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Jis/Fragment 034 19

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Typus
KeineWertung
Bearbeiter
Hood
Gesichtet
No.png
Untersuchte Arbeit:
Seite: 34, Zeilen: 19-31
Quelle: Gerull 2002
Seite(n): 35-36, Zeilen: S. 35: 17ff.; S. 36: 1ff.
3.12.3 Präparation von RNA

Die vollständige RNA-Isolierung aus Kulturzellen erfolgte mittels der TRIzol-Methode (Gibco) modifiziert nach Chomczynski und Sacchi (Chomczynski & Sacchi, 1987). Das zu untersuchende Gewebe wurde mit TRIzol-Reagenz im Verhältnis 100 mg Gewebe/ml TRIzol mit einem Ultraturrax (Ika-Werk, Janke & Kunkel, Staufen) bei max. 200 rpm auf Eis homogenisiert und nach Zugabe von 0,2 ml Chloroform / ml TRIzolTM mit 12000 x g bei RT 5 min zentrifugiert. Man erhält auf diese Art drei Phasen: Eine obere wäßrige Phase mit Gesamt-RNA, eine mittlere weißliche Phase, die Proteine enthält und eine untere rötliche Phase mit der genomischen DNA. Der farblose Überstand wurde nochmals mit Chloroform extrahiert und, wie oben erwähnt, zentrifugiert. Anschließend wurde die obere wäßrige Phase erneut abgenommen, mit 0,5 ml Isopropanol / ml TRIzol versetzt und 30 min auf Eis stehengelassen. Es folgte die Zentrifugation der gefällten RNA mit 12000 x g bei 4°C, 15 min und die [anschließende Aufnahme in 50 μl autoklaviertem Millipore-Wasser (mit 30 Einheiten RNasin, Perkin Elmer, Langen).]

2.6.5. RNA-Isolierung mit TRIzol und Reinigung der Gesamt RNA-Präparation von genomischer DNA

Die Total-RNA-Isolierung aus Kulturzellen und aus den Geweben erfolgte mittels der TRIzol-Methode (Gibco) modifiziert nach Chomczynski und Sacchi (1987). Das zu untersuchende Gewebe wurde mit TRIzol-Reagenz im Verhältnis 100 mg Gewebe/ml TRIzol mit einem Micropistill homogenisiert und nach Zugabe von 0,2 ml Chloroform/ml TRIzolTM mit 12000 rpm bei RT 5 min zentrifugiert. Man erhält auf diese Art drei Phasen: Eine obere wässrige Phase mit Total-RNA, eine mittlere weissliche Phase, die Proteine enthält und eine untere rötliche Phase mit der genomischen DNA. Zur Eliminierung genomischer DNA-Verunreinigungen wurde der farblose Überstand mit RNase-freier DNase I nach folgendem Schema behandelt:

[...]

Der Reaktionsansatz wurde 30 min bei 37 °C inkubiert und durch Zugabe von 50 μl Phenol/Chloroform beendet. Der Ansatz wurde stark geschüttelt und 2 min mit 12000 rpm bei 4 °C abzentrifugiert. Die obere wässrige Phase wurde abgenommen und mit 0,5 ml 100% Ethanol/ml TRIzol und bei –20 °C 2 h gefällt. Es folgte die Zentrifugation der gefällten RNA mit 12000 x g bei 4 °C, 30 min. Das Pellet wurde mit 70% EtOH gewaschen, kurz luftgetrocknet und in autoklaviertem Wasser mit 0,5 μl RNase-Inhibitor (20 Einheiten) aufgenommen und bei –20 °C aufbewahrt.

Anmerkungen

Viele Gemeinsamkeiten in den Formulierungen, jedoch "Kochrezeptcharakter".

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