Fandom

VroniPlag Wiki

Hw/Fragment 039 01

< Hw

31.377Seiten in
diesem Wiki
Seite hinzufügen
Diskussion0 Teilen

Störung durch Adblocker erkannt!


Wikia ist eine gebührenfreie Seite, die sich durch Werbung finanziert. Benutzer, die Adblocker einsetzen, haben eine modifizierte Ansicht der Seite.

Wikia ist nicht verfügbar, wenn du weitere Modifikationen in dem Adblocker-Programm gemacht hast. Wenn du sie entfernst, dann wird die Seite ohne Probleme geladen.


Typus
KomplettPlagiat
Bearbeiter
Hindemith
Gesichtet
Yes.png
Untersuchte Arbeit:
Seite: 39, Zeilen: 1ff (komplett)
Quelle: Blume 2003
Seite(n): 42, 44, Zeilen: 42: 9ff; 44: 1ff
[Zur Konstruktion jeder Mutante sind zwei zueinander revers] komplementäre Oligonukleotidprimer erforderlich, die die gewünschte Mutation möglichst mittig tragen. Die Primersequenzen sind unter Materialien/Primer (2.1.6) beschrieben. Als Template-DNA dient der pFASTBACHTA/2epi-Vektor, der ausgehend von den Mutationsprimern von der PfuTurbo-DNA-Polymerase repliziert wird. Die Amplifikationsreaktionen werden in einem Touch-Down-Thermocycler (Hybaid) unter folgenden Bedingungendurchgeführt [sic]:

30 sec 95 °C

16 x (30 sec 95 °C / 1 min 55 °C / 14 min 68 °C)

Anschließend wird die parentale Template-DNA mit der Restriktionsendonuklease Dpn I abgebaut, die spezifisch methylierte und hemimethylierte DNA abbaut (1 h, 37 °C, 10 U). Die amplifizierte DNA mit den Mutationen wird in superkompetente Invα/F' Zellen (Invitrogen, Niederlande) transformiert.

6.2.2. Expression von rekombinantem Protein in S. cerevisiae

Die Überexpression von rekombinantem Protein in der Hefe S. cerevisiae erfolgt nach den Anweisungen des Herstellers des Expressionsvektors pYES2 (Invitrogen, Niederlande). Sämtliche Expressionsexperimente werden mit dem Hefestamm INVSc1 (Invitrogen, Niederlande) durchgeführt.

6.2.2.1. Herstellung kompetenter S. cerevisiae-Hefezellen

Für die Aufnahme von Fremd-DNA durch die Hefezellen werden zunächst kompetente Zellen hergestellt. Dafür werden 5 ml Vollmedium mit einer Einzelkolonie von INVSc1 angeimpft und bei 30 °C bis zur Sättigung kultiviert. 4 ml dieser Vorkultur werden in 100 ml Vollmedium übergeimpft und bis zu einer OD600 von etwa 1 angezogen. Die Zellen werden durch Zentrifugation (3000 x g, 5 min, 4 °C) sedimentiert und mit 20 ml 1 M Sorbitol / 10 mM Tricin-NaOH, pH 8,4 / 3% (v/v) Ethylenglycol gewaschen. Die sedimentierten Zellen werden in 4 ml 1 M Sorbitol / 10 mM Tricin-NaOH, pH 8,4 / 3% (v/v) Ethylenglycol resuspendiert und mit 100 μl zerschallter Heringssperma-DNA (10 mg/ml, zerschallt auf eine mittlere Fragmentgröße von 7 kb) sowie mit 100 μl einer sterilfiltrierten 1 M Histamin-Lösung versetzt. Aliquots von 200 μl werden bei -70 °C für mindestens 2 h eingefroren.

Zur Konstruktion jeder Mutante sind zwei zueinander revers komplementäre Oligonukleotidprimer erforderlich, die die gewünschte Mutation möglichst mittig tragen. Die Primersequenzen sind unter Materialien/Primer (2.1.6) beschrieben. Als Template-DNA dient der pFASTBACHTA/2epi-Vektor, der ausgehend von den Mutationsprimern von der PfuTurbo-DNA-Polymerase repliziert wird. Die Amplifikationsreaktionen werden in einem Touch-Down-Thermocycler (Hybaid) unter folgenden Bedingungen durchgeführt:

30 sec 95 °C

16 x (30 sec 95 °C / 1 min 55 °C / 14 min 68 °C)

Anschließend wird die parentale Template-DNA mit der Restriktionsendonuklease Dpn I abgebaut, die spezifisch methylierte und hemimethylierte DNA abbaut (1 h, 37 °C, 10 U). Die amplifizierte DNA mit den Mutationen wird in superkompetente InvαF' Zellen (Invitrogen, Niederlande) transformiert.

[Seite 44]

2.2.3 Expression von rekombinantem Protein in Saccharomyces cerevisiae

Die Überexpression von rekombinantem Protein in der Hefe S. cerevisiae erfolgt nach den Anweisungen des Herstellers des Expressionsvektors pYES2 (Invitrogen, Niederlande). Sämtliche Expressionsexperimente werden mit dem Hefestamm INVSc1 (Invitrogen, Niederlande) durchgeführt.

2.2.3.1 Herstellung kompetenter Saccharomyces cerevisiae-Hefezellen

Für die Aufnahme von Fremd-DNA durch die Hefezellen werden zunächst kompetente Zellen hergestellt, d.h. Zellen, die fähig sind, freie, zirkuläre DNA aufzunehmen. Dafür werden 5 ml Vollmedium mit einer Einzelkolonie von INVSc1 angeimpft und bei 30 °C bis zur Sättigung kultiviert. 4 ml dieser Vorkultur werden in 100 ml Vollmedium übergeimpft und bis zu einer OD600 von etwa 1 angezogen. Die Zellen werden durch Zentrifugation (3000 x g, 5 min, 4 °C) sedimentiert und mit 20 ml 1 M Sorbitol / 10 mM Tricine-NaOH, pH 8,4 / 3% (v/v) Ethylenglycol gewaschen. Die sedimentierten Zellen werden in 4 ml 1 M Sorbitol / 10 mM Tricine-NaOH, pH 8,4 / 3% (v/v) Ethylenglycol resuspendiert und mit 100 μl zerschallter Heringssperma-DNA (10 mg/ml, zerschallt auf eine mittlere Fragmentgröße von 7 kb) sowie mit 100 μl einer sterilfiltrierten 1 M Histamin-Lösung versetzt. Aliquots von 200 μl werden bei -70 °C für mindestens 2 h eingefroren.

Anmerkungen

Ein Verweis auf die Quelle fehlt.

Sichter
(Hindemith) Schumann

Auch bei Fandom

Zufälliges Wiki