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Imb/Fragment 026 01

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Typus
KomplettPlagiat
Bearbeiter
Graf Isolan
Gesichtet
Yes.png
Untersuchte Arbeit:
Seite: 26, Zeilen: 1 ff. (komplett)
Quelle: NDiaye 2005
Seite(n): 24; 27, Zeilen: 24:20-27; 27:1 ff.
8. Die DNA wurde mit 3M Na-Acetat pH 5,2 (250 μl, ca. 1/10 des Volumens) und

Isopropanol (2,5 ml, ca. 1 Volumen) ausgefällt.

9. DNA-Fasern wurden mittels einer Pipettenspitze aufgewickelt, in 70% Ethanol für 5 min gewaschen und luftgetrocknet.

10. Die DNA wurde in 200 μl A. bidest. resuspendiert.

11. Die DNA wurde anschließend im Kühlschrank über Nacht aufbewahrt.

12. Die DNA wurde durch Elektrophorese von 1 μl der Präparation auf einem Agarosegel quantifiziert.

3.1.1.4 Alkalilysis-Verfahren zur Präparation von Plasmid DNA

Drei ml Übernachtkultur (Schüttler) wurden abzentrifugiert.

1. Das Pellet wurde in 300 μl Tris-EDTA ( 50 mM Tris-HCl [pH 8,0]; 10 mM EDTA, 1 mg/ml RNAse) resuspendiert.

2. Dreihundert μl NaOH-SDS-Lösung (0,2 M NaOH, 1% [w/v] SDS) wurden hinzugegeben und bis zur Lyse der Bakterien bei Raumtemperatur (längstens 3 min) inkubiert.

3. Dreihundert μl 3,2 M K-Acetat-Puffer (pH 5,5) wurden zugegeben, die Suspension wurde gründlich gemischt und für 10 min bei 13.000 rpm zentrifugiert.

4. Der Überstand wurde in ein neues Reaktionsgefäß überführt.

5. Die Präzipitation erfolgte durch Zugabe von 600 μl eiskaltem Isopropanol bei Raumtemperatur.

6. Nach 10 min Zentrifugation bei 13.000 rpm wurde das Pellet getrocknet.

7. Das Pellet wurde in 25 μl A. dest. resuspendiert.

3.1.1.5 DNA-Aufreinigung mit “Nucleospin-Extract”

1. Das DNA Fragment wurde unter UV-Licht (280 nm) aus einem TAE-Agarosegel ausgeschnitten und gewogen.

2. 200 μl NT1-Puffer/100 mg Gel wurden zugegeben und im Wasserbad bei 55°C

für 5 bis10 min bis zum vollständigen Lösen des Gels inkubiert.

3. Das aufgelöste Gel wurde auf ein Nucleospin-Säulchen geladen, bei 10.000 rpm für 1 min zentrifugiert und die Flüssigkeit verworfen.

4. 600 μl Waschpuffer wurden zugegeben und bei 13.000 rpm für 1 min zentrifugiert und das Eluat verworfen.

[Seite 24]

8. Die DNA wurde mit 3M Na-Acetat pH 5,2 (250 μl, ca. 1/10 des Volumens) und Isopropanol (2,5 ml, ca. 1 Volumen) ausgefällt.

9. DNA-Fasern wurden mittels einer Pipettenspitze aufgewickelt, in 70% Ethanol für 5 min gewaschen und luftgetrocknet.

10. Die DNA wurde in 200 μl A. bidest. resuspendiert.

11. Die DNA wurde anschließend im Kühlschrank über Nacht aufbewahrt.

12. Die DNA wurde durch Elektrophorese von 1 μl der Präparation auf einem Agarosegel quantifiziert.

[Seite 27]

3.3.2 Alkalilysis-Verfahren zur Präparation von Plasmid DNA

Drei ml Übernachtkultur (Schüttler) wurden abzentrifugiert.

1. Das Pellet wurde in 300 μl Tris-EDTA ( 50 mM Tris-HCl [pH 8,0]; 10 mM EDTA, 1 mg/ml RNAse) resuspendiert.

2. Dreihundert μl NaOH-SDS-Lösung (0,2 M NaOH, 1% [w/v] SDS) wurden hinzugegeben und bis zur Lyse der Bakterien bei Raumtemperatur (längstens 3 min) inkubiert.

3. Dreihundert μl 3,2 M K-Acetat-Puffer (pH 5,5) wurden zugegeben, die Suspension wurde gründlich gemischt und für 10 min bei 13.000 rpm zentrifugiert.

4. Der Überstand wurde in ein neues Reaktionsgefäß überführt.

5. Die Präzipitation erfolgte durch Zugabe von 600 μl eiskaltem Isopropanol bei Raumtemperatur.

6. Nach 10 min Zentrifugation bei 13.000 rpm wurde das Pellet getrocknet.

7. Das Pellet wurde in 25 μl A. dest. resuspendiert.

3.3.3 DNA-Aufreinigung mit “Nucleospin-Extract” (Macherey-NAGEL GmbH&CO. Düren Deutschland)

1. Das DNA Fragment wurde unter UV-Licht (280 nm) aus einem TAE-Agarosegel ausgeschnitten und gewogen.

2. Dreihundert μl NT1-Puffer/100 mg Gel wurden zugegeben und im Wasserbad bei 50°C bis zum vollständigen Lösen des Gels inkubiert.

3. Das aufgelöste Gel wurde auf ein Nucleospin-Säulchen geladen bei 10.000 rpm für 1 min zentrifugiert und die Flüssigkeit verworfen.

4. Fünfhundert μl NT2-Puffer wurden zugegeben und bei 13.000 rpm für 1 min zentrifugiert und das Eluat verworfen.

5. Sechshundert μl NT3-Puffer wurden zugegeben, bei 13.000 rpm für 1 min zentrifugiert und das Eluat verworfen.

6. Zweihundert μl NT3-Puffer wurden zugegeben und bei 13.000 rpm für 5 min zentrifugiert und das Eluat verworfen.

Anmerkungen

Reines C&P mit leichter Anpassung zum Abschluss - keine fünf Minuten Arbeitsaufwand.

Ohne jeden Hinweis auf eine Übernahme.

Sichter
(Graf Isolan) Schumann

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