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Flf/032

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Bedeutung des IGF-Systems als Regulationsfaktor der Nephrogenese im Modell der hypertensiven Munich-Wistar-Frömter Ratte mit angeborenem Nephronmangel

von Dr. Florian Freese

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Statistik und Sichtungsnachweis dieser Seite findet sich am Artikelende
[1.] Flf/Fragment 032 01 - Diskussion
Zuletzt bearbeitet: 2014-08-18 01:26:51 Graf Isolan
Flf, Fragment, Freese 2010, Gesichtet, SMWFragment, Schutzlevel sysop, Verschleierung

Typus
Verschleierung
Bearbeiter
Hindemith
Gesichtet
Yes.png
Untersuchte Arbeit:
Seite: 32, Zeilen: 1ff (komplett)
Quelle: Freese 2010
Seite(n): 39, Zeilen: 39: 8ff; 40: 1-13
3.2.2.4 Reverse Transkription

Die mRNA ist ein empfindliches polymeres Molekül, das durch Temperaturschwankungen und Ribonukleasen ständig von Zerstörung bedroht ist. Für die weitere molekularbiologische Analyse musste daher die extrahierte RNA in die stabilere cDNA umgeschrieben werden. Diese Reaktion wurde mit Hilfe des First Strand cDNA Synthesis Kit, MBI Fermentas, St Leon-Rot, Deutschland, nach Herstellerangaben in zwei Schritten durchgeführt:

1. Annealing der random hexamer primer

In einem ersten Schritt wurde ein random hexamer primer gebildet: Dieser entsteht aus einem Nukleotidmix, der sich an der zu vervielfältigenden Stelle zu einem passenden Primer zusammenfindet, um die gewünschte Sequenz umschreiben zu können. Hierfür wurden zu jeweils 2μg RNA (die Berechung des entsprechenden Volumens erfolgte anhand der zuvor photometrisch errechneten RNA-Konzentrationen) 1μl des Random Hexamer Primers gegeben. Diese Mischung wurde auf 11μl Gesamtvolumen mit DEPC-Wasser aufgefüllt. Mit diesem Ansatz konnte die PCR erfolgen (für 5 Min bei 70°, dann für weitere 5 Min bei 4°C).

2. Reverse Transkription

Dem aus der ersten PCR entstandenen Ansatz wurden jeweils 4μl Puffer, 1μl RNAse-Inhibitor, 2μl dNTP-Mix sowie 2μl reverse Transkriptase-Enzym hinzugefügt, so dass weitere PCR erfolgen konnten (10 Min bei 25°, 60 Min bei 37°, 10 Min bei 70° und 10 Min bei 4°C). Das Produkt dieser Reaktion diente als Basis für alle folgenden Untersuchungen mittels Taqman-PCR.

3.2.2.5 Polymerasekettenreaktion

Die Polymerasekettenreaktion (PCR) ist eine schnelle und sensitive Methode der DNA-Analytik. Sie ist eine primerdefinierte, enzymatische Replikation, mit deren Hilfe man eine annähern exponentielle Amplifikation einer bestimmten Zielsequenz erreicht. Zur weiteren Quantifizierung der mRNA waren bisher Methoden wie Northern Blot oder dot blot notwendig, die viel Zeit sowie große Mengen an RNA erforderten. Mittels der PCR lassen sich definierte Abschnitte der DNA vervielfältigen. Die Probenansätze durchlaufen dabei die Phasen der Denaturierung, der spezifischen Anlagerung durch Hybridisierung („Annealing“) und der Elongation. Durch Temperaturerhöhung auf 95°C werden in der Denaturierungsphase die [Wasserstoffbrückenbindungen zwischen den Basenpaaren gelöst, so dass sich in der anschließenden Hybridisierungsphase bei 55°C, (Schmelztemperatur der Primer (Tm)) die sequenzspezifischen Oligonukleotide vorwärts („forward“) und rückwärts („reverse“) an ihre Komplementärsequenz anlagern können.]

3.2.2.4 Reverse Transkription

Die mRNA ist ein sehr empfindliches polymeres Molekül, das durch Temperaturschwankungen und Ribonukleasen ständig von Zerstörung bedroht ist. Für die weitere molekularbiologische Analyse musste die extrahierte RNA in stabilere cDNA umgeschrieben werden. Diese Reaktion wurde mittels des First Strand cDNA Synthesis Kit, MBI Fermentas, St Leon-Rot, Deutschland, in zwei Schritten durchgeführt:

1. Annealing der random hexamer primer

In einem ersten Schritt wurde ein sogenannter random hexamer primer gebildet: Dieser entsteht aus einem Nukleotidmix, der sich an der zu vervielfältigenden Stelle zu einem passenden Primer zusammenfindet, um die gewünschte Sequenz umschreiben zu können. Hierzu wurden zu jeweils 2μg RNA (die Berechung des entsprechenden Volumens erfolgte anhand der photometrisch gemessenen RNA-Konzentrationen) 1μl des Random Hexamer Primers gegeben. Diese Mischung wurde auf 11μl Gesamtvolumen mit DEPC-Wasser aufgefüllt. Mit diesem Ansatz konnte die PCR erfolgen (für 5 Min bei 70°, dann für weitere 5 Min bei 4°C).

2. Reverse Transkription

Dem aus der ersten PCR entstandenen Ansatz wurden jeweils 4μl Puffer, 1μl RNAse- Inhibitor, 2μl dNTP-Mix sowie 2μl reverse Transkriptase-Enzym hinzugefügt, so dass die weitere PCR erfolgen konnte (10 Min bei 25°, 60 Min bei 37°, 10 Min bei 70° und 10 Min bei 4°C). Das Produkt dieser Reaktion diente als Basis für die folgenden Untersuchungen mittels Taqman-PCR.

[Seite 40]

3.2.2.5 Polymerasekettenreaktion

Die Polymerasekettenreaktion (PCR) ist eine schnelle und sensitive Methode der DNA-Analytik. Sie ist eine primerdefinierte, enzymatische Replikation, mit deren Hilfe man eine annähernd exponentielle Amplifikation einer bestimmten Zielsequenz erreicht. Zur weiteren Quantifizierung der mRNA waren bisher Methoden wie Northern Blot oder dot blot notwendig, die viel Zeit sowie große Mengen an RNA erforderten. Mittels der Polymerasekettenreaktion lassen sich definierte Abschnitte der DNA vervielfältigen. Die Probenansätze durchlaufen dabei die Phasen Denaturierung, annealing und Elongation. Durch Temperaturerhöhung auf 95°C werden in der Denaturierungsphase die Wasserstoffbrückenbindungen zwischen den Basenpaaren aufgebrochen, so dass sich in der anschließenden Annealingphase (bei 55°C, Schmelztemperatur der Primer (Tm)) die sequenzspezifischen Oligonukleotide (forward and reverse primer) anlagern können.

Anmerkungen

Ein Verweis auf die Quelle fehlt.

Sichter
(Hindemith) Agrippina1


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