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Charakterisierung funktioneller Aminosäuren der UDP-N-Acetylglucosamin-2-Epimerase/N-Acetylmannosaminkinase

von Dr. Heinrich Wieland

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Statistik und Sichtungsnachweis dieser Seite findet sich am Artikelende
[1.] Hw/Fragment 042 01 - Diskussion
Zuletzt bearbeitet: 2014-08-31 12:49:03 Schumann
Blume 2003, Fragment, Gesichtet, Hw, KomplettPlagiat, SMWFragment, Schutzlevel sysop

Typus
KomplettPlagiat
Bearbeiter
Hindemith
Gesichtet
Yes.png
Untersuchte Arbeit:
Seite: 42, Zeilen: 1ff (komplett)
Quelle: Blume 2003
Seite(n): 54, 57, 58, Zeilen: 54: 1ff; 57: 24ff; 58: 1ff
6.2.3. Allgemeine proteinbiochemische Methoden

6.2.3.1. Proteinbestimmung nach Bradford

Die Proteinbestimmung wird nach der Methode von Bradford (1976) durchgeführt, bei der der Farbstoff Coomassie-Brillantblau mit Proteinen unter Komplexbildung reagiert. 20 μl proteinhaltige Probe werden mit 1 ml Bradford-Reagenz (10% (v/v) Phosphorsäure / 5% (v/v) Ethanol / 0,1% (w/v) Coomassie G-250) versetzt und 3 min bei RT inkubiert. Anschließend wird die Extinktion bei 578 nm bestimmt. Als Proteinstandard dient Rinderserumalbumin.

6.2.3.2. UDP-GlcNAc-2-Epimerase-Assays

Zum Nachweis der UDP-GlcNAc-2-Epimerase-Aktivität werden zum einen der nichtradioaktive UDP-GlcNAc-2-Epimerase-Assay mit anschließendem colorimetrischen Nachweis des entstandenen ManNAc zum anderen der sehr viel empfindlichere radioaktive UDP-GlcNAc-2- Epimerase-Assay durchgeführt. Nichtradioaktiver UDP-GlcNAc-2-Epimerase-Assay 1: 100 μl Probe/Wasser werden mit 45 μl 200 mM Natriumphosphatpuffer, pH 7,5, 45 μl 50 mM MgCl2 und 2,5 μl 100 mM UDP-GlcNAc gemischt und in der Regel für 30 min bei 37 °C inkubiert. Die Reaktion wird durch 1-minütige Inkubation bei 100 °C gestoppt. Die denaturierten Proteine aus dem Enzymreaktionsansatz werden durch Zentrifugation bei 20000 x g für 1 min pelletiert. Das entstandene ManNAc wird mittels Morgan-Elson-Test (Reissig et al., 1955), mit dem spezifisch N-Acetylhexosamine detektiert werden, nachgewiesen. Nach der Zentrifugation werden 150 μl des Überstandes mit 30 μl 0,8 M H2BO3-Puffer, pH 9,1 (mit KOH eingestellt), gemischt und für 3 min bei 100 °C inkubiert. Anschließend werden 800 μl Farbreagenz (1% (w/v) 4- Dimethylaminobenzaldehyd / 1,25% (v/v) 10 M HCl in Essigsäure) zugegeben und für 30 min bei 37 °C inkubiert. Die Extinktion wird bei 578 nm gemessen. Nichtradioaktiver UDP-GlcNAc- 2-Epimerase-Assay 2: Für einige zeitabhängige Aktivitätsmessungen wird ein modifizierter UDP-GlcNAc-2-Epimerase-Assay verwendet. In diesem Epimerase-Assay 2 werden unterschiedliche Probenvolumina mit 260 μl 200 mM Tris-HCl, pH 8,1 / 65 mM MgCl, 10 μl 100 mM UDP-GlcNAc, 40 μl frisch angesetztem 100 mM Phosphoenolpyruvat, 20 μl frisch angesetztem 15 mM NADH und 2 μl Pyruvat-Kinase/Lactat-Dehydrogenase (2 U) in einem Gesamtvolumen von 800 μl gemischt. Die Enzymreaktion wird bei 37 °C im Photometer bei 340 nm verfolgt. Als Kontrolle wird ein Ansatz ohne Enzym gemessen und die ermittelten Werte später von den Werten der Enzymreaktion abgezogen.

