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Analyse:Nkk/Fragment 055 01

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Typus
Verschleierung
Bearbeiter
Graf Isolan
Gesichtet
Yes.png
Untersuchte Arbeit:
Seite: 55, Zeilen: 1-27 (komplett)
Quelle: Forst 2009
Seite(n): 33, 34, Zeilen: 33:22-30 - 34:1-16.23-27
3.5.3 Bestimmung der RNA-Konzentration

Zur Bestimmung der RNA-Konzentration wird das Gerät NanoDrop® ND-1000 verwendet. Hierbei handelt es sich um ein UV/Vis-Spektralphotometer, mit dem RNA-, DNA- und Protein-Konzentrationen schnell und sehr genau ermittelt werden können. Dieses Gerät misst im Wellenlängenbereich von 120-750 nm, wobei der Messungsbereich für RNA zwischen 1,5 – 3.000 ng/μl liegt.

Aus der Probenlösung werden 1,5 μl auf den Sensor des NanoDrop® pipettiert und die Messung unverzüglich gestartet. Die Werte werden in ng/μl angegeben und sollten für die Weiterbearbeitung im idealen Fall zwischen 200 und 1000 ng/μl liegen. Liegt ein Wert über 1000 ng/μl, so wird die Probe mit aqua bidest bis zum Erreichen eines optimalen Wertes verdünnt.

3.5.4 cDNA-Synthese (Reverse Transkription)

Für die Polymerase-Kettenreaktion muss die isolierte RNA in cDNA (complementary DNA) umgeschrieben werden. Dazu wird von jeder Probe eine Menge von 1 μg RNA/5 μl benötigt. Da alle Proben unterschiedliche Konzentrationen an RNA enthalten, wird mit folgender Formel die Menge an Probenlösung errechnet, die entnommen werden muss um auf die oben genannte Konzentration zu kommen:

1000 / Wert aus Nano Drop in ng/μl = Menge an zu entnehmender RNA-Lösung

Die entsprechende Menge RNA wird entnommen und mit aqua bidest auf 5 μl Gesamtmenge aufgefüllt. Die Proben werden in den Thermocycler verbracht und dort für 15 Minuten bei 60 °C denaturiert, damit sich die im cDNA-Mix enthaltene Reverse Transkriptase optimal an die RNA anlagern kann.

Die Proben werden mit je 5 μl cDNA-Mix versetzt und erneut in den Thermocycler verbracht. Die reverse Transkription erfolgt bei 37 °C für 1 Stunde. Abschließend werden die Proben für 5 Minuten bei 95 °C erhitzt, um die entstandene cDNA zu denaturieren und die Reverse Transkriptase zu inaktivieren. Die Lagerung der Proben erfolgt bei -20 °C.

[Seite 33]

3.4.2 Bestimmung der RNA-Konzentration

Zur Bestimmung der RNA-Konzentration wird das Gerät Nano Drop® ND-1000 verwendet. Hierbei handelt es sich um ein UV/Vis-Spektralphotometer, mit dem RNA-, DNA- und Protein-Konzentrationen schnell und sehr genau ermittelt werden können. Der Messbereich für RNA liegt zwischen 1,5 – 3.000 ng/μl. Das RNA-Pellet muß sich hierfür vollständig in aqua bidest. gelöst haben. Aus der Probenlösung werden 2 μl auf den Sensor des Nano-Drop pipettiert und die Messung unverzüglich gestartet. Die Werte werden in ng/μl angegeben und sollten für die Weiterbearbeitung optimalerweise zwischen 200 und 1000 ng/μl liegen. Ist ein Wert

[Seite 34]

>1000, so wird der Probe nach und nach soviel aqua bidest. zugegeben bis der Wert im Optimalbereich liegt.

3.4.3 cDNA-Synthese (Reverse Transkription)

In dieser Studie wurde die Transkription bestimmter Gene untersucht, weswegen RNA aus den Zellen isoliert wurde. Da es jedoch für die Polymerase-Kettenreaktion keine spezifischen RNA-Polymerasen gibt, musste die isolierte RNA zunächst wieder in DNA (sog. copy-DNA) umgeschrieben werden.

Dazu wird von jeder Probe eine Menge von 1 μg RNA/μl benötigt. Da i.d.R. alle Proben unterschiedliche Konzentrationen an RNA enthalten, wird mit folgender Formel die Menge an Probenlösung errechnet, die entnommen werden muß um auf die oben genannte Konzentration zu kommen:

1000 / Wert aus Nano Drop in ng/μl = Menge an zu entnehmender RNA-Lösung

Die entsprechende Menge RNA wird entnommen und auf 5 μl mit aqua bidest. aufgefüllt. Die Proben werden in den Thermocycler verbracht und dort für 15 Minuten bei 60°C erhitzt. Dieser Schritt dient dem Denaturieren der RNA, damit die im cDNA-Mix enthaltene Reverse Transkriptase sich optimal an die RNA anlagern kann.

[...]

Die Proben werden mit je 5 μl cDNA-Mix versetzt und erneut in den Thermocycler verbracht. Die reverse Transkription erfolgt bei 37°C in 1 Stunde. Abschließend werden die Proben für 5 Minuten bei 95°C erhitzt um die entstandene cDNA zu denaturieren und die Reverse Transkriptase zu inaktivieren. Die Proben können direkt weiterverwendet oder für spätere Verwendung bei –20°C tiefgefroren werden.

Anmerkungen

Ohne Hinweis auf eine Übernahme.

Sichter
(Graf Isolan) Schumann

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