIN E & BOHNERT O. (1994) :
Programmed cell death of the normal human neutrophil: an in vitro model of senescence.
Microsc. Res. Tech. ,28, 327-344

WALZOG B, JEBLONSKI F, ZAKRZEWICZ A & GAEHTGENS P. (1997) :
Beta2 integrins. (CD11/CD18) : promote apoptosis of human neutrophils.
FASEB J. ,11, 1177-1186

Allerdings wird für den spontanen und den induzierten Zelltod polymorphkerniger Granulozyten in vivo und in vitro generell die Induktion der Apoptose verantwortlich gemacht (HASLETT et al. 1985, PAYNE et al. 1994, GASMI et al. 1996, WALZOG et al. 1997, HANNAH et al. 1998), obgleich über die einzelnen, regulierenden Kontrollmechanismen immer noch wenig bekannt ist (WALZOG et al. 1997, TSUCHIDA et al. 1995).

GASMI, L., A.G. MCLENNAN & S.W. EDWARDS (1996)
The diadenosine polyphosphates Ap3A and Ap4A and adenosine triphosphate interact with granulocyte-macrophage colony-stimulating factor to delay neutrophil apoptosis: implications for neutrophil: platelet interactions during inflammation.
Blood 87, 3442-3449

HANNAH, S., I. NADRA, I. DRANSFIELD, J.G. PRYDE, A.G. ROSSI & C. HASLETT (1998)
Constitutive neutrophil apoptosis in culture is modulated by cell density independently of beta2 integrin-mediated adhesion.
FEBS Lett. 421, 141-146

HASLETT, C., L.A. GUTHRIE, M.M.KOPANIAK, R.B. JOHNSTON & P.M. HENSON (1985)
Modulation of multiple neutrophil functions by preparative methods or trace concentrations of bacterial lipopolysaccharide.
Am. J. Pathol. 119, 101-110

PAYNE, C.M., L. GLASSER, M.E. TISCHLER, D. WYCKOFF, D. CROMEY, R. FIEDERLEIN & O. BOHNERT (1994)
Programmed cell death of the normal human neutrophil: an in vitro model of senescence.
Microsc. Res. Tech. 28, 327-344

TSUCHIDA, H., Y. TAKEDA, H. TAKEI, H. SHINZAWA, T. TAKAHASHI & F. SENDO (1995)
In vivo regulation of rat neutrophil apoptosis occuring spontaneously or induced with TNF-α or Cycloheximide.
J. Immunol. 154, 2403-2412

WALZOG, B., F. JEBLONSKI, A. ZAKRZEWICZ P. GAEHTGENS (1997)
Beta2 integrins (CD11/CD18) promote apoptosis of human neutrophils.
FASEB J. 11, 1177-1186

Anmerkungen

Schließt die auf der vorangegangenen Seite begonnene Übernahme ab (vgl. Ad/Fragment_168_04).

Sichter
(Graf Isolan), Hindemith

[91.] Ad/Fragment 169 25 - Diskussion
Bearbeitet: 7. July 2014, 10:30 Hindemith
Erstellt: 6. July 2014, 17:45 (SleepyHollow02)
Ad, Bente 2003, Fragment, Gesichtet, SMWFragment, Schutzlevel sysop, Verschleierung

Typus
Verschleierung
Bearbeiter
SleepyHollow02
Gesichtet
Yes.png
Untersuchte Arbeit:
Seite: 169, Zeilen: 25-31
Quelle: Bente 2003
Seite(n): 60, Zeilen: 14 ff., 27 ff.
Die quantitative real-time PCR beinhaltet zunächst alle Vorteile einer konventionellen PCR, nämlich die Schnelligkeit der Durchführung, die Sensitivität und die Nutzbarkeit einer Reihe von Ausgangsmaterialien.

Die Sensitivität der QRT-PCR ist laut BUSTIN und MACKAY 100 bis 1000-fach höher als in der konventionellen PCR. So liegt die Nachweisgrenze eines Amplifikates bei der konventionellen PCR (Agarose-Gel) bei 2 bis 4 ng, während in der real-time PCR (rt-PCR) Nachweisgrenzen von 2 bis 20 pg postuliert werden (BUSTIN 2000; MACKAY et al. 2002).

Die quantitative real-time PCR beinhaltet zunächst alle Vorteile einer konventionellen PCR, nämlich die Schnelligkeit der Durchführung, die Sensitivität und die Nutzbarkeit einer Reihe von Ausgangsmaterialien. [...]

[...]

