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Analyse:Cgj

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7 Fragmente

[1.] Analyse:Cgj/Fragment 024 01 - Diskussion
Bearbeitet: 10. March 2014, 07:14 Klgn
Erstellt: 10. March 2014, 07:14 (Klgn)
Cgj, Fragment, Nies 2006, SMWFragment, Schutzlevel, Unfertig, Verschleierung

Typus
Verschleierung
Bearbeiter
Klgn
Gesichtet
No.png
Untersuchte Arbeit:
Seite: 24, Zeilen: 1-22
Quelle: Nies 2006
Seite(n): 27, Zeilen: 5-27
3.3 Pigmentgewinnung und Aufreinigung

3.3.1. Gewinnung des Rohextraktes

Exophiala dermatitidis P201 und Exophiala dermatitidis P202 wurden über 4 Wochen bei 32 °C im Brutschrank inkubiert. Nach dieser Zeit zeigte sich in der vorher transparenten Nährbodenschale eine durch die Pigmentbildung begründete durchgehende Verfärbung des Agars und der Kulturen. Diese deutliche Verfärbung nahm auch nach längerem Warten nicht mehr an Intensität zu. Im UV-Licht zeigte sich bei 254 nm und 366 nm eine deutliche Fluoreszenz im gelbgrünen Bereich. Der Inhalt dieser Schalen wurde mit einem Pürierstab zerkleinert und mit Ethylacetat übergossen. Nach ca. 12 Stunden wurde das Extrakt mittels Glaswolle abfiltriert. Anschließend wurde diese Flüssigkeit mit Aqua ad iniectabilia in einem Scheidetrichter aufgegossen und gut durchmischt. Nach kurzer Zeit konnten zwei Phasen getrennt werden: eine obere Ethylacetat- Phase und eine untere schaumige Wasser-Phase, welche ebenfalls Agar- und Fettreste enthielt. Nach der Trennung wurde dem Ethylacetat-Pigment-Gemisch Natriumsulfat zur Bindung des Restwassers beigegeben. Nach wiederholtem Abfiltrieren wurde das Extrakt mit einem Rotationsverdampfer (Typ VVI, Heidolph- Elektro KG, Kehlheim) getrocknet und das hochvisköse Pigment in 96%igem Methanol aufgenommen. Die Lagerung erfolgte lichtgeschützt in Autosampler- Gewindeflaschen (Volumen 1,8 ml) bei -18° C bis zur weiteren Aufreinigung der Pigmente.

3.3 Pigmentgewinnung und Aufreinigung

3.3.1 Gewinnung des Rohextraktes

Es wurden ca. 190 1b-Agarplatten (mit Tween) mit „positiv“ getesteten Spezies beimpft und für ca. 4 Wochen lang bei 32 °C im Brutschrank inkubiert. Nach dieser Zeit zeigte sich in der vorher transparenten Nährbodenschale eine durch die Pigmentbildung begründete durchgehende Verfärbung des Agars. Diese deutliche Verfärbung nahm auch nach weiterer Inkubation nicht mehr an Intensität zu. Im UV-Licht zeigte sich bei 254 und 366 nm eine deutliche Fluoreszenz im gelbgrünen Bereich. Der Inhalt dieser Schalen wurde gleich dem Screening der Schwärzepilze mit einem Pürierstab zerkleinert und ebenfalls mit Ethylacetat übergossen. Nach ca. 12 Stunden wurde das Extrakt mittels Glaswolle abfiltriert. Anschließend wurde diese Flüssigkeit mit Aqua dest. in einem Scheidetrichter aufgegossen und gut durchmischt. Nach kurzer Zeit konnten zwei Phasen getrennt werden: eine obere Ethylacetat- Phase und eine untere schaumige Wasser-Phase, welche ebenfalls Agar- und Fettreste enthielt. Nach der Trennung wurde dem Ethylacetat-Pigment-Gemisch Natriumsulfat zur Bindung des Restwassers beigegeben. Nach wiederholtem Abfiltrieren wurde das Extrakt mit einem Rotationsverdampfer (Typ VVI, Heidolph- Elektro KG, Kehlheim) getrocknet und das hochvisköse Pigment in 96%igem Methanol aufgenommen. Die Lagerung erfolgte lichtgeschützt in Autosampler- Gewindeflaschen (Volumen 1,8 ml) bei -18° C bis zur weiteren Aufreinigung der Pigmente.

