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Typus
Verschleierung
Bearbeiter
Hindemith
Gesichtet
Yes.png
Untersuchte Arbeit:
Seite: 33, Zeilen: 1ff (komplett)
Quelle: Freese 2010
Seite(n): 40, 41, Zeilen: 40: 9ff; 41: 1-10
[Durch Temperaturerhöhung auf 95°C werden in der Denaturierungsphase die] Wasserstoffbrückenbindungen zwischen den Basenpaaren gelöst, so dass sich in der anschließenden Hybridisierungsphase bei 55°C, (Schmelztemperatur der Primer (Tm)) die sequenzspezifischen Oligonukleotide vorwärts („forward“) und rückwärts („reverse“) an ihre Komplementärsequenz anlagern können. Anschließend wird in der Elongationsphase die von den Primern markierte Sequenz amplifiziert.

3.2.2.5.1 Quantitative real-time Polymerasekettenreaktion

Die quantitative real-time Polymerasekettenreaktion (rt-PCR), wie z.B. die Taq-man PCR, ist eine Methode, die es ermöglicht, während der PCR die Bildung des Produktes direkt zu verfolgen. Der Verlauf der Akkumulation des PCR Produktes über die Zeit lässt Rückschlüsse auf die Menge der enthaltenen Probe (templates) zu. Die quantitative rt-PCR basiert auf der kontinuierlichen Messung der Fluoreszenz, welche proportional zu der Quantität der amplifizierten DNA zunimmt. Eine quantitative Aussage der während der PCR gebildeten DNA wird somit möglich. In der vorgelegten Arbeit wurden die Technik der Taq-Man PCR verwendet, die nachfolgend genauer beschrieben wird.

3.2.2.5.2 Die Taq-Man-Polymerasekettenreaktion

Eine Form der real-time Polymerasekettenreaktion (rt-PCR) ist die Taq-Man PCR. Diese arbeitet mithilfe eines Taq-Man Systems, bestehend aus einer TaqMan-Sonde und einem diese Sonde umgebenden TaqMan forward- und reverse-primer-Paar.

Die Taq-Man-rt-PCR ist eine robuste Technik, die ein akkumulierendes PCR- Produkt in „Echtzeit“ über den Gebrauch einer zweifach TaqMan fluorogen markierten cDNA Sequenz (reporter und quencher fluorophore) misst. Der fluorogene 5‘-Nuklease Ansatz macht sich die endogene 5‘-3‘-Nuklease-Aktivität der Taq-Polymerase zunutze, um die TaqMan Sequenz abzubauen, die während der PCR an die Ziel cDNA-Sequenz hybridisiert. Ist die Taq-Man-Sequenz intakt, so wird das fluorophore Signal des Taq-Man-Reporters durch die fluorophore Emission des Taq-Man-Quenchers unterdrückt („quenched“)..

Während der PCR lagert sich die TaqMan-Sequenz am Ziel-cDNA-Strang an und die 5‘-3’Nuklease-Aktivität der Taq-Polymerase trennt das fluorophore Reportersignal vom fluorophoren Quenchersignal ab. Der Wegfall des Quenchers führt dem entsprechend zum Anstieg der Reporter Fluoreszenz. Die verbleibende Taq-Man-Sequenz dissoziiert von der Ziel-Sequenz, so dass sich die PCR ungehindert [fortsetzen kann.]

Durch Temperaturerhöhung auf 95°C werden in der Denaturierungsphase die

Wasserstoffbrückenbindungen zwischen den Basenpaaren aufgebrochen, so dass sich in der anschließenden Annealingphase (bei 55°C, Schmelztemperatur der Primer (Tm)) die sequenzspezifischen Oligonukleotide (forward and reverse primer) anlagern können. Anschließend wird in der Elongationsphase die von den Primern markierte Sequenz amplifiziert.

3.2.2.5.1 Quantitative real-time Polymerasekettenreaktion

Die quantitative real-time Polymerasekettenreaktion (PCR), (RATPCR), ist eine Methode, die es ermöglicht, während der PCR die Bildung des Produktes direkt zu verfolgen. Der Verlauf der Akkumulation des PCR Produktes über die Zeit lässt Rückschlüsse auf die Menge der enthaltenen templates zu. Die quantitative real-time PCR beruht auf der kontinuierlichen Messung eines Fluoreszenzsignals, welches proportional zu der Quantität der amplifizierten DNA zunimmt. Eine quantitative Aussage der während der PCR gebildeten DNA wird somit möglich. In der vorgelegten Arbeit wurden zwei verschiedene Techniken der RATPCR (Taqman/ SYBR Green) verwendet, welche im Folgenden genauer beschrieben werden.

3.2.2.5.1.1 Die Taqman-Polymerasekettenreaktion

Eine Form der real-time Polymerasekettenreaktion (PCR) stellt die Taq-Man PCR dar, welche mithilfe eines Taq-Man Systems, bestehend aus einer TaqMan-Sonde und einem diese Sonde umgebenden TaqMan forward- und reverse-primer-Paar, arbeitet.

Die TaqMan-RT-PCR ist eine entwickelte Technik, die ein akkumulierendes PCR-Produkt in „Echtzeit“ über den Gebrauch einer zweifach TaqMan fluorogen gelabelten

[Seite 41]

cDNA Sequenz (reporter und quencher fluorophore) misst. Der fluorogene 5‘-Nuklease Assay macht sich die endogene 5‘-3‘-Nuklease-Aktivität der Taq-Polymerase zunutze, um die TaqMan Sequenz zu spalten, die während der PCR an der Ziel cDNA-Sequenz hybridisiert. Ist die TaqMan-Sequenz intakt, so wird die reporter fluorophore Emission von der quencher fluorophore supprimiert.

Während der PCR lagert sich die TaqMan-Sequenz am Ziel-cDNA-Strang an und die 5‘- 3’Nuklease-Aktivität der Taq-Polymerase spaltet die reporter fluorophore von der quencher fluorophore ab, was zu einem Anstieg der reporter Fluoreszenz führt. Die verbleibende TaqMan-Sequenz dissoziiert von der Ziel-Sequenz, so dass sich die PCR ungehindert fortsetzen kann.

Anmerkungen

Ein Verweis auf die Quelle fehlt.

Sichter
(Hindemith) Agrippina1

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