von Heinrich Wieland
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| [1.] Hw/Fragment 038 01 - Diskussion Zuletzt bearbeitet: 2014-08-31 12:44:31 Schumann | Blume 2003, Fragment, Gesichtet, Hw, KomplettPlagiat, SMWFragment, Schutzlevel sysop |
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| Untersuchte Arbeit: Seite: 39, Zeilen: 1ff (komplett) |
Quelle: Blume 2003 Seite(n): 41, 42, Zeilen: 41: 4ff; 42: 1ff |
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| [Bei der Sequenzierung mit Fluoreszenz-markierten Sequenzierprimern werden 4 pmol Sequenzierprimer mit 1,2 μg DNA auf vier Nukleotidmixe („Thermo SequenaseTM Primer Cycle Sequencing Kit“; Amersham, Deutschland) verteilt und die] Ansätze mit einem Gesamtvolumen von 6 μl einem Cycle-Sequencing mit 25 Zyklen (20 sec 95°C / 20 sec 60 °C / 10 sec 72°C) unterzogen. Anschließend wird 1 μl des zuvor mit 4 μl Gelladepuffer gestoppten Reaktionsmixes auf ein 6%iges Polyacrylamid-Gel aufgetragen und in einerautomatischen [sic] Sequenziereinrichtung (LI-COR 4200; MWG-Biotech, Deutschland) analysiert.
6.2.1.12. Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR) Mit Hilfe der Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR) kann eine ausgewählte DNA-Sequenz in vitro exponentiell amplifiziert werden, z.B. um die Anwesenheit eines bestimmten DNA-Fragments nachzuweisen. Zur Synthese werden eine DNA-Sequenz, die als Template bezeichnet wird, und zwei Oligonukleotidprimer benötigt, die die zu amplifizierende Region flankieren. Die PCR wird mit dem „AmpliTaq DNA Polymerase with GeneAmp Kit“ (Perkin Elmer, USA) nach Anweisungen des Herstellers durchgeführt. Ein Standardansatz für eine PCR sieht dabei wie folgt aus: Template 10-100 ng Primer je 20 pmol dNTPs je 2 mM MgCl2 1,5 mM Puffer 10 x PCR-Buffer II Taq-Polymerase 0,5 μl/50 μl Ansatz Die Reaktion wird in einem Touch-Down-Thermocycler (Hybaid) mit folgendem Programm durchgeführt: 3 min 95 °C 30 x (30 sec 95 °C / 30 sec 55 °C / 2 min 72 °C) 7 min 72 °C Ein Aliquot von 5 μl wird zur Analyse auf ein Agarosegel aufgetragen. 6.2.1.13. Herstellung von Punktmutanten Zur Generierung von Mutanten wird der „QuickChangeTM Site-Directed-Mutagenesis Kit“ von Stratagene (USA) eingesetzt. |
Bei der Sequenzierung mit Fluoreszenz-markierten Sequenzierprimern werden 4 pmol Sequenzierprimer mit 1,2 μg DNA auf vier Nukleotidmixe („Thermo SequenaseTM Primer Cycle Sequencing Kit“; Amersham, Deutschland) verteilt und die Ansätze mit einem Gesamtvolumen von 6 μl einem Cycle-Sequencing mit 25 Zyklen (20sec 95°C / 20 sec 60 °C / 10sec 72°C) unterzogen. Anschließend wird 1 μl des zuvor mit 4 μl Gelladepuffer gestoppten Reaktionsmixes auf ein 6%iges Polyacrylamid-Gel aufgetragen und in einer automatischen Sequenziereinrichtung (LI-COR 4200; MWG-Biotech, Deutschland) analysiert.
[...] 2.2.1.13 Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR) Mit Hilfe der Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR) kann eine ausgewählte DNA-Sequenz in vitro exponentiell amplifiziert werden, z.B. um die Anwesenheit eines bestimmten DNA-Fragments nachzuweisen. Zur Synthese werden eine DNA-Sequenz, die als Template bezeichnet wird, und zwei Oligonukleotidprimer benötigt, die die zu amplifizierende Region flankieren. Die PCR wird mit dem „AmpliTaq®DNA Polymerase with GeneAmp® Kit“ (Perkin Elmer, USA) nach Anweisungen des Herstellers durchgeführt. Ein Standardansatz für eine PCR sieht dabei wie folgt aus:
[Seite 42] Die Reaktion wird in einem Touch-Down-Thermocycler (Hybaid) mit folgendem Programm durchgeführt:
Ein Aliquot von 5 μl wird zur Analyse auf ein Agarosegel aufgetragen. 2.2.1.14 Herstellung von Punktmutanten Zur Generierung von Mutanten wird der „QuickChangeTM Site-Directed-Mutagenesis Kit“ von Stratagene (USA) eingesetzt. |
Ein Verweis auf die Quelle fehlt. |
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