Anmerkungen
Sichter

[2.] Analyse:Cgj/Fragment 025 01 - Diskussion
Bearbeitet: 10. March 2014, 09:49 Klgn
Erstellt: 10. March 2014, 07:21 (Klgn)
Cgj, Fragment, KomplettPlagiat, Nies 2006, SMWFragment, Schutzlevel, Unfertig

Typus
KomplettPlagiat
Bearbeiter
Klgn
Gesichtet
No.png
Untersuchte Arbeit:
Seite: 25, Zeilen: 1-26
Quelle: Nies 2006
Seite(n): 28, Zeilen: 1-27
3.3.2. Säulenchromatographie

Zunächst wurde das Rohextrakt durch die Säulenchromatographie aufgetrennt. Das Prinzip, welches hier zugrunde liegt, ist die Gelpermeations- und Ausschlußchromatographie. Moleküle unterschiedlicher Größe werden in einer flüssigen (mobilen) Phase durch eine feste (stationäre) Phase geführt. Infolge eines Siebeffektes erfolgt dabei eine Verteilung der Moleküle nach ihrer Größe. Verantwortlich für den Siebeffekt ist die stationäre Phase, die aus einem Gel besteht, dass [sic] Poren bestimmter Größe aufweist: Moleküle, deren größter Durchmesser kleiner als die Porenöffnung ist, verteilen sich in stationärer und mobiler Phase. Größeren Molekülen hingegen, die nicht in die Poren passen, steht ein relativ kleineres Verteilungsvolumen zur Verfügung. In der Folge werden sie schneller durch die Säule bewegt und so von den niedermolekularen Substanzen getrennt. Verwendet wurde eine Säule mit einer Nutzlänge von ca. 525 mm (NS29 mit Fritte, Durchmesser 30 mm, Por. 1, PTFE-Küken NS 14/2,5 mm spitz ausgezogen, Fa. Pfeuffer, Hannover). Als Träger diente Sephadex LH 20 (Sigma), ein hydroxyprophyliertes Derivat des Sephadex G-25 (Pharmacia, Uppsala, Schweden). Es wird für die Gelpermeationschromatographie, die Normalverteilungs- und Adsorptionschromatographie von z. B. Lipiden, Steroiden, Fettsäuren, Hormonen und Vitaminen verwendet. Als Laufmittel diente Methanol, der Fluss betrug etwa 19 ml/min bei Druckaufbau über einen Gummiball (Laufzeit der Säule etwa 130 min, Elutionsvolumen 2500 ml). Das aufgetragene Rohextrakt wurde unter UV-Licht (Desaga GmbH, Heidelberg, Type 131200) von 366 nm Wellenlänge in einzelne Fraktionen aufgetrennt. Diese Fraktionen wurden in getrennten Glasgefäßen aufgefangen, jeweils zur Trocknung mittels Rotationsverdampfer abrotiert, in etwa 2 ml Methanol wieder aufgenommen und in Autosampler-Röhrchen überführt.

