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| Untersuchte Arbeit: Seite: 35, Zeilen: 1ff (komplett) |
Quelle: Freese 2010 Seite(n): 42, 43, Zeilen: 42: 9ff; 43: Abbildung |
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| [Dieses Oligonukleotid ist am 5'-Ende mit einem] fluoreszierenden reporter-Farbstoff (Fluoreszein-Derivat=FAM) markiert, das 3'-Ende trägt einen quencher-Farbstoff (Rhodamin-Derivat=TAMRA). Die Wahl der Sonde erfolgt mit dem Programm Primer Express, (Applied Biosystems, Foster City, USA) das speziell für das Design der Taq-Mansonden sowie Taq-Manprimer geeignet ist. Die Sonde ist hochspezifisch für das zu amplifizierende Produkt.
Nach dem primären Anlagern der Sonde an den cDNA-Strang unterdrückt der quencher zunächst durch seine räumliche Nähe zum reporter dessen Fluoreszenssignal. Während der PCR wird diese Sonde durch die Exonukleaseaktivität der Taq-Polymerase Nukleotid für Nukleotid abgebaut. Dadurch wird der reporter-Farbstoff [sic] vom quencher getrennt und die Fluoreszenz nicht länger unterdrückt. Entsprechend der Akkumulation des PCR-Produktes steigt die Fluoreszenz mit jedem weiteren Zyklus an. Das Signal kann nun im Zeitverlauf durch die Anregung zur Fluoreszenz bei 488 nm gemessen werden. Es ist dabei strikt sequenzspezifisch, da nicht perfekt passende Sondenmoleküle vor Beginn der Reaktion verdrängt werden. Funktionsweise der Taq-Man-rt- PCR
Abbildung 4: schematische Darstellung der Reaktionsabläufe bei der Methode der Taq-Man-PCR (modifiziert nach der Taq-Man-Arbeitsanleitung von Applied Biosystems). |
Dieses Oligonukleotid ist am 5'-Ende mit einem fluoreszierenden reporter-Farbstoff (Fluoreszein-Derivat=FAM) markiert, das 3'-Ende trägt einen quencher-Farbstoff (Rhodamin-Derivat=TAMRA). Die Wahl der Sonde erfolgt mit dem Programm Primer Express, Applied Biosystems, Foster City, USA, das speziell für das Design der Taqmansonden sowie Taqmanprimer geeignet ist. Die Sonde ist hochspezifisch für das zu amplifizierende Produkt.
Nach dem primären Anlagern der Sonde an den cDNA-Strang unterdrückt der quencher zunächst durch seine räumliche Nähe zum reporter dessen Fluoreszenssignal. Während der PCR wird diese Sonde durch die Exonukleaseaktivität der Taq-Polymerase Nukleotid für Nukleotid abgebaut. Dadurch wird der reporter-Farbstoff vom quencher getrennt und die Fluoreszenz nicht länger unterdrückt. Entsprechend der Akkumulation des PCR-Produktes steigt die Fluoreszenz mit jedem weiteren Zyklus an. Das Signal kann nun im Zeitverlauf durch die Anregung zur Fluoreszenz bei 488 nm gemessen werden. Es ist dabei strikt sequenzspezifisch, da nicht komplett passende Sondenmoleküle vor Beginn der Reaktion verdrängt werden. [Seite 43] _Funktionsweise der Taqman-PCR_
Abbildung 4: schematische Darstellung der Reaktionsabläufe bei der Methode der Taqman-PCR (modifiziert nach der Taqman-Arbeitsanleitung von Applied Biosystems). |
Ein Verweis auf die Quelle fehlt. Offenbar fand die Modifizierung der Abbildung nicht durch den Autor der untersuchten Arbeit statt. |
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