von Dr. Anahit Hovsepian
Statistik und Sichtungsnachweis dieser Seite findet sich am Artikelende
| [1.] Anh/Fragment 026 01 - Diskussion Zuletzt bearbeitet: 2014-09-27 21:30:21 Schumann | Anh, Fragment, Gesichtet, Koch 2009, KomplettPlagiat, SMWFragment, Schutzlevel sysop |
|
|
|
| Untersuchte Arbeit: Seite: 26, Zeilen: 1ff |
Quelle: Koch 2009 Seite(n): 32, 33, Zeilen: 32: 10ff; 33: 1ff |
|---|---|
| Nach Aufnahme in 150μl Blocking Buffer über Nacht, zur Absättigung frei gebliebener unspezifischer Bindungsstellen, wurde dieser am 2. Tag wieder mittels des Magneten entfernt. Vor der anschließenden Behandlung der Platte mit den Antikörpern folgte eine Einteilung in verschiedene Abschnitte. Im ersten Abschnitt sollen die unspezifische [sic] Hintergrundsignale erfasst werden, der Background 1. In diesem Abschnitt wird den Zellen mit den Proteinen nur der sekundäre, fluoreszenzmarkierte Antikörper zugegeben, nicht aber der primäre, an den der sekundäre sich spezifisch binden sollte. Jedes Signal, das in diesem Abschnitt gemessen wird, resultiert aus der ungezielten Bindung des 2. Antikörpers zum Beispiel direkt an ein Protein oder das Kunststoff der Platten. Diese Signale gelten als Hintergrund und müssen, da sie in jedem Well entstehen, auch von den Messergebnisse der Proteine abgezogen werden.
In einem zweiten Abschnitt soll ein weiterer Hintergrund ermittelt werden, der Background 2. Dabei handelt es sich um einen Bereich, in den wiederum die Zellen und diesmal der primäre Antikörper gegeben wurde, aber kein fluoreszenzmarkierter Antikörper vorhanden ist. Es handelt sich hierbei um eine Kontrolle der Reinheit der Reagenzien und Platten des jeweiligen Versuches. Dieser Wert wird nicht von den Proteinwerten abgezogen. Vom 1. Antikörper wurden jeweils 50μl in einer Verdünnung von 1:1000 (mit Blocking Buffer/PBS 1:1 verdünnt) auf die Zellen gegeben, wobei die Wells, die als Background 1 gewertet werden sollten, ausgespart wurden. Für diese Wells wurde stattdessen die Antikörper-freie Mischung von Blocking Buffer/PBS im Verhältniss 1:1 verwendet. Nach einer Inkubationszeit von 2h, wurden die Wells mit 200μl Tween washing solution (9,95ml HBSS + 50μl 20 % Tween20), unter Zuhilfenahme des Magneten, viermal mal 5 Minuten gewaschen wodurch nicht gebundene Antikörper wieder entfernt werden sollten. Anschließend erfolgte die Reaktion mit 50μl des 2. Antikörper, in gleicher Verdünnung wie bereits beim Erstantikörper beschrieben, unter Zugabe von 0,125 % Tween 20 zur Verringerung der Hintergrundsignale. Der 2. Antikörper wurde dafür in jedes Well, mit Ausnahme der Wells des 2. Backgrounds gegeben. Während der Inkubationszeit von einer Stunde musste die Platte wegen der Lichtempfindlichkeit des 2. Antikörpers vor Licht geschützt behandelt werden. Im darauf folgenden letzten Schritt wurden abermals unspezifisch gebundene Antikörper durch viermaliges Waschen von je 5 Minuten mit Tween washing solution entfernt. Nach dem letzten Waschdurchgang wurde die Fluoreszenz der trockenen Platte durch den Odyssey® Scanner bei 700 und 800 nm gemessen und mit der zugehörigen Software ausgewertet. (Abbildung) Für die anschließende Auswertung wurden die Messergebnisse in eine Excel-Tabelle umgewandelt und die Konzentration der Proteine berechnet |
Nach Aufnahme in 150μl Blocking Buffer über Nacht, zur Absättigung frei gebliebener unspezifischer Bindungsstellen, wurde dieser am 2. Tag wieder mittels des Magneten entfernt. Vor der anschließenden Behandlung der Platte mit den Antikörpern folgte eine Einteilung in verschiedene Abschnitte. Im ersten Abschnitt sollen die unspezifischen Hintergrundsignale erfasst werden, der Background 1. In diesem Abschnitt wird den Zellen mit den Proteinen nur der sekundäre, fluoreszenzmarkierte Antikörper zugegeben, nicht aber der primäre, an den der sekundäre sich spezifisch binden sollte. Jedes Signal, das in diesem Abschnitt gemessen wird, resultiert aus der ungezielten Bindung des 2. Antikörpers zum Beispiel direkt an ein Protein oder das Kunststoff der Platten. Diese Signale gelten als Hintergrund und müssen, da sie in jedem Well entstehen, auch von den Messergebnisse der Proteine abgezogen werden. In einem zweiten Abschnitt soll ein weiterer Hintergrund ermittelt werden, der Background 2. Dabei handelt es sich um einen Bereich, in den wiederum die Zellen und diesmal der primäre Antikörper gegeben wurden, aber kein fluoreszenzmarkierter Antikörper vorhanden ist. Es handelt sich hierbei um eine Kontrolle der Reinheit der Reagenzien und Platten des jeweiligen Versuches. Dieser Wert wird nicht von den Proteinwerten abgezogen.
Vom 1. Antikörper wurden jeweils 50μl in einer Verdünnung von 1:1000 (mit Blocking Buffer/PBS 1:1 verdünnt) auf die Zellen gegeben, wobei die Wells, die als Background 1 gewertet werden sollten, ausge- [Seite 33] spart wurden. Für diese Wells wurde stattdessen die Antikörper-freie Mischung von BlockingBuffer/PBS im Verhältniss 1:1 verwendet. Nach einer Inkubationszeit von 2h, wurden die Wells mit 200μl Tween Washing Solution (9,95ml HBSS + 50μl 20 % Tween20), unter Zuhilfenahme des Magneten, viermal mal 5 Minuten gewaschen, wodurch nicht gebundene Antikörper wieder entfernt werden sollten. Anschließend erfolgte die Reaktion mit 50μl des 2. Antikörper, in gleicher Verdünnung wie bereits beim Erstantikörper beschrieben, unter Zugabe von 0,125 % Tween 20 zur Verringerung der Hintergrundsignale. Der 2. Antikörper wurde dafür in jedes Well, mit Ausnahme der Wells des 2. Backgrounds gegeben. Während der Inkubationszeit von einer Stunde musste die Platte wegen der Lichtempfindlichkeit des 2. Antikörpers vor Licht geschützt behandelt werden. Im darauf folgenden letzten Schritt wurden abermals unspezifisch gebundene Antikörper durch viermaliges Waschen von je 5 Minuten mit Tween Washing Solution entfernt. Nach dem letzten Waschdurchgang wurde die Fluoreszenz der trockenen Platte durch den Odyssey® Scanner bei 700 und 800 nm gemessen und mit der zugehörigen Software ausgewertet. (Abbildung 13) [...] Für die anschließende Auswertung wurden die Messergebnisse in eine Exel-Tabelle [sic] umgewandelt und die Konzentration der Proteine berechnet. |
Ein Verweis auf die Quelle fehlt. |
|
Letzte Bearbeitung dieser Seite: durch Benutzer:Schumann, Zeitstempel: 20140927213116