3.3.2 Säulenchromatographie

Zunächst wurde das Rohextrakt durch die Säulenchromatographie aufgetrennt. Das Prinzip, welches hier zugrunde liegt, ist die Gelpermeations- und Ausschlusschromatographie. Moleküle unterschiedlicher Größe werden in einer flüssigen (mobilen) Phase durch eine feste (stationäre) Phase geführt. Infolge eines Siebeffektes erfolgt dabei eine Verteilung der Moleküle nach ihrer Größe. Verantwortlich für den Siebeffekt ist die stationäre Phase, die aus einem Gel besteht, dass [sic] Poren bestimmter Größe aufweist: Moleküle, deren größter Durchmesser kleiner als die Porenöffnung ist, verteilen sich in stationärer und mobiler Phase. Größeren Molekülen hingegen, die nicht in die Poren passen, steht ein relativ kleineres Verteilungsvolumen zur Verfügung. In der Folge werden sie schneller durch die Säule bewegt und so von den niedermolekularen Substanzen getrennt. Verwendet wurde eine Säule mit einer Nutzlänge von ca. 525 mm (NS29 mit Fritte, Durchmesser 30 mm, Por. 1, PTFE-Küken NS 14/2,5 mm spitz ausgezogen, Fa. Pfeuffer, Hannover). Als Träger diente Sephadex LH 20 (Sigma), ein hydroxyprophyliertes Derivat des Sephadex G-25 (Pharmacia, Uppsala, Schweden). Es wird für die Gelpermeationschromatographie, die Normalverteilungs- und Adsorptionschromatographie von z. B. Lipiden, Steroiden, Fettsäuren, Hormonen und Vitaminen verwendet (HENKE, 1999). Als Laufmittel diente Methanol, der Fluss betrug etwa 19 ml/min bei Druckaufbau über einen Gummiball (Laufzeit der Säule etwa 130 min, Elutionsvolumen 2500 ml). Das aufgetragene Rohextrakt wurde unter UV-Licht (Desaga GmbH, Heidelberg, Type 131200) von 366 nm Wellenlänge in einzelne Fraktionen aufgetrennt. Diese Fraktionen wurden in getrennten Glasgefäßen aufgefangen, jeweils zur Trocknung mittels Rotationsverdampfer abrotiert, in etwa 2 ml Methanol wieder aufgenommen und in Autosamplern überführt.

Anmerkungen
Sichter

[3.] Analyse:Cgj/Fragment 026 01 - Diskussion
Bearbeitet: 12. March 2014, 04:31 Klgn
Erstellt: 10. March 2014, 13:29 (Klgn)
Cgj, Fragment, KomplettPlagiat, Nies 2006, SMWFragment, Schutzlevel, Unfertig

Typus
KomplettPlagiat
Bearbeiter
Klgn
Gesichtet
No.png
Untersuchte Arbeit:
Seite: 26, Zeilen: 1-
Quelle: Nies 2006
Seite(n): 29, Zeilen: S. 29; S. 30
3.3.3. Dünnschichtchromatographie

Die einzelnen aus der Säulenchromatographie gewonnen Fraktionen wurden mit der Dünnschichtchromatographie (Kieselgel 60-Platten, Merck) weiter aufgetrennt. Zum Auftragen wurde eine Linomat IV verwendet mit folgender Einstellung zur analytischen Trennung der Fraktionen (Tabelle 3.4):

Tab.3.4. Einstellung des Linomaten für eine analytische Trennung der Fraktionen

Plattenbreite 200 mm
Bandenbreite 15 mm
Auftragsgeschwindigkeit 12 sec/µl
Abstand zwischen den Banden 10 mm
Startposition 23 mm
Volumen 15 µl
Druck am Hauptventil >100 bar
Druck am Reduzierventil 4-5 bar

Die Entwicklung der Kieselgelplatten erfolgte in einem Laufmittelgemisch Toluol- Ethylformiat-Ameisensäure im Verhältnis 10:5:3 innerhalb von ungefähr 45 min. Die charakteristischen Bandenmuster der jeweiligen Fraktionen erlaubten sowohl die Überprüfung des nicht immer konstanten Säulenabschnitts, gleichzeitig erleichterten sie in Kombination mit den Rf-Werten die Identifikation der interessierenden Banden. Nach der Entnahme aus den Laufkammern wurden die Platten unter einem Abzug getrocknet. Anschließend erfolgte die Fotografie mit einem Camag Reprostar 3 (Camag, Muttenz, Schweiz). Die Tabelle 3.5 listet die standardisierte Einstellung des dazu verwendeten „WinCATS“-Programms zum Abfotografieren der Dünnschichtplatten auf. Die Bedampfung der Kieselgelplatten mit HCl bzw. NH3 diente der Überprüfung einer möglichen pH-Abhängigkeit der vorliegenden Banden:

3.3.3 Dünnschichtchromatographie

Die einzelnen aus der Säulenchromatographie gewonnen Fraktionen wurden mit der Dünnschichtchromatographie (Kieselgel 60-Platten, Merck) weiter aufgetrennt. Zum Auftragen wurde eine Linomat IV mit folgender Einstellung zur analytischen Trennung der Fraktionen verwendet:

