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Hw/033

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Charakterisierung funktioneller Aminosäuren der UDP-N-Acetylglucosamin-2-Epimerase/N-Acetylmannosaminkinase

von Dr. Heinrich Wieland

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Statistik und Sichtungsnachweis dieser Seite findet sich am Artikelende
[1.] Hw/Fragment 033 01 - Diskussion
Zuletzt bearbeitet: 2014-08-31 12:37:14 Schumann
Blume 2003, Fragment, Gesichtet, Hw, KomplettPlagiat, SMWFragment, Schutzlevel sysop

Typus
KomplettPlagiat
Bearbeiter
Hindemith
Gesichtet
Yes.png
Untersuchte Arbeit:
Seite: 33, Zeilen: 1ff (komplett)
Quelle: Blume 2003
Seite(n): 36, 37, Zeilen: 36: 17ff - 37: 1ff
Zentrifuge Megafuge 1.0 Heraeus

6.2. Methoden

6.2.1. Allgemeine molekularbiologische Methoden

6.2.1.1. Präparation von Plasmid-DNA

Alle Plasmidpräparationen werden mit dem „Plasmid Purification Kit“ der Firma Qiagen (Deutschland) durchgeführt. Die Methode geht auf die alkalische Lyse nach Birnboim und Doly (1979) zurück. Für eine Mini-Plasmidpräparation (30-50 μg DNA) werden von einer E. coliÜbernachtkultur in selektivem LB-Medium 2 ml in ein Eppendorf-Reaktionsgefäß überführt und 10 min bei 20000 x g zentrifugiert. Das erhaltene Bakterienpellet wird in 200 μl Puffer I, versetzt mit 100 mg/l RNase A, unter leichtem Vortexen gut resuspendiert. Anschließend werden 200 μl Puffer II zugegeben, durch vorsichtiges Schwenken wird der Ansatz gut gemischt und 5 min bei RT inkubiert. Die stark alkalische Pufferlösung II lysiert die Zellen und setzt dadurch die Plasmid-DNA frei. Nach Zugabe von 200 μl des Neutralisations-Puffers III wird der Ansatz mindestens 15 min auf Eis inkubiert. Durch die hohe Salzkonzentration dieser Lösung werden die Proteine und die chromosomale DNA gefällt, während die Plasmid-DNA gelöst bleibt. Durch eine 15-minütige Zentrifugation bei 20000 x g werden die zellulären Proteine und die chromosomale DNA pelletiert. Der Überstand mit der Plasmid-DNA wird nochmals für 15 min zentrifugiert. Anschließend wird die Plasmid-DNA im Überstand mit 450 μl (0,7 Volumen) 2- Propanol gefällt und nach 30-minütiger Inkubation bei –20 °C durch Zentrifugation für 15 min bei 20000 x g pelletiert. Um restliche Salze zu entfernen, wird das DNA-Pellet mit 500 μl kaltem 70% (v/v) Ethanol gewaschen. Das Präzipitat wird anschließend getrocknet, in 30 μl Wasser oder TE-Puffer (10 mM Tris- HCl, pH 7,5 / 1 mM EDTA) aufgenommen und quantifiziert bzw. analysiert. Um größere Mengen (100 bzw. 500 μg) High-Copy-Plasmid-DNA zu isolieren, werden 25 ml bzw. 100 ml E. coli-Übernachtkulturen angesetzt und das Plasmid wie oben beschrieben isoliert. Bevor die Plasmid-DNA mit 2-Propanol gefällt wird, erfolgt bei diesen Midi- bzw. Maxi-Plasmidpräparationen eine weitere Reinigung der DNA über ein Anionen- Austauscher-Harz, an das Plasmid-DNA bei geringen Salzkonzentrationen und niedrigem pH-Wert bindet. Verunreinigungen, wie z.B. Proteine, werden bei mittleren Salzkonzentrationen entfernt. Mit Hochsalzpuffer wird die Plasmid-DNA eluiert, durch 2-Propanol gefällt und mit [kaltem 70% (v/v) Ethanol gewaschen, um restliche Salze zu entfernen.]

Zentrifuge Megafuge 1.0 Heraeus

2.2. Methoden

2.2.1 Allgemeine molekularbiologische Methoden

2.2.1.1 Präparation von Plasmid-DNA

Alle Plasmidpräparationen werden mit dem „Plasmid Purification Kit“ der Firma Qiagen (Deutschland) durchgeführt. Die Methode geht auf die alkalische Lyse nach Birnboim und Doly (1979) zurück.

Für eine Mini-Plasmidpräparation (30-50 μg DNA) werden von einer E. coliÜbernachtkultur in selektivem LB-Medium 2 ml in ein Eppendorf-Reaktionsgefäß überführt und 10 min bei 20000 x g zentrifugiert. Das erhaltene Bakterienpellet wird in 200 μl Puffer I, versetzt mit 100 mg/l RNase A, unter leichtem Vortexen gut resuspendiert. Anschließend werden 200 μl Puffer II zugegeben, durch vorsichtiges Schwenken wird der Ansatz gut gemischt und 5 min bei RT inkubiert. Die stark alkalische Pufferlösung II lysiert die Zellen und setzt dadurch die Plasmid-DNA frei. Nach Zugabe von 200 μl des Neutralisations-Puffers III wird der Ansatz mindestens 15 min auf Eis inkubiert. Durch die hohe Salzkonzentration dieser Lösung werden die Proteine und die chromosomale DNA gefällt, während die Plasmid-DNA gelöst bleibt. Durch eine 15-minütige Zentrifugation bei 20000 x g werden die zellulären Proteine und die chromosomale DNA pelletiert. Der Überstand mit der Plasmid-DNA wird nochmals für 15 min zentrifugiert. Anschließend wird die Plasmid-DNA im Überstand mit 450 μl (0,7 Volumen) 2-Propanol gefällt und nach 30-minütiger Inkubation bei –20 °C durch Zentrifugation für 15 min bei 20000 x g pelletiert. Um restliche Salze zu entfernen, wird das DNA-Pellet mit 500 μl kaltem 70% (v/v) Ethanol gewaschen. Das

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Präzipitat wird anschließend getrocknet, in 30 μl Wasser oder TE-Puffer (10 mM Tris- HCl, pH 7,5 / 1 mM EDTA) aufgenommen und quantifiziert bzw. analysiert.

Um größere Mengen (100 bzw. 500 μg) High-Copy-Plasmid-DNA zu isolieren, werden 25 ml bzw. 100 ml E. coli-Übernachtkulturen angesetzt und das Plasmid wie oben beschrieben isoliert. Bevor die Plasmid-DNA mit 2-Propanol gefällt wird, erfolgt bei diesen Midi- bzw. Maxi-Plasmidpräparationen eine weitere Reinigung der DNA über ein Anionen-Austauscher-Harz, an das Plasmid-DNA bei geringen Salzkonzentrationen und niedrigem pH-Wert bindet. Verunreinigungen, wie z.B. Proteine, werden bei mittleren Salzkonzentrationen entfernt. Mit Hochsalzpuffer wird die Plasmid-DNA eluiert, durch 2-Propanol gefällt und mit kaltem 70% (v/v) Ethanol gewaschen, um restliche Salze zu entfernen.

Anmerkungen

Ein Verweis auf die Quelle fehlt.

Sichter
(Hindemith) Schumann


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Letzte Bearbeitung dieser Seite: durch Benutzer:Schumann, Zeitstempel: 20140831123808

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