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| Untersuchte Arbeit: Seite: 34, Zeilen: 1ff (komplett) |
Quelle: Freese 2010 Seite(n): 41, 42, Zeilen: 41: 10ff; 42: 1-9 |
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| Die Intensität der Fluoreszenz ist direkt proportional zur Menge der eingesetzten Ziel-cDNA.
Das Fluoreszenz-Signal wird durch ein ABI Prism 7000 sequence detection System, PE Applied Biosystems, Foster City, USA, das eine schnelle Analyse von vielen Transkripten aus einem Gewebeprobenpool im 96-well Format erlaubt, gemessen. Die Sonde sollte dabei Exon-Exon-Grenzen überschreiten, um die Hybridisierung genomischer DNA zu verhindern. Die TaqMan Sonde nutzt die 5´3´Exonukleaseaktivität der TaqPolymerase und den Fluoreszensresonanzenergietransfer („fluorescence resonance energy transfer“ (FRET)) aus. FRET ist ein physikalischer Prozess, bei dem Energie eines angeregten Fluoreszenzfarbstoffes (Donor) auf einen zweiten Fluoreszenzfarbstoff (Akzeptor) übertragen wird, sollte sich dieser in ausreichender Nähe befinden und sich das Emissionsspektrum des Donors mit dem Absorptionsspektrum des Empfängers überlagert [sic]. An beiden Enden ist die TaqMan-Sonde selbst mit Donor- und Akzeptorfluorchrom versehen und muss der PCR zugegeben werden. Bei der TaqMan PCR spricht man anstelle von Donor und Akzeptor auch von reporter und quencher, da nur Licht der Wellenlänge eines der beiden Fluorchrome, nämlich des Donors (reporters), gemessen wird. Die Sonde hybridisiert an die Zielsequenz und wird während der Elongationsphase von der TaqPolymerase abgebaut. Dabei trennen sich durch Diffusion die abgespaltenen Basen voneinander. Durch den sich dadurch vergrößernden Abstand zwischen reporter und quencher wird somit die ausgesendete Fluoreszenz des reporters durch den quencher nicht mehr absorbiert bzw. unterdrückt. Für jeden denaturierten Doppelstrang wird folglich im folgenden Zyklus ein weiteres Fluoreszenzsignal freigesetzt, so dass das Fluoreszenzsignal proportional zu der amplifizierten Menge an DNA wächst. Die Taqman-PCR ist eine PCR-Methode, bei der gleichzeitig die Amplifikation der Zielsequenz und seine Quantifizierung in einem Reaktionsgefäß ermöglicht werden. Dies gelingt auch dann, wenn nur geringe Mengen an RNA in der Probe vorhanden ist. Die Reduzierung der Arbeitsschritte und der im Vergleich geringe Zeitaufwand tragen dabei zur Minimierung von Fehlerquellen bei. Es wird bei der Taq-Man-PCR zunächst eine für die zu amplifizierende Sequenz spezifische Sonde angefertigt. |
Die Intensität der Fluoreszenz ist direkt proportional zur Menge der eingesetzten Ziel-cDNA.
Das Fluoreszenz-Signal wird durch ein ABI Prism 7000 sequence detection System, PE Applied Biosystems, Foster City, USA, das eine schnelle Analyse von vielen Transkripten aus einem Gewebeprobenpool im 96-well Format erlaubt, gemessen. Die Sonde sollte dabei Exon-Exon-Grenzen überschreiten, um die Hybridisierung genomischer DNA zu verhindern. Die TaqMan Sonde nutzt die 5´3´Exonukleaseaktivität der TaqPolymerase und den fluorescence resonance energy transfer (FRET) aus. FRET ist ein physikalischer Prozess, bei dem Energie eines angeregten Fluoreszenzfarbstoffes (Donor) auf einen zweiten Fluoreszenzfarbstoff (Akzeptor) übertragen wird, sollte sich dieser in ausreichender Nähe befinden und sich das Emissionsspektrum des Donors mit dem Absorptionsspektrum des Empfängers überlagern. An beiden Enden ist die TaqMan-Sonde selbst mit Donor- und Akzeptorfluorchrom versehen und muss der PCR zugegeben werden. Bei der TaqMan PCR spricht man anstelle von Donor und Akzeptor auch von reporter und quencher, da nur Licht der Wellenlänge eines der beiden Fluorchrome, nämlich des Donors (reporters), gemessen wird. Die Sonde hybridisiert an die Zielsequenz und wird während der Elongationsphase von der TaqPolymerase abgebaut. Dabei trennen sich durch Diffusion die abgespaltenen Basen voneinander. Durch den dadurch sich vergrößernden Abstand zwischen reporter und quencher wird somit die ausgesendete Fluoreszenz des reporters durch den quencher nicht mehr unterdrückt. Für jeden denaturierten Doppelstrang wird folglich im folgenden Zyklus ein weiteres [Seite 42] Fluoreszenzsignal freigesetzt, so dass das Fluoreszenzsignal proportional zu der amplifizierten Menge an DNA wächst. Die Taqman-PCR ist eine Variante der PCR-Methode, bei der die Amplifikation der Zielsequenz und seine Quantifizierung simultan in einem Reaktionsgefäß ermöglicht werden. Dies gelingt auch, wenn nur geringe Mengen RNA in der Probe vorhanden sind. Die Reduzierung der Arbeitsschritte und der im Vergleich geringe Zeitaufwand tragen dabei zur Minimierung der verschiedenen Fehlerquellen bei. Es wird bei der Taqman-PCR zunächst eine für die zu amplifizierende Sequenz spezifische Sonde angefertigt. |
Ein Verweis auf die Quelle fehlt. |
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