Tab.3 Einstellung des Linomaten für Analytische Trennung der Fraktionen

Plattenbreite 200 mm
Bandenbreite 15 mm
Auftragsgeschwindigkeit 12 sec/µl
Abstand zwischen den Banden 10 mm
Startposition 23 mm
Volumen 15 µl
Druck am Hauptventil >100 bar
Druck am Reduzierventil 4-5 bar

Die Entwicklung der Kieselgelplatten erfolgte in einem Laufmittelgemisch Toluol- Ethylformiat-Ameisensäure im Verhältnis 10:5:3 innerhalb von ungefähr 45 min. Die charakteristischen Bandenmuster der jeweiligen Fraktionen erlaubten sowohl die

[S. 30]

Überprüfung des nicht immer konstanten Säulenabschnitts, gleichzeitig erleichterten sie in Kombination mit den Rf-Werten die Identifikation der interessierenden Banden. Nach der Entnahme aus den Laufkammern wurden die Platten unter einem Abzug getrocknet. Anschließend erfolgte die Fotografie mit einem Camag Reprostar 3(Camag, Muttenz, Schweiz) zum weiteren Verfahren: Tabelle 4 listet die standardisierte Einstellung des dazu verwendeten „WinCATS“- Programms (Camag, Muttenz, Schweiz) zum Abfotografieren der Dünnschichtplatten auf. Die Bedampfung der Kieselgelplatten mit HCl bzw. NH3 diente der Überprüfung einer möglichen pH-Abhängigkeit der vorliegenden Banden:

Anmerkungen
Sichter

[4.] Analyse:Cgj/Fragment 027 01 - Diskussion
Bearbeitet: 12. March 2014, 06:09 Klgn
Erstellt: 12. March 2014, 04:49 (Klgn)
Cgj, Fragment, Nies 2006, SMWFragment, Schutzlevel, Unfertig, Verschleierung

Typus
Verschleierung
Bearbeiter
Klgn
Gesichtet
No.png
Untersuchte Arbeit:
Seite: 27, Zeilen: 1
Quelle: Nies 2006
Seite(n): 30, Zeilen: S. 30-32:
Tab. 3.5. Einstellung des WinCATS-Programms zum Abfotografieren der Dünnschichtplatten
Image 1 Aufnahme bei Tageslicht
Image 2 Aufnahme bei 366 nm
Image 3 Aufnahme bei 254 nm
Image 4 Aufnahme bei Tageslicht nach Bedampfung mit Schwefelsäure</br>(rauchend, 37%, Merck)
Image 5 Aufnahme bei 366 nm nach Bedampfung mit Schwefelsäure</br>(rauchend, 37%, Merck)
Image 6 Aufnahme bei Tageslicht nach Bedampfung mit Ammoniaklösung</br>(reinst, Merck)
Image 7 Aufnahme bei 366 nm nach Bedampfung mit Ammoniaklösung</br>(reinst, Merck)


Anhand des Computerprogramms „WinCATS“ erfolgte anschließend die Charakterisierung der einzelnen Banden jeder Fraktion durch die Bestimmung des Rf-Wertes (Rf-Wert: Strecke Start-Fleck/Strecke Start-Lauffront).

Diejenigen Banden, welche vermutlich das Pityriacitrin enthielten (Mayser et al. 2002), wurden für weitere Versuche gekennzeichnet und mit dem Linomaten zur präparativen Trennung noch einmal aufgetragen. Tabelle 3.6 listet die Einstellung des Linomaten zur präparativen Trennung der Fraktionen auf:

Tab. 3.6. Einstellung des Linomaten für eine präparative Trennung der Fraktionen

Plattenbreite 200 mm
Bandbreite 165 mm
Auftragsgeschwindigkeit 8 sec/µl
Startposition 20 mm
Abstand der Banden 0
Volumen 300 µl
Druck am Hauptventil > 100 bar
Druck am Reduzierventil 5 bar
[S. 30]

Tab. 4 Einstellung des WinCATS-Programms zum Abfotografieren der Dünnschichtplatten

