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Hk/Fragment 011 01

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Typus
Verschleierung
Bearbeiter
Graf Isolan
Gesichtet
Yes.png
Untersuchte Arbeit:
Seite: 11, Zeilen: 1-8, 12, 16-32
Quelle: Soltanpour 2004
Seite(n): 16, Zeilen: 1-29
3. Methoden

3.1 Präparation isolierter Herzmuskelzellen und deren Inkubation

Zu Beginn der Präparation von Ca++-toleranten Herzmuskelzellen wurde eine Langendorff-Apparatur zunächst mit Krebs-Ringer-Bikarbonatpuffer (KRB-Puffer) gespült und danach mit dem gleichen Puffer luftblasenfrei gefüllt. Während der gesamten Herzzellisolierung wurde die Perfusionslösung weiter mit Carbogen begast.

Zur Isolierung von ventrikulären Myokardzellen wurden

a) ca. 12 Wochen alte, 300-400 g schwere, männliche Wistar-Ratten
b) ca. 12 Wochen alte, 300-400 g schwere, männliche spontan hypertensive Ratten (SHR)
c) ca. 10 Wochen alte, 100-200 g schwere männliche und weibliche transgene Mäuse, die eine myokardiale Expression konstitutiv aktivierter Akt besitzen

aus dem Tierstall des Physiologischen Instituts, Justus-Liebig-Universität Giessen,

d) ca. 10 Wochen alte, 100-200 g schwere männliche und weibliche transgene TGF-β überexprimierende Mäuse

aus dem Tierstall der Inneren Medizin Köln, Universität zu Köln

mit Diethylether narkotisiert und thorakotomiert. Die Herzen wurden mit eiskalter 0,15 M NaCl-Lösung stillgestellt und oberhalb des Aortenbogens abgetrennt, danach die Lungenflügel entfernt und die Aorta freipräpariert. Bei langsam laufender Perfusion mit den KRB-Puffer (ca. 30 Tropfen/min) wurden die Herzen mit der freipräparierten Aorta an die Langendorff-Apparatur angehängt und mit 40 ml pro Herz blutfrei perfundiert. Anschließend wurde für 30 min mit Kollagenasepuffer (2-3 ml/min) rezirkulierend perfundiert. Nach Beendigung der Perfusion wurden die Vorhöfe entfernt und das Ventrikelgewebe mit einem Gewebehacker (Tissue Chopper 1086, Bachofer, Reutlingen) bei einer Schnittbreite von 0,7 mm mechanisch zerkleinert. Im Kollagenasepuffer mit 1 % Albumin wurde das Gewebe während eines 15-20 minütigen wiederholten Ansaugens mit einer 10 ml Pipette aufgetrennt.

Die so gewonnene Zellsuspension wurde bei Raumtemperatur durch ein Nylonnetz mit 200 μm Porengröße filtriert, um Bindegewebestücke abzutrennen. Das Filtrat wurde für 3 min bei 400 Upm zentrifugiert (Digifuge GL. Heraeus-Christ, Osterode/Harz), um Zelltrümmer und kleinere Zellen, wie z. B. Endothelzellen, von intakten Myozyten zu trennen. Das Sediment wurde im KRB-Puffer + 0,2 mmol/l CaCl2 resuspendiert und erneut bei 400 Upm für 3 min zentrifugiert. Intakte Ca++-tolerante Myozyten wurden durch Sedimentation durch ein Medium hoher Dichte aufkonzentriert.

3. Kapitel: Methoden

3.1. Präparation isolierter Herzmuskelzellen und deren Inkubation

Zu Beginn der Präparation von Ca++-toleranten Herzmuskelzellen wurde eine Langendorff-Apparatur zunächst mit Krebs-Ringer-Bikarbonatpuffer (KRB-Puffer) gespült und danach mit dem gleichen Puffer luftblasenfrei gefüllt. Während der gesamten Herzzellisolierung wurde die Perfusionslösung weiter mit Carbogen begast.

Zur Isolierung von ventrikulären Myokardzellen wurden ca. 12 Wochen alte, 300-350g schwere, männliche Wistar-Ratten aus dem Tierstall des Physiologischen Instituts, Justus-Liebig-Universität Giessen, mit Diethylether narkotisiert und thorakotomiert. Die Herzen wurden mit eiskalter 0,15 M NaCl-Lösung stillgestellt und oberhalb des Aortenbogens abgetrennt, danach die Lungenflügel entfernt und die Aorta freipräpariert. Bei langsam laufender Perfusion mit dem KRB-Puffer (ca. 30 Tropfen/min) wurden die Herzen mit der freipräparierten Aorta an die Langendorff-Apparatur angehängt und mit 40 ml pro Herz blutfrei perfundiert. Anschließend wurde für 30 min mit Kollagenasepuffer (2-3 ml/min) rezirkulierend perfundiert. Nach Beendigung der Perfusion wurden die Vorhöfe entfernt, und das Ventrikelgewebe mit einem Gewebehacker (Tissue Chopper 1086, Bachofer, Reutlingen) bei einer Schnittbreite von 0,7 mm mechanisch zerkleinert. Im Kollagenasepuffer mit 1% Albumin wurde das Gewebe während eines 15-20-minütigen wiederholten Ansaugens mit einer 10 ml-Pipette weiter aufgetrennt.

Die so gewonnene Zellsuspension wurde bei Raumtemperatur durch ein Nylonnetz mit 200 μm Porengrösse filtriert, um Bindegewebsstücke abzutrennen. Das Filtrat wurde für 3 min bei 400 Upm zentrifugiert (Digifuge GL, Heraeus-Christ, Osterode/Harz), um Zelltrümmer und kleinere Zellen, wie z. B. Endothelzellen, von intakten Myozyten zu trennen. Das Sediment wurde im KRB-Puffer + 0,2 mM CaCl2 resuspendiert und erneut bei 400 Upm für 3 min zentrifugiert. Intakte Ca++-tolerante Myozyten wurden durch Sedimentation durch ein Medium hoher Dichte aufkonzentriert.

Anmerkungen

Weitgehend identisch, ohne jede Kennzeichnung.

Sichter
(Graf Isolan), Agrippina1, Guckar

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