2.2.6 Allgemeine proteinbiochemische Methoden

2.2.6.1 Proteinbestimmung nach Bradford

Die Proteinbestimmung wird nach der Methode von Bradford (1976) durchgeführt, bei der der Farbstoff Coomassie-Brillantblau mit Proteinen unter Komplexbildung reagiert. 20 μl proteinhaltige Probe werden mit 1 ml Bradford-Reagenz (10% (v/v) Phosphorsäure / 5% (v/v) Ethanol / 0,1% (w/v) Coomassie G-250) versetzt und 3 min bei RT inkubiert. Anschließend wird die Extinktion bei 578 nm bestimmt. Als Proteinstandard dient Rinderserumalbumin.

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2.2.6.8 UDP-GlcNAc-2-Epimerase-Assays

Zum Nachweis der UDP-GlcNAc-2-Epimerase-Aktivität werden zum einen der nichtradioaktive UDP-GlcNAc-2-Epimerase-Assay mit anschließendem colorimetrischen Nachweis des entstandenen ManNAc zum anderen der sehr viel empfindlichere radioaktive UDP-GlcNAc-2-Epimerase-Assay durchgeführt.

Nichtradioaktiver UDP-GlcNAc-2-Epimerase-Assay 1: 100 μl Probe/Wasser werden mit 45 μl 200 mM Natriumphosphatpuffer, pH 7,5, 45 μl 50 mM MgCl2 und 2,5 μl 100 mM UDP-GlcNAc gemischt und in der Regel für 30 min bei 37 °C inkubiert. Die Reaktion wird durch 1-minütige Inkubation bei 100 °C gestoppt. Die denaturierten Proteine aus dem Enzymreaktionsansatz werden durch Zentrifugation bei 20000 x g für 1 min pelletiert. Das entstandene ManNAc wird mittels Morgan-Elson-Test (Reissig et

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al., 1955), mit dem spezifisch N-Acetylhexosamine detektiert werden, nachgewiesen. Nach der Zentrifugation werden 150 μl des Überstandes mit 30 μl 0,8 M H2BO3-Puffer, pH 9,1 (mit KOH eingestellt) gemischt und für 3 min bei 100 °C inkubiert. Anschließend werden 800 μl Farbreagenz (1% (w/v) 4-Dimethylaminobenzaldehyd / 1,25% (v/v) 10 M HCl in Essigsäure) zugegeben und für 30 min bei 37 °C inkubiert. Die Extinktion wird bei 578 nm gemessen.

Nichtradioaktiver UDP-GlcNAc-2-Epimerase-Assay 2: Für einige zeitabhängige Aktivitätsmessungen wird ein modifizierter UDP-GlcNAc-2-Epimerase-Assay verwendet. In diesem Epimerase-Assay 2 werden unterschiedliche Probenvolumina mit 260 μl 200 mM Tris-HCl, pH 8,1 / 65 mM MgCl2, 10 μl 100 mM UDP-GlcNAc, 40 μl frisch angesetztem 100 mM Phosphoenolpyruvat, 20 μl frisch angesetztem 15 mM NADH und 2 μl Pyruvat-Kinase/Lactat-Dehydrogenase (2 U) in einem Gesamtvolumen von 800 μl gemischt. Die Enzymreaktion wird bei 37 °C im Photometer bei 340 nm verfolgt. Als Kontrolle wird ein Ansatz ohne Enzym gemessen und die ermittelten Werte später von den Werten der Enzymreaktion abgezogen.

Anmerkungen

Ein Verweis auf die Quelle fehlt.

Sichter
(Hindemith) Schumann


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Letzte Bearbeitung dieser Seite: durch Benutzer:Schumann, Zeitstempel: 20140831124940

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