Image 1 Aufnahme bei Tageslicht
Image 2 Aufnahme bei 366 nm
Image 3 Aufnahme bei 254 nm
Image 4 Aufnahme bei Tageslicht nach Bedampfung mit Salzsäure </br>(rauchend, 37%, Merck)
Image 5 Aufnahme bei 366 nm nach Bedampfung mit Salzsäure </br>(rauchend, 37%, Merck)
Image 6 Aufnahme bei Tageslicht nach Bedampfung mit Ammoniaklösung</br>(reinst, Merck)
Image 7 Aufnahme bei 366 nm nach Bedampfung mit Ammoniaklösung</br>(reinst, Merck)


Anhand des Computerprogramms „WinCATS“ erfolgte anschließend die Charakterisierung der einzelnen Banden jeder Fraktion durch die Bestimmung des Rf-Wertes (Rf-Wert: Strecke Start-Fleck/Strecke Start-Lauffront).

[S. 31]

Diejenigen Banden, welche vermutlich durch bereits vorausgegangene Untersuchungen bekannte Stoffe enthielten (IRLINGER ET AL., 2004; MAYSER ET AL., 2003; KRÄMER ET AL., 2003; MAYSER ET AL., 2002; MAYSER ET AL., 1998), wurden für weitere Versuche gekennzeichnet. [...}

Diejenigen Fraktionen, welche die gewünschte Bande enthielten, wurden mit dem Linomaten zur präparativen Trennung noch einmal aufgetragen. Tabelle 6 listet die Einstellung des Linomaten zur präparativen Trennung der Fraktionen auf:

[S. 32]

Tab. 6 Einstellung des Linomaten zur präparativen Trennung der Fraktionen

Plattenbreite 200 mm
Bandbreite 165 mm
Auftragsgeschwindigkeit 8 sec/µl
Startposition 20 mm
Abstand der Banden 0
Volumen 300 µl
Druck am Hauptventil > 100 bar
Druck am Reduzierventil 5 bar
Anmerkungen

_

Sichter

[5.] Analyse:Cgj/Fragment 028 01 - Diskussion
Bearbeitet: 10. March 2014, 12:10 Klgn
Erstellt: 10. March 2014, 12:05 (Klgn)
Cgj, Fragment, KomplettPlagiat, Nies 2006, SMWFragment, Schutzlevel, Unfertig

Typus
KomplettPlagiat
Bearbeiter
Klgn
Gesichtet
No.png
Untersuchte Arbeit:
Seite: 28, Zeilen: 1-
Quelle: Nies 2006
Seite(n): 32, Zeilen: S. 32; S. 33: 1-14
Die so präparierte Dünnschichtplatte wurden ebenfalls mit dem o. g. Laufmittel entwickelt.

Anschließend wurde nach Trocknung der Platte die gewünschte Bande mit Bleistift angezeichnet, mit dem Einmalskalpell ausgekratzt, das Kieselgel sorgfältig mit Mörser und Pistill zerkleinert und mit Ethylacetat und Aqua dest. aufgegossen. Es bildeten sich zwei Phasen: die obere ethylacetathaltige Phase enthielt das gelöste Pigment, die untere wasserhaltige Phase beinhaltete das ausgefallene Kieselgel. Die obere Phase wurde mittels Einmalpipette abpipettiert und zur Bindung des Restwassers mit Natriumsulfat (Fluka Biochemika, Buchs, Schweiz) versetzt. Die Flüssigkeit wurde nun mittels Rotationsverdampfer bis kurz vor der kompletten Trocknung abrotiert. Die nun erhaltene visköse Lösung wurde in Autosampler- Röhrchen überführt und unter einem Stickstoffstrom in einem Techne DRI-Block DB (Thermo Dux, Heidelberg) bei 40° C getrocknet.

3.3.4. Hochleistungs-Flüssigkeits-Chromatographie

(High Performance Liquid Chromatography, HPLC)

Zur Isolierung der Bestandteile der Sephadex-Säulen-Fraktionen wurde die präparative HPLC angewendet. Die erhaltenen Unterfraktionen wurden mittels analytischer HPLC auf Reinheit untersucht.

