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Analyse:Whs/Fragment 016 01

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Typus
Verschleierung
Bearbeiter
SleepyHollow02
Gesichtet
No.png
Untersuchte Arbeit:
Seite: 16, Zeilen: 1 ff. (komplett)
Quelle: Pinsdorf 2005
Seite(n): 40 f., Zeilen: 40: 1 ff.; 41: 1 ff.
2.5 Durchführung der Analysen

2.5.1 Durchführung der Analyse mittels Gaschromatographie-Flammenionisationsdetektion

Das Sterintrimethylsilyläthergemisch wurde mit einem HP 7683 Injektor auf eine vernetzte Methylsilikon DB-XLB 122-1232 Kapillarsäule (J&W, Folsom, USA) (30m x 0,25 mm Innendurchmesser x 0,25 μm Schichtdicke) in einem Hewlett Packard Gaschromatographen (HP 6890) nach splittloser Injektion bei 280°C injiziert. Der Trägergasfluss – in unserem Falle: Wasserstoff - betrug 1,1 ml/min. Die Ofentemperatur wurde zu Beginn für 3 min bei 150°C gehalten und dann mit einer Steigerungsrate von 30°C/min auf eine Endtemperatur von 290°C geführt. Diese Temperatur blieb über 22,33 min konstant. Der interne Standard 5α- Cholestan wurde mit einer Retentionszeit von 12,0 min und der Cholesterintrimethylsilyläther mit einer Retentionszeit von 15,88 min im Flammenionisationsdetektor (FID) bei 280°C mit einem kombinierten konstanten Säulen- und Make-up-Fluss (Wasserstoff + Stickstoff; 30 ml/min) detektiert. Die Steuerung des Gaschromatographen und die Auswertung der Gaschromatogramme sowie die Quantifizierung erfolgte durch die HP GC ChemStation Software (Version 2.1.1.0) auf einem Kayak XA Pentium II-Computer. Zur Quantifizierung wird die integrierte Fläche des Cholesterinpeaks durch die Fläche des 5α-Cholestanpeaks dividiert und mit dem vorgegebenen Gehalt an internem Standard von 50 μg multipliziert. Dies ergibt den Gehalt an Cholesterin in μg pro Probe. Bei einer eingesetzten Menge von 200 μl muss man diesen Betrag noch auf 100 ml umrechnen, um die Cholesterinkonzentration in mg/dl anzugeben. Zur Validierung dieser Einpunkt-Eichmethode mit 5α-Cholestan als internem Standard wurden die Ergebnisse der Serumkonzentrationen von Cholesterin einer Einpunkt-Eichung gegenüber einer erstellten Eichgerade verglichen. Die Ergebnisse zeigten gute Übereinstimmung beider Eichverfahren. Abbildung 3 zeigt die Eichkurve für Cholesterin mit 5α-Cholestan als internem Standard in einem Konzentrationsbereich zwischen 0 und 200 μg/Probe. Zur Präzision der Methode wurde die gleiche Serumprobe sechsfach aufgearbeitet und gemessen (Wiederholbarkeit), sowie eine aufgearbeitete Probe nach Silylierung sechsmal hintereinander injiziert um die Stabilität des Messinstrumentes zu zeigen. Für die Wiederholbarkeit der Einpunkt-Methode ergab sich ein Variationskoeffizient von 1,45 % (n=6) und für die Stabilitätsmessung des GC-FID ein Variationskoeffizient von 1,60 % (n=6). Die Nachweisgrenze einer Substanz wird normalerweise ermittelt, indem man bekannte niedrige Konzentrationen des Analyten mit substanzfreiem Medium gegenüberstellt und die minimale Konzentration ermittelt, bei der der Analyt gerade noch erfasst werden kann. Ein Signal-Rausch-Verhältnis von 3:1 wird zur Bestimmung der Nachweisgrenze akzeptiert. Bei der Bestimmung von Cholesterin im Serum gibt es bezüglich der Nachweisgrenze für [Cholesterin kein Problem.]

