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Jis/Fragment 043 01

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Typus
KeineWertung
Bearbeiter
Hood
Gesichtet
No.png
Untersuchte Arbeit:
Seite: 43, Zeilen: 1-16
Quelle: Groß 1999
Seite(n): 0 (Internetdokument ohne Seitenzahlen), Zeilen: 0
Mutationen wurden über PCR-vermittelte Mutagenese eingeführt (Klug et al., 1991; Good & Nazar, 1992). Für jede Mutante wurden jeweils vier Oligonukleotide benötigt. Zwei Oligonukleotide bestimmten das 5´- (A) und das 3´- Ende (B) des mutierten Fragments, und durch zwei überlappende Oligonukleotide (Am, Bm) wurde die jeweilige Veränderung der DNA-Sequenz eingeführt (Abb. 3-4). Das 5´-Oligonukleotid führte eine EcoR V- Schnittstelle, das 3´- Oligonukleotid eine BamH I - Schnittstelle in das PCR-amplifizierte Fragment ein. Für die erste PCR wurden die Oligonukleotide A, B, Am, und Bm so gewählt, daß der hybridisierende 3´-Bereich eine Tm (Schmelztemperatur) von ca. 60°C aufwies. Gleichzeitig wurden die Oligonukleotide Am und Bm so gewählt, daß die entstehende Überlappung in der zweiten PCR ebenfalls eine Tm von ca. 60°C aufwies. Die Produkte der ersten PCR wurden durch Agarose-Gelelektrophorese gereinigt, das Produkt der zweiten PCR über eine QIAquick Spin Column (Qiagen, Hilden). Alle PCRs wurden in einem PTC-200 DNA Engine thermal cycler (Biozym Diagnostik, Hess. Oldendorf) mit PfuTurbo™ Polymerase für 30 Zyklen, 30 sec bei 94°C, 40 sec bei 58°C und 30 sec [bei 72°C und zum Ende 7 min bei 72°C durchgeführt. Die so generierten DNA-Fragmente wurden dann zur Klonierung der Reporter-Konstrukte eingesetzt.]

[Aus Literaturverzeichnis:]

Klug J, Wolf M, Beato M. 1991. Creating chimeric molecules by PCR directed homologous DNA recombination. Nucleic Acids Res 19:2793.

Good L, Nazar RN. 1992. An improved thermal cycle for two-step PCR-based targeted mutagenesis. Nucleic Acids Res 20:4934.

Deletionen, Insertionen bzw. Mutationen wurden über PCR-vermittelte Mutagenese eingeführt (Good and Nazar, 1992). Für jede Mutante wurden jeweils vier Oligonukleotide benötigt. Zwei Oligonukleotide bestimmten das 5´- (A) und das 3´-Ende (B) des mutierten Fragments, und durch zwei überlappende Oligonukleotide (a, b) wurde die jeweilige Veränderung der DNS-Sequenz eingeführt (Abb.7). Das 5´-Oligonukleotid führte eine BamH I-Schnittstelle, das 3´-Oligonukleotid eine Hind III-Schnittstelle in das PCR-amplifizierte Fragment ein. Die insertierten bzw. mutierten DNS-Sequenzen wurden, wenn möglich, so gewählt, daß dadurch eine neue Restriktionsenzym-Erkenungsstelle entstand. Für die erste PCR wurden die Oligonukleotide A, B, a, und b so gewählt, daß der hybridisierende 3´-Bereich eine Tm (Schmelztemperatur) von 60°C aufwies. Gleichzeitig wurden die Oligonukleotide a und b so gewählt, daß die entstehende Überlappung in der zweiten PCR ebenfalls eine Tm von 60°C aufwies. Die Amplifikation wurde meist mit 25 Zyklen durchgeführt. Die Produkte der ersten PCR wurden durch Agarose-Gelelektrophorese gereinigt (3.66 u. 3.6.7), das Produkt der zweiten PCR über eine QIAquick Spin Column (Fa. Qiagen,Hilden). Die PCRs wurden in einem Peltier Thermal Cycler (Fa. Biozym Diagnostik, Hess. Oldendorf) durchgeführt. Die so generierten DNS-Fragmente wurden dann zur Klonierung der Reporter-Konstrukte eingesetzt.

[Aus Literaturverzeichnis:]

Good, L. and Nazar, R. (1992). An improved thermal cycle for two step PCR-based targeted mutagenesis. Nucl. Acids Res. 20, 4934.

Anmerkungen

Gemeinsamkeiten in den Formulierungen ohne Hinweis auf die Quelle, jedoch "Kochrezeptcharakter".

Vorangehend findet sich in beiden Schriften eine ähnliche, jedoch nicht identische Abbildung zur PCR-vermittelten Mutagenese. Auf die Literaturreferenz "Klug et al., 1991" wird in der mutmaßlichen Vorlage nicht verwiesen.

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