3.3.4.1. Präparative HPLC

Durch präparative HPLC können die trotz Vorreinigung noch recht komplexen Sephadex-Säulen-Fraktionen (durchschnittlich 5 – 10 Komponenten) über einen Gradienten mit einer LiChrospher-RP8 Säule (Merck, Darmstadt, 30x250mm) mit entsprechender Vorsäule getrennt und in größeren Mengen rein dargestellt werden. Als Gradientenpumpe diente die Gilson Masterpumpe M305 gekoppelt mit einer Pumpe Gilson Modell 302 (Gilson, USA) mit jeweils einem präparativen 50ml/min [Pumpenkopf, gesteuert von einem Gilson 802-Modul. Mittels UV-Detektor (Holochrome, Gilson) erfolgte die Detektion bei 220 nm.]

[S. 32]

Die so präparierte Dünnschichtplatte wurden ebenfalls mit dem o. g. Laufmittel entwickelt. Anschließend wurde nach Trocknung der Platte die gewünschte Bande mit Bleistift angezeichnet, mit dem Einmalskalpell ausgekratzt, das Kieselgel sorgfältig mit Mörser und Pistill zerkleinert und mit Ethylacetat und Aqua dest. aufgegossen. Es bildeten sich zwei Phasen: die obere ethylacetathaltige Phase enthielt das gelöste Pigment, die untere wasserhaltige Phase beinhaltete das ausgefallene Kieselgel. Die obere Phase wurde mittels Einmalpipette abpipettiert und zur Bindung des Restwassers mit Natriumsulfat (Fluka Biochemika, Buchs, Schweiz) versetzt. Die Flüssigkeit wurde nun mittels Rotationsverdampfer bis kurz vor der kompletten Trocknung abrotiert. Die nun erhaltene visköse Lösung wurde in Autosampler überführt und unter einem Stickstoffstrom in einem Techne DRI-Block DB (Thermo Dux, Heidelberg) bei 40° C getrocknet.

[S. 33]

3.3.4 Hochleistungs-Flüssigkeits-Chromatographie

(High Performance Liquid Chromatography, HPLC)

Zur Isolierung der Bestandteile der Sephadex-Säulen-Fraktionen wurde die präparative HPLC angewendet. Die erhaltenen Unterfraktionen wurden mittels analytischer HPLC auf Reinheit untersucht.

3.3.4.1 Präparative HPLC

Durch präparative HPLC können die trotz Vorreinigung noch recht komplexen Sephadex-Säulen-Fraktionen (durchschnittlich 5 – 10 Komponenten) über einen Gradienten mit einer LiChrospher-RP8 Säule (Merck, Darmstadt, 30x250mm) mit entsprechender Vorsäule getrennt und in grösseren Mengen rein dargestellt werden. Als Gradientenpumpe diente die Gilson Masterpumpe M305 gekoppelt mit einer Pumpe Gilson Modell 302 (Gilson, USA) mit jeweils einem präparativen 50ml/min Pumpenkopf, gesteuert von einem Gilson 802-Modul. Mittels UV-Detektor (Holochrome, Gilson) erfolgte die Detektion bei 220 nm.

Anmerkungen
Sichter

[6.] Analyse:Cgj/Fragment 029 01 - Diskussion
Bearbeitet: 10. March 2014, 11:10 Klgn
Erstellt: 10. March 2014, 11:09 (Klgn)
Cgj, Fragment, KomplettPlagiat, Nies 2006, SMWFragment, Schutzlevel, Unfertig

Typus
KomplettPlagiat
Bearbeiter
Klgn
Gesichtet
No.png
Untersuchte Arbeit:
Seite: 29, Zeilen: 1-28
Quelle: Nies 2006
Seite(n): 33, Zeilen: S. 33: 11-26; S. 34: 1-13
[Als Gradientenpumpe diente die Gilson Masterpumpe M305 gekoppelt mit einer Pumpe Gilson Modell 302 (Gilson, USA) mit jeweils einem präparativen 50ml/min]

