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Ati/Fragment 097 11

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Typus
Verschleierung
Bearbeiter
Hindemith
Gesichtet
Yes.png
Untersuchte Arbeit:
Seite: 97, Zeilen: 11-28
Quelle: Salahshour-Fard 2006
Seite(n): 63, Zeilen: 8 ff.
5.11 Analyse der Genexpression

5.11.1 Aufschluss der Zellen und Nukleinsäureisolierung

Für die Untersuchung der Genexpression wurde Gesamt-RNS eingesetzt, die mit dem RNeasy Mini Kit (Qiagen) aus den Zellen isoliert wird.

Zur Lyse der Zellen wurden 600 pl Lysepuffer RET auf den angetauten Zellen verteilt. Dieser Lysepuffer enthält eine hohe Konzentration an Guanidiniumisothiocyanat, ein denaturierendes chaotropes Salz, welches sowohl zur Lyse der Zellen beiträgt, als auch die Wirkung von RNasen wirksam hemmt und damit die Isolierung intakter RNS erlaubt. Außerdem ermöglicht es durch die Zerstörung der geordneten Struktur der Wassermoleküle und ihrer Wechselwirkung mit den gelösten Nukleinsäuren die Bindung der Nukleinsäuren an die Silikagel-Matrix der Zentrifugenröhrchen. Die Zellen mit dem Lysepuffer wurden mit einem Zellschaber abgelöst, anschließend mit einer Tuberkulinspritze aufgenommen und durch wiederholtes Auspressen und Aufziehen durch die Wirkung der Scherkräfte homogenisiert. Nach Zugabe von 600 pl Ethanol (70%) und gründlichem Mischen wurde das Lysat in zwei Durchgängen über die Filtrationssäulchen mit der Silikagelmembran bei 10.000 x g für eine Minute zentrifugiert. Dabei erfolgt nur eine Absorption der Nukleinsäuren an der Membran, während andere Kontaminationen aus der Zelllyse in den folgenden Waschschritten mit den Puffern RW1 und RPE effizient entfernt wurden.

2.11.7 Analyse der Genexpression

2.11.7.1 Aufschluß der Zellen und RNS-Isolierung

Für die Untersuchung der Genexpression wurde Gesamt-RNS eingesetzt, die mit dem RNeasy Mini Kit (Qiagen, Hilden) aus den Zellen isoliert wurde. [...] Zur Lyse der Zellen wurden 600 μl Lysepuffer RLT, dem 1% β-Mercaptoethanol zugesetzt wurde, auf den noch nicht ganz aufgetauten Zellen verteilt. Dieser Puffer enthält eine hohe Konzentration an Guanidiniumisothiocyanat, ein denaturierendes chaotropes Salz, welches sowohl zur Lyse der Zellen beiträgt, wie auch die Wirkung von RNasen wirksam hemmt und damit die Isolierung intakter RNS erlaubt. Außerdem ermöglicht es durch die Zerstörung der geordneten Struktur der Wassermoleküle und ihrer Wechselwirkung mit den gelösten Nukleinsäuren die Bindung der Nukleinsäuren an die Silikagel-Matrix der Zentrifugenröhrchen. Die Zellen mit dem Lysepuffer wurden mittels Zellliftern abgelöst, mit einer Tuberkulinspritze mit Kanüle (0,5 x 16 mm) aufgenommen und homogenisiert. Nach Zugabe von 600 μl 70% Ethanol und gründlichem Mischen wurde das Lysat in zwei Durchgängen über die Filtrationssäulchen mit der Silikagelmembran abzentrifugiert (1 min, 10.000g). Dabei erfolgte nur eine Absorption der Nukleinsäuren an der Membran, während andere Kontaminationen aus der Zelllyse in den folgenden Waschschritten mit den Puffern RW1 und RPE effizient entfernt wurden.

Anmerkungen

Ein Verweis auf die Quelle fehlt.

Sichter
(Hindemith), SleepyHollow02

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