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Jis/Fragment 046 07

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Typus
KeineWertung
Bearbeiter
Hood
Gesichtet
No.png
Untersuchte Arbeit:
Seite: 46, Zeilen: 7-26
Quelle: Groß 1999
Seite(n): 0 (Internetquelle ohne Seitenangaben), Zeilen: 0
3.12.12.2 Bestimmung der Luciferase-Aktivität

Zur Messung der Luciferase-Aktivität wurden die Zellen dreimal mit 1×PBS gewaschen und durch Zugabe von 350μl Lysispuffer lysiert. Das Lysat wurde in 1,5ml-Reaktionsgefäße (Eppendorf, Hamburg), die auf Eis gestellt wurden, überführt (nach diesem Schritt ist eine Lagerung über Nacht bei -80°C möglich) und anschließend 5min bei 13.000UpM und 4°C abzentrifugiert. Für jede Luciferinreaktion wurden 100μl des Überstandes zu 360μl Luziferase-Reaktionspuffer in Polystyrolröhrchen (Greiner, Nürtingen) pipettiert. Die Messung erfolgte im Luminometer Typ AutoLumat LB 953 (Berthold, Wildbad), in dem automatisch vor jeder Messung 100μl Luziferinlösung zur Probe injiziert wurden. Dabei wurde das Integral der Lumineszenz über ein Intervall von 10ms gemessen.

Lysispuffer: 25mM Glyzylglyzin (Sigma, Deisenhofen) pH 7.8 (mit 4M KOH eingestellt), bei –20°C / 4°C lagern, 1% (v/v) Triton X-100, 15mM MgSO4, 4mM EGTA, pH 8.0, bei 4°C lagern, 1mM DTT (kurz vor Gebrauch zugeben)

Luciferase-Reaktionspuffer: 25mM Glyzylglyzin, pH 7.8, 15mM K2HPO4 / KH2PO4, pH7.8, 15mM MgSO4, 4mM EGTA, pH8.0, 2mM ATP, bei 4°C lagern, 1mM DTT (kurz vor Gebrauch zugeben)

Luziferin-Meßlösung: 0.2mM D-Luciferin (kristallin, Sigma, Deisenhofen), Stocklösung: 1mM D-Luziferin, 25mM Glyzylglyzin, 10mM DTT, bei –80°C lagern, 25mM Glyzylglyzin, pH7.8, 1mM DTT, sofort verwenden und vor Licht schützen.

3.4.6.2 Luziferase Assay

Zur Messung der Luziferase-Aktivität wurden die Zellen einmal mit 1XPBS gewaschen und durch Zugabe von 250µl/3cm-Zellkulturschale (Fa. Nunc, Wiesbaden) Lysispuffer lysiert. Das Lysat wurde in 1,5ml- Reaktionsgefäße (Fa. Eppendorf, Hamburg), die auf Eis gestellt wurden, überführt (nach diesem Schritt ist eine Lagerung über Nacht bei -80°C möglich) und anschließend 5min bei 13.000UpM und 4°C abzentrifugiert. Für jede Luziferinreaktion wurden 100µl des Überstandes zu 360µl Luziferase-Reaktionspuffer in Polystyrolröhrchen (Fa. Greiner, Nürtlingen) pipettiert. Die Messung erfolgte im Luminometer Typ AutoLumat LB 953 (Fa. Berthold, Wildbad), in dem automatisch vor jeder Messung 100µl Luziferinlösung zur Probe injiziert wurden. Dabei wurde das Integral der Lumineszenz über ein Intervall von 10ms gemessen.


Lysispuffer: 25mM Glyzylglyzin (Fa. Sigma, Deisenhofen)

pH 7,8 (mit 4M KOH eingestellt), bei –20°C/4°C lagern

1% (v/v) Triton X-100

15mM MgSO4

4mM EGTA, pH 8,0,bei 4°C lagern

1mM DTT (kurz vor Gebrauch zugeben)


Luziferase-Reaktionspuffer: 25mM Glyzylglyzin, pH 7,8

15mM K2HPO4/KH2PO4, pH 7,8

15mM MgSO4

4mM EGTA, pH 8,0

2mM ATP,

bei 4°C lagern

1mM DTT (kurz vor Gebrauch zugeben)


Luziferin-Meßlösung: 0,2mM D-Luziferin (kristallin, Fa. Sigma, Deisenhofen), Stocklösung: 1mM D-Luziferin, 25mM Glyzylglyzin, 10mM DTT,

bei –80°C lagern

25mM Glyzylglyzin, pH 7,8

1mM DTT

sofort verwenden und vor Licht schützen

Anmerkungen

Gemeinsame Formulierungen ohne Hinweis auf die (mutmaßliche) Quelle, jedoch "Kochrezeptcharakter".

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