Pumpenkopf, gesteuert von einem Gilson 802-Modul. Mittels UV-Detektor (Holochrome, Gilson) erfolgte die Detektion bei 220 nm. Die Chromatogramme wurden mittels XY-Schreiber (LKB, Schweden) aufgezeichnet. Der verwendete lineare Gradient (180 min) lief von 0 – 100 % Acetonitril bzw. 100 – 0 % Wasser (Lösungsmittel sind Gradient Grade von Merck, Darmstadt). Die Flussrate betrug 5 ml/min. In 180 Fraktionen von je 5 ml werden die eluierenden Verbindungen mittels Fraktionensammler (Super Frac, Pharmacia Biotech) aufgefangen und anschließend lyophilisiert (Lyovac GT2). Die Fraktion wurde nach Chromatogrammverlauf, Farbe und Fluoreszenz kombiniert, lyophilisiert und nach analytischer HPLC eines Aliquots nochmals mittels eines im Verlauf flacheren und gespreizten Gradienten weiter aufgetrennt. Auch hier wurden entsprechende Fraktionen vereinigt und erneut lyophilisiert. Anschließend wurde ein Aliquot zur analytischen HPLC verwendet und bei ausreichender Reinheit im Zellkulturversuch eingesetzt bzw. oder per Express unter Stickstoffatmosphäre auf Trockeneis zur Strukturaufklärung an den Kooperationspartner in München geschickt.

3.3.4.2. Analytische HPLC

Zur analytischen HPLC wurde eine Reversed-Phase-Säule (RP-18, 4 × 250 mm, stationäre Phase Shandon ODS Hypersil 3 μm, Life Science International LTD, Cheshire, England) verwendet. Die Elution erfolgte mittels Hochdruck-Gradienten (Gynkotek Gradientenpumpe 480, Gynkotek, Germering). Als mobile Phase wurde Acetonitril-Wasser (linearer Gradient von 0 – 100% Acetonitril bzw. 100 – 0% Wasser über 100 min) bei einer Flussrate von 1 ml/min eingesetzt. Die Detektion eluierter Substanzen erfolgte bei 220 nm (Detektor UV-Detektor 785, bai, Bensheim), die Chromatogramme wurden mittels eines Thermoschreibers (Gynkotek C-R 6A Chromatopac, Gynkotek, Germering) bei einer Schreibergeschwindigkeit von 2mm/min aufgezeichnet. Der Probenauftrag erfolgte mittels eines Autosamplers (Alcott Modell 738, Bischoff Analysentechnik, Leonberg) in einem Volumen von 100 μl.

[S. 33]

Als Gradientenpumpe diente die Gilson Masterpumpe M305 gekoppelt mit einer Pumpe Gilson Modell 302 (Gilson, USA) mit jeweils einem präparativen 50ml/min Pumpenkopf, gesteuert von einem Gilson 802-Modul. Mittels UV-Detektor (Holochrome, Gilson) erfolgte die Detektion bei 220 nm. Die Chromatogramme wurden mittels XY-Schreiber (LKB, Schweden) aufgezeichnet. Der verwendete lineare Gradient (180 min) lief von 0 – 100 % Acetonitril bzw. 100 – 0 % Wasser (Lösungsmittel sind Gradient Grade von Merck, Darmstadt). Die Flussrate betrug 5 ml/min. In 180 Fraktionen von je 5 ml wurden die eluierenden Verbindungen mittels Fraktionensammler (Super Frac, Pharmacia Biotech) aufgefangen und anschließend lyophilisiert (Lyovac GT2). Die Fraktion wurden nach Chromatogrammverlauf, Farbe und Fluoreszenz kombiniert, lyophilisiert und nach analytischer HPLC eines Aliquots nochmals mittels eines im Verlauf flacheren und gespreizten Gradienten weiter aufgetrennt. Auch hier wurden entsprechende Fraktionen vereinigt und erneut lyophilisiert. Anschließend wurde ein Aliquot zur analytischen HPLC verwendet und bei ausreichender Reinheit im Zellkulturversuch eingesetzt bzw. oder per Express unter Stickstoffatmosphäre auf Trockeneis zur Strukturaufklärung an den Kooperationspartner in München (Dr. Spiteller, Institut für Organische Chemie und Biochemie, TU München) geschickt.

