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Analyse:Whs/Fragment 012 01

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Typus
Verschleierung
Bearbeiter
SleepyHollow02
Gesichtet
No.png
Untersuchte Arbeit:
Seite: 12, Zeilen: 1 ff.
Quelle: Pinsdorf 2005
Seite(n): 31 ff., Zeilen: 31: 3 ff.; 32: 26 ff.; 33: 1 ff.
[Da nach der Zentrifugation dem Serum kein Antioxidanz wie z. B. 3,5-]

di-tert-Butyl-4-Hydroxy-Toluol (BHT; Merck, KGaA, Darmstadt) zugesetzt wurde, konnten wir nicht ausschließen, dass ein gewisser Anteil von Cholesterin bei der Probenasservierung und vor der Aufarbeitung bereits autoxidativ in 7α-Hydroxycholesterin umgewandelt wurde. Daher verzichteten wir in unserer Untersuchung auf die Bestimmung dieser Gallensäurenvorstufe.

2.3 Probenaufarbeitung

Die Sterine in den Serumproben werden zur gaschromatographischen (GC) Trennung mit anschließender Flammenionisationsdetektion (FID) oder massenselektiver Detektion (MSD) im Scan oder Selected Ion-Monitoring (SIM) Modus zunächst in ihre freie Form gebracht, indem durch eine alkalische Hydrolyse die fettsäureveresterten Sterine dekonjugiert werden. Danach werden die freien Sterine extrahiert und mittels eines Silylierungsreagenzes in einen Silylsterinäther umgewandelt (Lütjohann et al., 2000).

→ Die tiefgefrorenen Serumproben wurden bei Raumtemperatur aufgetaut.

→ 1 μg Epicoprostanol (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, München) (10 μl einer Stammlösung von 100 μg/ml in Cyclohexan, Merck KGaA, Darmstadt), 50 μg 5α- Cholestan (Serva Feinbiochemika GmbH, Heidelberg) (50 μl einer Stammlösung von 1 mg/ml in Cyclohexan) und jeweils 100 ng razemisches [23,23,24,25-2H4]24(R,S)- Hydroxycholesterin (Klinische Chemie, Karolinska-Institut, Stockholm, Schweden, (Dzeletovic et al., 1995)) und [15,16,17,20,22-2H5]27-Hydroxycholesterin (Klinische Chemie, Karolinska-Institut, Stockholm, Schweden, (Dzeletovic et al., 1995)) (100 μl einer Stammlösung eines Gemisches von [2H4]24(R,S)-Hydroxycholesterin und [2H5]27-Hydroxycholesterin, 1 μg/ml in MeOH, Merck, KGaA, Darmstadt) wurden als interne Standards zu 200 μl der Serumprobe bei Raumtemperatur in einem Teflon-beschichteten Reagenzglas mit Schraubverschluss zugesetzt.

→ Zur Vermeidung von weiteren autoxidativen Prozessen wurden außerdem noch 50 ng BHT (10 μl aus einer Stammlösung von 50 mg BHT/10 ml MeOH) zugesetzt.

→ Zur alkalischen Hydrolyse wurde das Probengemisch nach Zusatz von 1 ml 90%-iger äthanolischer NaOH-Lsg. (1M) (Merck, KGaA, Darmstadt) im Wasserbad bei 68°C über 1 Stunde inkubiert.

→ Nach Abkühlen auf Raumtemperatur und Zusatz von 500 μl aqua bidest. wurden die freien Sterine zweimal in 3 ml Cyclohexan (Merck KGaA, Darmstadt) extrahiert.

Da nach der Zentrifugation dem Serum kein Antioxidanz wie z. B. 3,5- di-tert-butyl-4-hydroxytoluol (BHT) zugesetzt wurde, konnten wir nicht ausschließen, dass ein gewisser Anteil von Cholesterin bei der Probenasservierung und vor der Aufarbeitung bereits autoxidativ in 7α-Hydroxycholesterin umgewandelt wurde. Daher verzichteten wir in unserer Untersuchung auf die Bestimmung dieser Gallensäurenvorstufe.


[Seite 32:]

2.5 Probenaufarbeitung

Die Sterine in den Serumproben werden zur gaschromatographischen Trennung mit anschließender Flammenionisationsdetektion oder massenselektiver Detektion zunächst in ihre freie Form gebracht, indem durch eine alkalische Hydrolyse die fettsäureveresterten Sterine dekonjugiert werden. Danach werden die freien Sterine extrahiert und mittels eines Silylierungsreagenzes in einen Silylsterinäther umgewandelt.

[Seite 33:]

􀂾 Die tiefgefrorenen Serumproben wurden bei Raumtemperatur aufgetaut.

􀂾 1 μg Epicoprostanol (10 μl einer Stammlösung von 100 μg/ml in Cyclohexan), 50 μg 5α-Cholestan (50 μl einer Stammlösung von 1 mg/ml in Cyclohexan) und jeweils 100 ng razemisches [23,23,24,25-2H4]24R,S-Hydroxycholesterin und [15,16,17,20,22- 2H5]27-Hydroxycholesterin (100 μl einer Stammlösung eines Gemisches von [2H4]24R,S-Hydroxycholesterin und [2H5]27-Hydroycholesterin, 1 μg/ml in MeOH) wurden als interne Standards zu 200 μl der Serumprobe bei Raumtemperatur in einem Teflon-beschichteten Reagenzglas mit Schraubverschluss zugesetzt.

􀂾 Zur Vermeidung von autoxidativen Prozessen wurden außerdem noch 50 ng 3,5-ditert- butyl-4-hydroxytoluene (BHT) (10 μl aus einer Stammlösung von 50 mg BHT/10 ml MeOH) zugesetzt.

􀂾 Zur alkalischen Hydrolyse wurde das Probengemisch nach Zusatz von 1 ml 90%-iger äthanolischer NaOH-Lsg. (1M) im Wasserbad bei 68°C über 1 Stunde inkubiert.

􀂾 Nach Abkühlen auf Raumtemperatur und Zusatz von 500 μl aqua bidest. wurden die freien Sterine, Stanole und Oxysterine zweimal in 3 ml Cyclohexan extrahiert.

Anmerkungen

Aus dem Material & Methoden-Teil - daher auch Einordnugn als kW möglich.

Sichter
(SleepyHollow02)

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