von Heinrich Wieland
Statistik und Sichtungsnachweis dieser Seite findet sich am Artikelende
| [1.] Hw/Fragment 042 01 - Diskussion Zuletzt bearbeitet: 2014-08-31 12:49:03 Schumann | Blume 2003, Fragment, Gesichtet, Hw, KomplettPlagiat, SMWFragment, Schutzlevel sysop |
|
|
|
| Untersuchte Arbeit: Seite: 42, Zeilen: 1ff (komplett) |
Quelle: Blume 2003 Seite(n): 54, 57, 58, Zeilen: 54: 1ff; 57: 24ff; 58: 1ff |
|---|---|
| 6.2.3. Allgemeine proteinbiochemische Methoden
6.2.3.1. Proteinbestimmung nach Bradford Die Proteinbestimmung wird nach der Methode von Bradford (1976) durchgeführt, bei der der Farbstoff Coomassie-Brillantblau mit Proteinen unter Komplexbildung reagiert. 20 μl proteinhaltige Probe werden mit 1 ml Bradford-Reagenz (10% (v/v) Phosphorsäure / 5% (v/v) Ethanol / 0,1% (w/v) Coomassie G-250) versetzt und 3 min bei RT inkubiert. Anschließend wird die Extinktion bei 578 nm bestimmt. Als Proteinstandard dient Rinderserumalbumin. 6.2.3.2. UDP-GlcNAc-2-Epimerase-Assays Zum Nachweis der UDP-GlcNAc-2-Epimerase-Aktivität werden zum einen der nichtradioaktive UDP-GlcNAc-2-Epimerase-Assay mit anschließendem colorimetrischen Nachweis des entstandenen ManNAc zum anderen der sehr viel empfindlichere radioaktive UDP-GlcNAc-2- Epimerase-Assay durchgeführt. Nichtradioaktiver UDP-GlcNAc-2-Epimerase-Assay 1: 100 μl Probe/Wasser werden mit 45 μl 200 mM Natriumphosphatpuffer, pH 7,5, 45 μl 50 mM MgCl2 und 2,5 μl 100 mM UDP-GlcNAc gemischt und in der Regel für 30 min bei 37 °C inkubiert. Die Reaktion wird durch 1-minütige Inkubation bei 100 °C gestoppt. Die denaturierten Proteine aus dem Enzymreaktionsansatz werden durch Zentrifugation bei 20000 x g für 1 min pelletiert. Das entstandene ManNAc wird mittels Morgan-Elson-Test (Reissig et al., 1955), mit dem spezifisch N-Acetylhexosamine detektiert werden, nachgewiesen. Nach der Zentrifugation werden 150 μl des Überstandes mit 30 μl 0,8 M H2BO3-Puffer, pH 9,1 (mit KOH eingestellt), gemischt und für 3 min bei 100 °C inkubiert. Anschließend werden 800 μl Farbreagenz (1% (w/v) 4- Dimethylaminobenzaldehyd / 1,25% (v/v) 10 M HCl in Essigsäure) zugegeben und für 30 min bei 37 °C inkubiert. Die Extinktion wird bei 578 nm gemessen. Nichtradioaktiver UDP-GlcNAc- 2-Epimerase-Assay 2: Für einige zeitabhängige Aktivitätsmessungen wird ein modifizierter UDP-GlcNAc-2-Epimerase-Assay verwendet. In diesem Epimerase-Assay 2 werden unterschiedliche Probenvolumina mit 260 μl 200 mM Tris-HCl, pH 8,1 / 65 mM MgCl, 10 μl 100 mM UDP-GlcNAc, 40 μl frisch angesetztem 100 mM Phosphoenolpyruvat, 20 μl frisch angesetztem 15 mM NADH und 2 μl Pyruvat-Kinase/Lactat-Dehydrogenase (2 U) in einem Gesamtvolumen von 800 μl gemischt. Die Enzymreaktion wird bei 37 °C im Photometer bei 340 nm verfolgt. Als Kontrolle wird ein Ansatz ohne Enzym gemessen und die ermittelten Werte später von den Werten der Enzymreaktion abgezogen. |