Die Sensitivität der QRT-PCR ist laut BUSTIN und MACKAY 100 bis 1000-fach höher als in der konventionellen PCR. So liegt die Nachweisgrenze eines Amplifikates im Agarose-Gel bei 2 bis 4 ng, während in der real-time PCR Nachweisgrenzen von 2 bis 20 pg postuliert werden (BUSTIN 2000; MACKAY 2002).

Anmerkungen

Kein Hinweis auf die Quelle.

Sichter
(SleepyHollow02), Hindemith

[92.] Ad/Fragment 170 01 - Diskussion
Bearbeitet: 7. July 2014, 10:39 Hindemith
Erstellt: 6. July 2014, 17:48 (SleepyHollow02)
Ad, Bente 2003, Fragment, Gesichtet, SMWFragment, Schutzlevel sysop, Verschleierung

Typus
Verschleierung
Bearbeiter
SleepyHollow02
Gesichtet
Yes.png
Untersuchte Arbeit:
Seite: 170, Zeilen: 1-4
Quelle: Bente 2003
Seite(n): 60, Zeilen: letzter Absatz
Die Real-time PCR ermöglicht eine exaktere Quantifizierung des Ausgangsproduktes als die konventionelle PCR, da im Gegensatz zur konventionellen PCR im exponentiellen Bereich der Amplifikationsreaktion gemessen wird. Dies ermöglicht zudem eine Quantifizierung in einem weiteren Bereich als bei der konventionellen PCR (Endpunktmethode, Vergleich der Bandenstärke). Die Real-time PCR ermöglicht eine exaktere Quantifizierung des Ausgangsproduktes als die konventionelle PCR, da im Gegensatz zur Standard PCR im exponentiellen Bereich der Reaktion gemessen wird. Dies ermöglicht zudem eine Quantifizierung in einem weiteren Bereich als bei der konventionellen PCR.
Anmerkungen

Kein Hinweis auf die Quelle.

Fortsetzung von der Vorseite.

Sichter
(SleepyHollow02), Hindemith

[93.] Ad/Fragment 171 04 - Diskussion
Bearbeitet: 10. July 2014, 07:39 Singulus
Erstellt: 10. July 2014, 01:35 (Hindemith)
Ad, Fragment, Gesichtet, Krueger 2001, SMWFragment, Schutzlevel sysop, Verschleierung

Typus
Verschleierung
Bearbeiter
Hindemith
Gesichtet
Yes.png
Untersuchte Arbeit:
Seite: 171, Zeilen: 4-13, 19-28
Quelle: Krueger 2001
Seite(n): 107, Zeilen: 3ff
5.4.1 Superantigene haben im Vergleich zu Mitogenen keinen Vitalitäts-modulierenden Effekt auf reine neutrophile Granulozyten

SEA (Superantigen) beeinflusste nicht die Absterbekinetik von gereinigten equinen Granulozyten (s.Abbildung 27). Dieses eindeutige Resultat schließt nicht aus, dass Superantigene dennoch Liganden auf der Zelloberfläche dieser Zellen besetzen, sie kreuzvernetzen und die Zellen darüber in anderen Funktionen modulieren, - denn im humanen System konnte gezeigt werden, dass Neutrophile und Eosinophile nach Stimulation MHCKlasse- II-Moleküle exprimieren können (GOSSELIN et al. 1993; WELLER et al. 1993; GUIDA et al. 1994) und über diese sogar Superantigene „präsentieren“.

[...]

5.4.2 Superantigene und Mitogene mindern die Vitalität von Granulozyten im Beisein mononukleärer Zellen

Die Kokultivierung von equinen Granulozyten sogar nur mit einer geringen Anzahl von mononukleären Zellen führte in vitro zu einem beschleunigten Absterben der neutrophilen Granulozyten (s.Abbildung 21). Im Beisein von SEA und PHA war dieser Vitalitätsmindernde Effekt dramatisch verstärkt (s.Abbildung 30).

Die einzige vergleichbare Studie im humanen System kam zu exakt gegenteiligen Resultaten. Dort hemmte SEB in Kokulturen von PMN und MNC die Apoptose von Granulozyten (MOULDING et al. 1999). Ohne die präsentierten Daten als solche in Zweifel zu ziehen, könnte der Grund für diese Diskrepanz im Analyseverfahren zu finden sein:

Superantigene haben keinen Vitalitäts-modulierenden Effekt auf reine neutrophile

Granulozyten

Weder SEA noch SEB beeinflußten die Absterbekinetik von gereinigten bovinen Granulozyten (s. Abb. 7). Dies galt sowohl für neutrophile als auch für eosinophile Granulozyten. Dieses eindeutige Resultat schließt nicht aus, daß Superantigene dennoch Liganden auf der Zelloberfläche dieser Zellen besetzten, sie kreuzvernetzen und die Zellen darüber in anderen Funktionen modulieren. Obwohl im humanen System gezeigt werden konnte, daß Neutrophile und Eosinophile nach Stimulation MHC-Klasse-IIMoleküle exprimieren können (GOSSELIN et al. 1993, WELLER et al. 1993, GUIDA et al. 1994) und über diese sogar Superantigene präsentieren, gelang bisher kein Nachweis einer konstitutiven oder Aktivierungs-induzierten MHC-Klasse-II-Expression auf bovinen Granulozyten (SCHUBERTH, persönliche Mitteilung). [...]

