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Awb/Fragment 035 01

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Typus
Verdächtig
Bearbeiter
Bummelchen, Hindemith
Gesichtet
No.png
Untersuchte Arbeit:
Seite: 35, Zeilen: 1-
Quelle: Vahl 1995
Seite(n): 43,49, Zeilen: ab 17, ab 1
[2.3.5 Berechnung der intrazellulären Calciumkonzentration :


Nach Grynkiewicz et al. (1985) läßt sich die intrazelluläre Calciumkonzentration mittels folgender Gleichung berechnen : Ca2+ = ((R - Rmin) / (Rmax -R))*Kd*s]


wobei : R = gemessener Quotient des emmitierten Fluoreszenzlichtes bei Anregung mit 340 und 380 nm; Rmin = R bei minimaler freier intrazellulärer Calciumionenkonzentration; Rmax = R bei maximaler intrazellulärer Calciumionenkonzentration; Kd = Dissoziationskonstante des FURA - 2 -Calciumkomplexes; s = Quotient der Fluoreszenz in calciumfreier Lösung und calciumhaltiger Lösung.


Zur Bestimmung der maximalen intrazellulären Calciumionenkonzentration (Rmax) wurden die Muskelfaserpräparate am Ende des Experimentes durch supramaximale Stimulation (50Hz) in einer calciumreichen Lösung (4 mMol) tetanisiert, wobei die Reizamplitude auf den dreifachen Wert der Standardeinstellung angehoben wurde. Unter dieser Stimulation wurde eine Gleichgewichtskraft der Faser erhalten, die ca. 4x höher als die isometrische Kraft bei einer Einzelreizung war. Während des maximal erreichbaren Wertes der isometrischen Gleichgewichtskraft wurde das Fura-2 Signal registriert und Rmax ermittelt. Nach Beendigung des Tetanus kehrte die Kraft des Präparates zu den Ausgangswerten zurück.


Zur Bestimmung der minimalen intrazellulären freien Calciumionenkonzentration (Rmin) wurden die Muskelfaserpräparate am Ende des Experiments mittels 3% Triton-X-100 Lösung für 30 Minuten "gehäutet", d.h. die Membranen lysiert (siehe 5.1.4). Das Perfusat wurde danach durch eine calciumfreie KHS - Lösung ersetzt, der 5 mMol EGTA / I und 50 pM Fura-2/AM zugesetzt waren. Unter diesen Bedingungen wurde die minimale Fluoreszenz ermittelt. Die Dissoziationskonstante ( Kd ) des Fura-2/AM - Calciumkomplexes wurde entsprechend der Literatur (Grynkiewicz et al. 1985) mit 224 nM bei 37°C angenommen. Die orientierende Berechnung der Absolutwerte des intrazellulären Calciumspiegels diente im wesentlichen dem Ziel, eine Abschätzung der Größenordnung des intrazellulären Calciumtransienten vorzunehmen und Sicherheit zu erlangen, im Meßbereich des Fluoreszenzindikators zu sein. Zur Auswertung wurde zusätzlich die qualitative Analyse des Calcium - Zeit - Integrals verwendet, bei dem die Fläche unterhalb des Calciumtransienten über einen Zeitraum von 500 ms planimetriert wird. Dieses Verfahren wurde im wesentlichen bei dem Vergleich isometrischer und nachbelasteter Kontraktionen angewandt.

Zur Bestimmung der minimalen freien intracellulären Calciumkon-zentration wurden die Muskelfasern am Ende des Experimentes mit Triton-X-100 behandelt. Diese Substanz ist geeignet, Membranen zu lysieren bzw. zu permeabilisieren. Sie wird z.B. zur Herstellung sogenannter chemisch gehäuteter Muskelfasern verwendet (MORA, PEIP, VAH3, VAH4) . Nach der "rapid skinning"-Prozedur ( 30 min; Triton-X-100 3% ) wurde die Badlösung wieder durch eine Krebs-Henseleit-Lösung ersetzt, die frei von Calcium war. Der Lösung wurden ferner 5 mMol/1 EGTA und 50 uM FURA-2/AM zugesetzt. Unter diesen Bedingungen wurde das Fluoreszenzsignal ermittelt. Nach Grynkiewicz et al (13) läßt sich die intracelluläre Calcium-konzentration unter Verwendung folgender Gleichung

berechnen:

Ca++ = ((R - Rmin)/(Rmax - R))* Kd *s (R = gemessener Quotient des emittierten Fluoreszenzlichtes bei Anregung mit 34 0 nm und 3 80 nm; Rmin = R bei minimaler freier in-tracellulärer Calciumionenkonzentration; Rmax: R bei maximaler

[S. 49] [ intracellulärer Calciumionenkonzentration; Kd = Dissoziationskon-stante des FURA-2-Calcium-Komplexes, s = Quotient der Fluoreszenz in calciumfreier Lösung und calciumhaltiger Lösung) In Anlehnung an Grienkiewics wurde der Wert für Kd mit 224 nM für Messungen bei 37 C der Literatur entnommen (13). Eine "in vivo-Kalibierung" des Systems war nicht möglich, da derzeit keine Me-thoden zur Verfügung stehen, den intracellulären Calciumtransien-ten des intakten menschlichen Herzmuskels unter physiologischen Bedingungen auf minimale und maximale Werte "festzuklemmen". Grundsätzlich sind daher alle Absolutwerte für intracelluläre Calciumspiegel mit entsprechenden methodischen Vorbehalten zu interpretieren. ]

Anmerkungen

Um zu entscheiden, ob die Textparallelen als Plagiat zu werten sind, oder doch einer ähnlichen Thematik geschuldet sind, ist eine kleingliedrige Dokumentation notwendig --> (vorerst) verdfaechtig (Hindemith)

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