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Hw/Fragment 036 01

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Typus
KomplettPlagiat
Bearbeiter
Hindemith
Gesichtet
Yes.png
Untersuchte Arbeit:
Seite: 36, Zeilen: 1ff (komplett)
Quelle: Blume 2003
Seite(n): 39, 40, Zeilen: 39: 17ff - 40: 1ff
[Gleichzeitig führen die im Puffer enthaltenen Salze] zu einer leichten Modifikation der Nucleinsäure-Struktur, so daß anschließend eine optimale Bindung an die Silicagel-Membran der Säulen möglich ist. Die DNA-Bindung an das Säulenmaterial ermöglicht die Reinigung von unerwünschten Primern und Verunreinigungen, wie Salzen, Enzymen, nicht inkorporierte Nucleotiden, Agarose, Ethidiumbromid, Ölen oder Detergenzien durch den ethanolhaltigen PE-Puffer. Die Elution erfolgt anschließend mit 30 μl Wasser. Die Isolierung von DNA-Fragmenten aus Agarosegelen wird entsprechend den Anweisungen des Herstellers durchgeführt.

6.2.1.7. Ligation von DNA-Fragmenten

Die Verknüpfung von DNA-Fragmenten mit überhängenden oder glatten Enden mittels einer Ligase wird als Ligation bezeichnet. Bei der Standardligation wird durch Bildung von Phosphodiesterbindungen zwischen benachbarten 3'-Hydroxyl- und 5'-Phosphatgruppen linearisierter Vektor mit isolierten DNA-Fragmenten verknüpft, die durch Restriktionsspaltung und anschließende Gelelektrophorese mit Gelelution isoliert worden sind. Für die Ligation werden Vektor und Insert im Verhältnis von mindestens 1:3 eingesetzt. Der Ansatz wird mit 1 μl T4-DNA Ligase (20 U; GibcoBRL, USA) pro 10 μl Ansatz bei RT für 5-15 min inkubiert und anschließend vollständig zur Transformation von Bakterien eingesetzt.

6.2.1.8. Dephosphorylierung von DNA

Linearisierte Vektoren, deren Enden symmetrisch sind, zeigen eine hohe Religationsrate. Um bei Religationen mit DNA-Fragmenten die Selbstligationsrate des Vektors zu verringern, wird vorher das linearisierte Plasmid mit bakterieller alkalischer Phosphatase aus E. coli behandelt. Diese alkalische Phosphatase katalysiert die Abspaltung der 5'-terminalen Phosphatgruppe von DNA, die bei Ligationen als Energielieferant benötigt wird, wodurch die Religationsrate des Vektors stark verringert wird. Die Dephosphorylierung der DNA wird entsprechend den Anweisungen des Herstellers (GibcoBRL, USA) durchgeführt. Die in 100 μl 10 mM Tris-HCl, pH 8,0, gelöste DNA (1 pmol) wird nach der Zugabe von 1 μl bakterieller alkalischer Phosphatase 1 h bei 65 °C inkubiert. Anschließend wird die DNA mit dem „QIAquick PCR Purification Kit“ (Qiagen, Deutschland) gereinigt und in 20 μl Wasser aufgenommen.

Gleichzeitig führen die im Puffer enthaltenen Salze zu einer leichten Modifikation der Nukleinsäure- Struktur, so daß anschließend eine optimale Bindung an die Silicagel-Membran der Säulen möglich ist. Die DNA-Bindung an das Säulenmaterial ermöglicht die Reinigung von unerwünschten Primern und Verunreinigungen, wie Salzen, Enzymen, nicht inkorporierte Nucleotiden, Agarose, Ethidiumbromid, Ölen oder Detergenzien durch den ethanolhaltigen PE-Puffer. Die Elution erfolgt anschließend mit 30 μl Wasser. Die Isolierung von DNA-Fragmenten aus Agarosegelen wird entsprechend den Anweisungen des Herstellers durchgeführt.

2.2.1.8 Ligation von DNA-Fragmenten

Die Verknüpfung von DNA-Fragmenten mit überhängenden oder glatten Enden mittels einer Ligase wird als Ligation bezeichnet. Bei der Standardligation wird durch Bildung von Phosphodiesterbindungen zwischen benachbarten 3'-Hydroxyl- und 5'-Phosphatgruppen linearisierter Vektor mit isolierten DNA-Fragmenten verknüpft, die durch Restriktionsspaltung und anschließende Gelelektrophorese mit Gelelution isoliert worden sind. Für die Ligation werden Vektor und Insert im Verhältnis von mindestens 1:3 eingesetzt. Der Ansatz wird mit 1 μl T4-DNA Ligase (20 U; GibcoBRL, USA) pro 10 μl Ansatz bei RT für 5-15 min inkubiert und anschließend vollständig zur Transformation von Bakterien eingesetzt.

[Seite 40]

2.2.1.9 Dephosphorylierung von DNA

Linearisierte Vektoren, deren Enden symmetrisch sind, zeigen eine hohe Religationsrate. Um bei Religationen mit DNA-Fragmenten die Selbstligationsrate des Vektors zu verringern, wird vorher eine Behandlung des linearisierten Plasmids mit Bakterieller-Alkalischer-Phosphatase aus E. coli durchgeführt. Diese Alkalische Phosphatase katalysiert die Abspaltung der 5'-terminalen Phosphatgruppe von DNA, die bei Ligationen als Energielieferant benötigt wird, wodurch die Religationsrate des Vektors stark verringert wird. Die Dephosphorylierung der DNA wird entsprechend den Anweisungen des Herstellers (GibcoBRL, USA) durchgeführt. Die in 100 μl 10 mM Tris-HCl, pH 8,0 gelöste DNA (1 pmol) wird nach der Zugabe von 1 μl Bakterieller- Alkalischer-Phosphatase 1 h bei 65 °C inkubiert. Anschließend wird die DNA mit dem „QIAquick PCR Purification Kit“ (Qiagen, Deutschland) gereinigt und in 20 μl Wasser aufgenommen.

Anmerkungen

Ein Verweis auf die Quelle fehlt.

Sichter
(Hindemith) Schumann

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