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| Untersuchte Arbeit: Seite: 66, Zeilen: 1 ff. (komplett) |
Quelle: Bente 2003 Seite(n): 39, 40, 52, Zeilen: 39: 21 ff.; 40: 1 ff.; 52: 34ff |
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| [Trägt man die Fluoreszenz gegen die Temperatur grafisch auf, so kann man den] Fluoreszenzabfall beider Produkte als zwei getrennte Schmelzpunkte wahrnehmen (Abbildung 6). Damit gewinnt dieses System an Spezifität und erlaubt es, ein spezifisches Produkt von Artefakten zu unterscheiden (RIRIE et al. 1997).
Andererseits ist eine Quantifizierung mittels eines SYBR Green™ Protokolls nur dann möglich, wenn es keine Artefakte oder Primerdimer gibt.
Abbildung 6: Darstellung einer Schmelzpunktanalyse Nach der eigentlichen PCR wird das Produkt von 50 °C an in 1 °C Temperaturschritten für jeweils 30 sek bis zu einer Endtemperatur von 95 °C erhitzt. Bei einer für das Produkt spezifischen Temperatur denaturiert der Doppelstrang. Es kommt zu einem Abfall der Fluoreszenz (Peak) 2. Die zwei PCR-Produkte (A,B) mit unterschiedlicher Länge schmelzen bei unterschiedlichen Temperaturen. Auswertung der quantitativen real-time Polymerasekettenreaktion Die real-time PCR ermöglicht eine zeitgleiche Auswertung der Reaktion während des eigentlichen Amplifikationsprozesses. Die Auswertung erfolgt in der real-time RT-PCR durch die Messung der emittierten Fluoreszenz eines Farbstoffs. Emittierte Fluoreszenz und [entstehendes Amplifikat sind linear proportional.] |
Trägt man die Fluoreszenz gegen die Temperatur graphisch auf, so kann man den Fluoreszenzabfall beider Produkte als zwei getrennte Schmelzpunkte wahrnehmen (Abb. 2.7, 1). Damit gewinnt dieses System an Spezifität und erlaubt es, ein spezifisches Produkt von Artefakten zu unterscheiden (RIRIE et al. 1997). [...] Andererseits ist eine Quantifizierung mittels eines SYBR Green™ Protokolls nur dann möglich, wenn es keine Artefakte oder Primerdimer gibt.
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Abbildung 2-8: 1. Darstellung einer Schmelzpunktanalyse: Nach der eigentlichen PCR wird das Produkt von 50 °C an in 1 °C Temperaturschritten für jeweils 30 sek bis zu einer Endtemperatur von 95 °C erhitzt. Bei einer für das Produkt spezifischen Temperatur denautriert [sic] der Doppelstrang. Es kommt zu einem Abfall der Fluoreszenz (Peak) 2. Die zwei PCR-Produkte (A,B) mit unterschiedlicher Länge schmelzen bei unterschiedlichen Temperaturen. [Seite 52:] 2.3.6 Auswertung Die real-time PCR ermöglicht eine zeitgleiche Auswertung der Reaktion während des eigentlichen Amplifikationsprozesses. Die Auswertung erfolgt in der real-time RT-PCR durch die Messung der emittierten Fluoreszenz eines Farbstoffs. Emittierte Fluoreszenz und entstehendes Amplifikat sind linear proportional. |
Kein Hinweis auf die Quelle. |
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