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Imb/Fragment 025 07

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Typus
Verschleierung
Bearbeiter
Graf Isolan
Gesichtet
No.png
Untersuchte Arbeit:
Seite: 25, Zeilen: 7-24
Quelle: NDiaye 2005
Seite(n): 24, Zeilen: 1-19
3.1.1.2 Isolierung, Reinigung und Quantifizierung von Nukleinsäuren

Im folgenden wird die gewählte Vorgehensweise beschrieben; die Zusammensetzung der verwendeten Lösungen und Puffer zur Reinigung und Quantifizierung der DNA sind im Anhang (9.2.2) aufgeführt

3.1.1.3 Präparation chromosomaler DNA von A. pleuropneumoniae

1. PPLO-Platte beimpfen und übernacht bebrüten, Koloniematerial in 2,5 ml TEPuffer resuspendieren.

2. 50 μl EDTA (0,5 M; Endkonzentration 10 mM), 250 μl SDS (10 %; Endkonzentration 1%l) und 64 μl Proteinase K (20 mg/ml; Endkonzentration 500 μg/ml) wurden hinzugegeben, gemischt und 1 Stunde bei 55°C im Wasserbad inkubiert.

3. 25-50μl RNAse (10mg/ml; 100 μg/ml Endkonzentration) vor Gebrauch 10 min bei 100°C kochen, dann auf Eis stellen; Reaktion für 30 min bei 37°C

4. Phenol (250 μl) äqulibriert mit TE-Puffer wurde hinzugefügt, gemischt (vortexen) und bei -70°C über Nacht eingefroren.

5. Das Gemisch wurde bei 55°C aufgetaut und Chloroform:Isoamylalkahol (24:1)– Gemisch (500 μl) wurde anschließend zur Trennung der Phasen dazugegeben.

6. Der Ansatz wurde bei 10.000 rpm (SA600-Rotor), bei 4°C für 5 min zentrifugiert, der Überstand wurde mit einer Plastik-Pasteurpipette entnommen und in ein neues Polypropylen-Röhrchen pipettiert.

7. Die Phenol/Chloroform Extraktion mit 500 μl (ca. 1/5 des Volumens) Chloroform:Isoamyl (24/1)-Gemisch wurde wiederholt und bei 10.000 rpm, 4°C 10 min zentrifugiert. Der Überstand wurde in ein neues Plastikröhrchen überführt.

3.3 Isolierung, Reinigung und Quantifizierung von DNA

Puffer und Lösungen zur Reinigung und Quantifizierung der DNA sind im Anhang aufgeführt (Kapitel 9.3)

3.3.1 Präparation chromosomaler DNA von A. pleuropneumoniae

1. Bakterien von einer gut bewachsenen Platte wurden in 2,5 ml TE-Puffer resuspendiert.

2. EDTA (10 mM, 25 μl), SDS (1%, 125 μl) und Proteinase K (500 μg/ml, 32 μl) wurden zugegeben, gemischt und bei 55°C im Wasserbad inkubiert.

3. RNAse (100 μg/ml, 19 μl) wurde zugegeben und 30 min im Wasserbad 37°C inkubiert.

4. Phenol (250 μl) in TE-Puffer wurde hinzugefügt, gemischt und bei -70°C über Nacht eingefroren.

5. Das Gemisch wurde vorsichtig bei 55°C aufgetaut und Chloroform:Isoamylalkahol (24:1)–Gemisch (500 μl) wurde anschließend zur Trennung der Phasen dazugegeben.

6. Der Ansatz wurde bei 10.000 rpm (SA600-Rotor), bei 4°C für 5 min zentrifugiert, der Überstand wurde mit einer Plastik-Pasteurpipette entnommen und in ein neues Polypropylen-Röhrchen pipettiert.

7. Die Phenol/Chloroform Extraktion mit 500 μl (ca. 1/5 des Volumens) Chloroform:Isoamyl (24/1)-Gemisch wurde wiederholt und bei 10.000 rpm, 4°C 10 min zentrifugiert. Der Überstand wurde in ein neues Plastikröhrchen überführt.

Anmerkungen

Ohne Hinweis auf eine Übernahme.

Sichter
(Graf Isolan)

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