von Heinrich Wieland
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| [1.] Hw/Fragment 019 01 - Diskussion Zuletzt bearbeitet: 2014-08-31 12:30:30 Schumann | Blume 2003, Fragment, Gesichtet, Hw, KomplettPlagiat, SMWFragment, Schutzlevel sysop |
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| Untersuchte Arbeit: Seite: 19, Zeilen: 1-13 |
Quelle: Blume 2003 Seite(n): 78, Zeilen: 8-23 |
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| Anschließend wurde der pYES2/2epi-Vektor in den S. cerevisiae-Stamm INVSc1 transformiert. Als Kontrollen wurden zusätzlich der Leervektor und ein pYES2/lacZ-Konstrukt (Invitrogen), das zur Expression der β-Galactosidase führt, transformiert. Die Selektion der transgenen Hefezellen erfolgte durch die Abwesenheit von Uracil im Medium. Der Uracil-auxotrophe Hefestamm INVSc1 kann Uracil durch einen Defekt im URA3-Gen nicht mehr selbst synthetisieren. Dieser Defekt wird durch die Anwesenheit des pYES2-Vektors, der das URA3- Gen trägt, komplementiert. Die transgenen Hefen wurden in größeren Mengen in Uracildefizientem Medium angezogen. Bei einer OD600 von etwa 1,0 wurde mit 2% Galactose induziert, so daß das UDP-GlcNAc-2-Epimerase/ManNAc-Kinase-Gen abgelesen werden konnte. Zu den Zeitpunkten 0, 2, 4, 6, 8, 10 und 24 h nach der Galactose-Induktion wurde jeweils ein Aliquot der Hefezellen geerntet und mit Glasperlen mechanisch aufgeschlossen. Nach Zentrifugation wurde der proteinhaltige Überstand auf Enzymaktivitäten untersucht und die Anwesenheit der UDP-GlcNAc-2-Epimerase/ManNAc-Kinase bzw. der β-Galactosidase in [einem SDS-Polyacrylamidgel versucht nachzuweisen.] | Anschließend wurde der pYES2/2epi-Vektor in den S. cerevisiae Stamm INVSc1 transformiert. Als Kontrollen wurden zusätzlich der Leervektor und ein pYES2/lacZ-Konstrukt (Invitrogen), das zur Expression der β-Galactosidase führt, transformiert. Die Selektion der transgenen Hefezellen erfolgte durch die Abwesenheit von Uracil im Medium. Der Uracil-auxotrophe Hefestamm INVSc1 kann Uracil durch einen Defekt im URA3-Gen nicht mehr selbst synthetisieren. Dieser Defekt wird durch die Anwesenheit des pYES2- Vektors, der das URA3-Gen trägt, komplementiert.
Die transgenen Hefen wurden in größeren Mengen in uracildefizientem Medium angezogen. Bei einer OD600 von etwa 1,0 wurde mit 2% Galactose induziert, so daß das UDP-GlcNAc-2-Epimerase/ManNAc-Kinase-Gen abgelesen werden konnte. Zu den Zeitpunkten 0, 2, 4, 6, 8, 10 und 24 h nach der Galactose-Induktion wurde jeweils ein Aliquot der Hefezellen geerntet und mit Glasperlen mechanisch aufgeschlossen. Nach Zentrifugation wurde der proteinhaltige Überstand auf Enzymaktivitäten untersucht und die Anwesenheit der UDP-GlcNAc-2-Epimerase/ManNAc-Kinase bzw. der β-Galactosidase in einem SDS-Polyacrylamidgel versucht nachzuweisen. |
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