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Imb/Fragment 027 03

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Typus
Verschleierung
Bearbeiter
Graf Isolan
Gesichtet
No.png
Untersuchte Arbeit:
Seite: 27, Zeilen: 3-29
Quelle: NDiaye 2005
Seite(n): 27, 29-30, Zeilen: 27:29-31; 29:27-30-30:1-18
5. Das Säulchen wurde erneut für 5 Minuten zentrifugiert und das Eluat verworfen; anschließend wurde es offen für etwa 10 Minuten stehen gelassen.

7. Die Kartusche wurde in ein neues ERG überführt, 25-50 μl A. bidest. wurden hinzugegeben und die an die Matrix gebundene DNA wurde durch Zentrifugieren bei 11.000 rpm für 1 min eluiert.

3.1.2 Plasmidkonstruktion

3.1.2.1 PCR für 2.1-TOPO-Cloning

1. Zu 2 μl des PCR Produktes wurden 1 μl Salzlösung, 1 μl steriles A. dest und 1 μl Vektor 2.1- TOPO hinzugefügt und bei Raumtemperatur für 10 min inkubiert.

2. Fünfzig μl kompetente E. coli-Zellen wurden in ein Reaktionsgefäß pipettiert, die oben inkubierte Lösung wurde hinzugegeben und auf Eis für 10 min stehen gelassen.

3. Das Gemisch wurde anschließend im Thermoblock bei 42°C für 20 sek. inkubiert und anschließend auf Eis gestellt.

4. Zweihundertfünfzig μl SOC-Medium (Zusammensetzung im Anhang, Kapitel 8.2) wurden nach dem Hitzeschock dazupipettiert und dann wurden die Zellen für 1 Stunde bei 37°C geschüttelt.

5. Auf LB-Platten mit Ampicillinzusatz (100 mg/ml) wurden 25 μl X-Gal Lösung (25 mg/ml [*]verdünnung [sic] mit 125 μl A. dest) ausplattiert.

6. Die Bakterien wurden auf Platten (Platte 1: 200 μl, Platte 2: 100 μl) fraktioniert ausplattiert und im Brutschrank bei 37°C über Nacht inkubiert.

7. Am nächsten Tag wurden die Platten überprüft und an weiβen Kolonien wurde eine PCR zum Nachweis des Inserts durchgeführt. Die Zusammensetzung der angewendeten Puffer ist im Anhang aufgeführt (Kapitel 8.4).

3.1.2.2 Restriktionsenzymverdaus

Die Restriktionsenzymverdaus wurden in 25 μl Ansätzen (0,5 bis 1 μg DNA pro Ansatz) durchgeführt. Die DNA wurde mit A. dest., den jeweiligen Restriktionsendonukleasen, 10 × Carlos Puffer (Anhang; Kapitel 8.4) und 10 x DTT-[Lösung (10 mM) gemischt und bei 37°C für 2 Stunden inkubiert.]

[Seite 27]

7. Das Säulchen wurde in neues Reagenzgefäss überführt, 25-50 μl A. bidest. wurden hinzugegeben und 2 min bei Raumtemperatur inkubiert. Die aufgereinigte DNA wurde durch Zentrifugieren bei 11.000 rpm für 1 min eluiert.

[Seite 29]

3.4 Plasmidkonstruktion

3.4.1 PCR® 2.1-TOPO-Cloning

1. Zu 2 μl des PCR® 2.1-TOPO -Produkts wurden 1 μl Salzlösung, 1 μl steriles A. dest und 1 μl Vektor 2.1- TOPO hinzugefügt und bei Raumtemperatur für 10 min inkubiert.

[Seite 30]

2. Fünfzig μl kompetenter E. coli wurden in ein Reaktionsgefäß pipettiert, die oben inkubierte Lösung wurde hinzugegeben und auf Eis für 10 min stehen gelassen.

3. Das Gemisch wurde anschließend im Thermoblock bei 42°C für 20 sek. Inkubiert und anschlissend [sic] auf Eis gestellt.

4. Zweihundertfünfzig μl SOC-Medium (Zusammensetzung im Anhang, Chapitel 8.2) wurden nach dem Hitzeschock dazu pipettiert und dann wurden die Zellen für 1 Stunde bei 37°C geschüttelt.

5. Auf LB-Platten mit Ampicillinzusatz wurden 25 μl X-Gal Lösung (25 mg/l,Verdünnung: 25 μl X-Gal Stammlösung + 125 μl A. dest) ausplattiert.

6. Die Bakterien wurden auf Platten (Platte 1: 200 μl, Platte 2: 100 μl) ausplattiert und im Brutschrank bei 37°C über Nacht inkubiert.

7. Am nächsten Tag wurden die Platten überprüft und an weiβen Kolonien wurde eine PCR zum Nachweis des Inserts durchgeführt.

3.4.2 Restriktionsenzymverdau

Die Zusammensetzung der angewendeten Puffer sind im Anhang aufgeführt (Chapitel [sic] 8.4). Die Restriktionsenzymverdaus wurden in 25 μl Ansätzen (0,5 bis 1 μg DNA) durchgeführt. Die DNA wurde mit A. dest., den jeweiligen Restriktionsendonukleasen, 10 × Carlos Puffer und DTT-Puffer (10 mM) und BSA (1 mg/ml) gemischt und bei 37°C für 2 Stunden inkubiert.

Anmerkungen

Ohne Hinweis auf eine Übernahme.

In der ersten Aufzählung fehlt der 6. Unterpunkt. An der durch [*] gekennzeichneten Stelle steht im Original eine "einsame" geöffnete eckige Klammer.

Imb enthält - übrigens genau wie die hier benutzte Quelle N’diaye (2005) - kein "Kapitel 8.4"; der Anhang trägt bei beiden Autoren die Nr. 9. Abschnitt 8 ist jeweils das Literaturverzeichnis.

Sichter
(Graf Isolan)

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