[S. 34]

3.3.4.2 Analytische HPLC

Zur analytischen HPLC wurde eine Reversed-Phase-Säule (RP-18, 4 × 250 mm, stationäre Phase Shandon ODS Hypersil 3 μm, Life Science International LTD, Cheshire, England) verwendet. Die Elution erfolgte mittels Hochdruck-Gradienten (Gynkotek Gradientenpumpe 480, Gynkotek, Germering). Als mobile Phase wurde Acetonitril-Wasser (linearer Gradient von 0 – 100% Acetonitril bzw. 100 – 0% Wasser über 100 min) bei einer Flussrate von 1 ml/min eingesetzt. Die Detektion eluierter Substanzen erfolgte bei 220 nm (Detektor UV-Detektor 785, bai, Bensheim), die Chromatogramme wurden mittels eines Thermoschreibers (Gynkotek C-R 6A Chromatopac, Gynkotek, Germering) bei einer Schreibergeschwindigkeit von 2mm/min aufgezeichnet. Der Probenauftrag erfolgte mittels eines Autosamplers (Alcott Modell 738, Bischoff Analysentechnik, Leonberg) in einem Volumen von 100 μl.

Anmerkungen
Sichter

[7.] Analyse:Cgj/Fragment 030 01 - Diskussion
Bearbeitet: 10. March 2014, 10:12 Klgn
Erstellt: 10. March 2014, 10:10 (Klgn)
Cgj, Fragment, KomplettPlagiat, Nies 2006, SMWFragment, Schutzlevel, Unfertig

Typus
KomplettPlagiat
Bearbeiter
Klgn
Gesichtet
No.png
Untersuchte Arbeit:
Seite: 30, Zeilen: 1-13
Quelle: Nies 2006
Seite(n): 34, Zeilen: 14-26
3.4. Strukturaufklärung

Die Strukturaufklärung isolierter Substanzen erfolgte durch Dr. Peter Spiteller, Institut für Organische Chemie und Biochemie II, TU München. Es wurden folgende Untersuchungen durchgeführt: NMR-Spektren [Bruker AMX-600, (1H: 600.19 MHz, 13C: 150.92 MHz) und ARX-300 (1H: 300.13 MHz, 13C: 75.47 MHz)], hochauflösende Massenspektrometrie (HRMS) mit Finnigan MAT 90/ MAT 95 Q und IR-Spektrum (Perkin-Almer 1420 oder Bruker IFS 45 FT-IR). Röntgenstrukturanalyse (Enraf-Nonius CAD4), UV-Spektrometrie (Perkin-Almer Lambda 16) sowie Schmelzpunktbestimmung mittels Reichert Thermovar. Da diese Untersuchungen ausschließlich in München durchgeführt wurden, wird hier auf eine ausführliche Darstellung der dort verwendeten Methoden verzichtet. Verwiesen sei an dieser Stelle auf die Dissertation von Dr. G. Wille (Wille G., 2000) [sic]

3.3.5 Untersuchung zur Strukturaufklärung

Die Strukturaufklärung isolierter Substanzen erfolgte durch Dr. Peter Spiteller, Organ. Chemie und Biochemie II, TU München. Es wurden folgende Untersuchungen durch [sic] geführt: NMR-Spektren [Bruker AMX-600, (1H: 600.19 MHz, 13C: 150.92 MHz) und ARX-300 (1H: 300.13 MHz, 13C: 75.47 MHz)], hochauflösende Massenspektrometrie (HRMS) mit Finnigan MAT 90/ MAT 95 Q und IR-Spektrum (Perkin-Almer 1420 oder Bruker IFS 45 FT-IR). Röntgenstrukturanalyse (Enraf-Nonius CAD4), UV-Spektrometrie (Perkin-Almer Lambda 16) sowie Schmelzpunktbestimmung mittels Reichert Thermovar. Da diese Untersuchungen ausschließlich in München durchgeführt wurden, wird hier auf eine ausführliche Darstellung der dort verwendeten Methoden verzichtet. Verwiesen sei an dieser Stelle auf die Dissertation von Dr. G. Wille (2000).

Anmerkungen
Sichter


Quellen

Quelle Autor Titel Verlag Jahr Lit.-V. FN
Cgj/Nies 2006 Silke Marie Nies Tryptophanabhängige Synthese von indolhaltigen Pigmenten bei verschiedenen humanpathogenen Asco- und Basidiomyceten VVB Laufersweiler 2006 ja ja


Übersicht

Typus Gesichtet ZuSichten Unfertig Σ
KP0055
VS0022
ÜP0000
BO0000
KW0000
KeinP0000
Σ0077

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Kategorie:Cgj




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