2.2.6 Allgemeine proteinbiochemische Methoden
2.2.6.1 Proteinbestimmung nach Bradford Die Proteinbestimmung wird nach der Methode von Bradford (1976) durchgeführt, bei der der Farbstoff Coomassie-Brillantblau mit Proteinen unter Komplexbildung reagiert. 20 μl proteinhaltige Probe werden mit 1 ml Bradford-Reagenz (10% (v/v) Phosphorsäure / 5% (v/v) Ethanol / 0,1% (w/v) Coomassie G-250) versetzt und 3 min bei RT inkubiert. Anschließend wird die Extinktion bei 578 nm bestimmt. Als Proteinstandard dient Rinderserumalbumin. [Seite 57] 2.2.6.8 UDP-GlcNAc-2-Epimerase-Assays Zum Nachweis der UDP-GlcNAc-2-Epimerase-Aktivität werden zum einen der nichtradioaktive UDP-GlcNAc-2-Epimerase-Assay mit anschließendem colorimetrischen Nachweis des entstandenen ManNAc zum anderen der sehr viel empfindlichere radioaktive UDP-GlcNAc-2-Epimerase-Assay durchgeführt. Nichtradioaktiver UDP-GlcNAc-2-Epimerase-Assay 1: 100 μl Probe/Wasser werden mit 45 μl 200 mM Natriumphosphatpuffer, pH 7,5, 45 μl 50 mM MgCl2 und 2,5 μl 100 mM UDP-GlcNAc gemischt und in der Regel für 30 min bei 37 °C inkubiert. Die Reaktion wird durch 1-minütige Inkubation bei 100 °C gestoppt. Die denaturierten Proteine aus dem Enzymreaktionsansatz werden durch Zentrifugation bei 20000 x g für 1 min pelletiert. Das entstandene ManNAc wird mittels Morgan-Elson-Test (Reissig et [Seite 58] al., 1955), mit dem spezifisch N-Acetylhexosamine detektiert werden, nachgewiesen. Nach der Zentrifugation werden 150 μl des Überstandes mit 30 μl 0,8 M H2BO3-Puffer, pH 9,1 (mit KOH eingestellt) gemischt und für 3 min bei 100 °C inkubiert. Anschließend werden 800 μl Farbreagenz (1% (w/v) 4-Dimethylaminobenzaldehyd / 1,25% (v/v) 10 M HCl in Essigsäure) zugegeben und für 30 min bei 37 °C inkubiert. Die Extinktion wird bei 578 nm gemessen. Nichtradioaktiver UDP-GlcNAc-2-Epimerase-Assay 2: Für einige zeitabhängige Aktivitätsmessungen wird ein modifizierter UDP-GlcNAc-2-Epimerase-Assay verwendet. In diesem Epimerase-Assay 2 werden unterschiedliche Probenvolumina mit 260 μl 200 mM Tris-HCl, pH 8,1 / 65 mM MgCl2, 10 μl 100 mM UDP-GlcNAc, 40 μl frisch angesetztem 100 mM Phosphoenolpyruvat, 20 μl frisch angesetztem 15 mM NADH und 2 μl Pyruvat-Kinase/Lactat-Dehydrogenase (2 U) in einem Gesamtvolumen von 800 μl gemischt. Die Enzymreaktion wird bei 37 °C im Photometer bei 340 nm verfolgt. Als Kontrolle wird ein Ansatz ohne Enzym gemessen und die ermittelten Werte später von den Werten der Enzymreaktion abgezogen. |
Ein Verweis auf die Quelle fehlt. |
|
Letzte Bearbeitung dieser Seite: durch Benutzer:Schumann, Zeitstempel: 20140831124940