2.7 Durchführung der Analysen

2.7.1 Durchführung der Analyse mittels Gaschromatographie-Flammenionisationsdetektion

Das Sterintrimethylsilyläthergemisch wurde mit einem HP 7683 Injektor auf eine vernetzte Methylsilikon DB-XLB 122-1232 Kapillarsäule (J&W, Folsom, USA) (30m x 0,25 mm Innendurchmesser x 0,25 μm Schichtdicke) in einem Hewlett Packard Gaschromatographen (HP 6890) nach splittloser Injektion bei 280°C injiziert. Der Trägergasfluss – in unserem Falle: Wasserstoff - betrug 1,1 ml/min. Die Ofentemperatur wurde zu Beginn für 3 min bei 150°C gehalten und dann die Temperatur mit einer Steigerungsrate von 30°C/min auf eine Endtemperatur von 290°C geführt. Diese Temperatur blieb über 22,33 min konstant. Der interne Standard 5α-Cholestan wurde mit einer Retentionszeit von 12,0 min und der Cholesterintrimethylsilyläther mit einer Retentionszeit von 15,88 min im Flammenionisationsdetektor (FID) bei 280°C mit einem kombinierten konstanten Säulen- und Make-up-Fluss (Wasserstoff + Stickstoff; 30 ml/min) detektiert (Abb. 12). Die Steuerung des Gaschromatographen und die Auswertung der Gaschromatogramme sowie die Quantifizierung erfolgte durch die HP GC ChemStation Software (Version 2.1.1.0) auf einem Kayak XA Pentium II-Computer. Abbildung 15 zeigt eine gaschromatographische Trennung von 5α-Cholestan und Cholesterin. Zur Quantifizierung wird der integrierte Flächengehalt des Cholesterinpeaks durch den Flächengehalt des 5α-Cholestanpeaks dividiert und mit dem vorgegebenen Gehalt an internem Standard von 50 μg multipliziert. Dies ergibt den Gehalt an Cholesterin in μg pro Probe. Bei einer eingesetzten Menge von 200 μl muss man diesen Betrag noch auf 100 ml umrechnen, um die Cholesterinkonzentration in mg/dl anzugeben. Zur Validierung dieser Einpunkt-Eichmethode mit 5α-Cholestan als internem Standard wurden die Ergebnisse der Serumkonzentrationen von Cholesterin einer Einpunkt-Eichung gegenüber einer erstellten Eichgerade verglichen. Die Ergebnisse zeigten gute Übereinstimmung beider Eichverfahren. Abbildung 13 zeigt die Eichkurve für Cholesterin mit 5α-Cholestan als internem Standard in einem Konzentrationsbereich zwischen 0 und 200 μg/Probe. Zur Präzision der Methode wurde die gleiche Serumprobe sechsfach aufgearbeitet und gemessen (Wiederholbarkeit), sowie eine aufgearbeitete Probe nach Silylierung sechsmal hintereinander injiziert um die Stabilität des Messinstrumentes zu zeigen. Für die Wiederholbarkeit der Einpunkt-Methode ergab sich ein Variationskoeffizient von 1,45 (n=6) und für die Stabilitätsmessung des GC-FID ein Variationskoeffizient von 1,6 (n=6). Die Nachweisgrenze einer Substanz wird normalerweise ermittelt, indem man bekannte niedrige Konzentrationen des Analyten mit substanzfreiem Medium gegenüberstellt und die minimale

[Seite 41:]

Konzentration ermittelt, bei der der Analyt gerade noch erfasst werden kann. Ein Signal- Rausch-Verhältnis von 3:1 wird zur Bestimmung der Nachweisgrenze akzeptiert. Bei der Bestimmung von Cholesterin im Serum gibt es bezüglich der Nachweisgrenze für Cholesterin kein Problem. Daher wird die Nachweisgrenze (limit of detection) für die GC-FID-Methode auf < 0.1 mg/dl durch den niedrigsten Punkt unserer Eichkurve festgelegt. Für die Bestimmungsgrenze (Limit of quantitation) in biologischen Matrizes wird ein Signal- Rausch-Verhältnis von 10:1 festgelegt

Anmerkungen

Aus dem Material & Methoden-Teil; daher auch Einordnung als kW möglich.

Sichter
(SleepyHollow02)

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