Superantigene mindern die Vitalität von Granulozyten im Beisein von mononukleären Zellen

Die Kokultivierung von bovinen Granulozyten und mononukleären Zellen führte im Beisein von Superantigenen nach 24 in vitro zu einem beschleunigten Absterben der neutrophilen Granulozyten. Dieser Vitalitäts-mindernde Effekt war selektiv und betraf nicht die eosinophilen Granulozyten und die mononukleären Zellen (s. Abb. 9).

Die einzige vergleichbare Studie im humanen System kam zu exakt gegenteiligen Resultaten. Dort hemmte SEB in Kokulturen von PMN und MNC die Apoptose von Granulozyten (MOULDING et al. 1999). Ohne die präsentierten Daten als solche in Zweifel zu ziehen, könnte der Grund für diese Diskrepanz im Analyseverfahren zu finden sein:

Anmerkungen

Ein Verweis auf die Quelle fehlt.

Sichter
(Hindemith), SleepyHollow02

[94.] Ad/Fragment 172 01 - Diskussion
Bearbeitet: 10. July 2014, 18:18 Hindemith
Erstellt: 10. July 2014, 01:38 (Hindemith)
Ad, Fragment, Gesichtet, Krueger 2001, SMWFragment, Schutzlevel sysop, Verschleierung

Typus
Verschleierung
Bearbeiter
Hindemith
Gesichtet
Yes.png
Untersuchte Arbeit:
Seite: 172, Zeilen: 1-12
Quelle: Krueger 2001
Seite(n): 107, 108, Zeilen: 107: letzte Zeilen; 108: 1ff
[Dort wurde] mikroskopisch der Anteil an Zellen mit apoptotischer Morphologie beurteilt, während hier die Zahl vitaler Zellen bestimmt wurde. Aus den unter (s.2.15) genannten Gründen (u.a. Sekundärnekrose von Granulozyten in vitro und schnelle Desintegration nekrotischer Zellen) könnte somit der von MOULDING et al. (1999) beschriebene Anteil an apoptotischen Zellen fälschlicherweise zu niedrig liegen.

Der hier beim Pferd zu beobachtende Effekt einer Vitalitätsminderung, auf Grund reduzierter Zahlen vitaler Zellen im Durchflusszytometer, könnte darauf beruhen, dass in vitro aktivierte Zellen stark an Plastikoberflächen der Mikrotiterplatten u.ä. adhärieren. Allerdings konnte dies mit Hilfe von Kontrolluntersuchungen ausgeschlossen werden: Zwar adhärierten durchaus Zellen an der Plattenoberfläche (im stimulierten Ansatz sowie in der Kontrolle), jedoch blieb das Faktum einer insgesamt verringerten Zahl vitaler Granulozyten nach Kokultur mit mononukleären Zellen im Beisein von Superantigenen immanent.

Dort wurde mikroskopisch der Anteil an Zellen mit apoptotischer Morphologie beurteilt, während hier die Zahl vitaler Zellen bestimmt wurde. Aus den unter 5.1.1 genannten Gründen (u.a. Sekundärnekrose von Granulozyten in vitro und schnelle Desintegration nekrotischer Zellen) könnte somit der von MOULDING et al. (1999)

[Seite 108]

beschriebene Anteil an apoptotischen Zellen fälschlicherweise zu niedrig liegen. Der hier beim Rind zu beobachtende Effekt einer Vitalitätsminderung, auf Grund reduzierter Zahlen, könnte darauf beruhen, daß in vitro aktivierte Zellen stark an die Plastikoberfläche der Mikrotiterplatten adhärieren. Allerdings konnte dies mit Hilfe von Kontrolluntersuchungen ausgeschlossen werden. Zwar adhärierten durchaus Zellen an der Plattenoberfläche, jedoch blieb das Faktum einer insgesamt verringerten Zahl vitaler Granulozyten nach Kokultur mit mononukleären Zellen im Beisein von Superantigenen.

Anmerkungen

Ein Verweis auf die Quelle fehlt.

Aus "Rind" wird "Pferd".

Sichter
(Hindemith), SleepyHollow02

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