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1 gesichtetes, geschütztes Fragment: Plagiat

[1.] Jis/Fragment 042 01 - Diskussion
Bearbeitet: 24. December 2014, 12:23 Singulus
Erstellt: 24. November 2014, 09:58 (Plagin Hood)
Brand 2002, Fragment, Gesichtet, Jis, KomplettPlagiat, SMWFragment, Schutzlevel sysop

Typus
KomplettPlagiat
Bearbeiter
Hood
Gesichtet
Yes.png
Untersuchte Arbeit:
Seite: 42, Zeilen: 1-30
Quelle: Brand 2002
Seite(n): 37-38, Zeilen: S. 37: 13-26; S. 38: 1-14
[Für die] Ligation sollten Vektor und Fragment mindestens äquimolar eingesetzt werden, besser sollte jedoch das zu klonierende Fragment im Überschuß zu der Reaktion gegeben werden. In den meisten Ligationen wurde dabei ein Verhältnis von 1:2 oder 1:3 von Vektor zu Insert verwendet.

In den Ligationsansatz wurde zu 50-100 ng dephosphoryliertem Vektor ein zwei - bis dreifach molarer Überschuß an zu klonierender Insert-DNA gegeben. Der Ansatz enthielt außerdem noch 0,1 VT 10x Ligationspuffer, sowie 1 Unit T4-Ligase. Das Reaktionsvolumen betrug 20 μl. Die Ligation erfolgte über Nacht bei 16°C im Kryobad. Im Anschluß daran konnte eine Transformation von kompetenten Zellen mit dem Ligationsansatz vorgenommen werden. Wurde er nicht sofort weiterverwendet, konnte er bei –20 °C eingefroren werden.

3.12.10.3 Ligation und Klonierung von PCR-Fragmenten mit Hilfe des „TOPO TA Cloning Kits“

Der "TOPO TA Cloning Kit" bietet eine spezielle Möglichkeit, um PCR-Fragmente ohne Blunt-Reaktion, Dephosphorylieren des Vektors oder DNA-Aufreinigung über ein Gel in den PCR-Script Vektor zu klonieren. Der Reagenziensatz zeichnet sich durch eine hohe Klonierungseffizienz aus.

Bei dieser Methode wird das PCR-Fragment direkt in die Ligation mit dem Vektor gegeben. Dieser ist schon geschnitten und wird durch eine Topoisomerase an der Religation gehindert. Bei der Ligation löst sich die Topoisomerase innerhalb weniger Minuten und das Fragment ligiert mit dem Vektor.

Die einzigen Voraussetzungen für diese Art der Klonierung sind eine hohe DNA -Konzentration und PCR - Fragmente mit überhängenden Enden.

PCR-Fragmente, die mit Taq-Polymerase erstellt wurden, tragen ein zusätzliches Adenosinnukleotid, das die Polymerase an die generierten PCR-Enden anhängt. Bei Pfu-Polymerase geschieht dies nicht. Diese Polymerase beendet ihre Aktivität immer ohne Überhänge. In diesem Versuch können entweder Pfu-generierte Fragmente verwendet werden, oder PCR - Fragmente, die mit Pfu - Polymerase poliert wurden. Dabei wird das überhängende A entfernt und die Fragmente liegen ebenfalls „blunt-end“ vor.

[Seite 37, Zeile 13-26]

Für die Ligation sollten Vektor und Fragment mindestens äquimolar eingesetzt werden, besser sollte jedoch das zu klonierende Fragment im Überschuß zu der Reaktion gegeben werden. In den meisten Ligationen wurde dabei ein Verhältnis von 1:2 oder 1:3 von Vektor zu Insert verwendet.

In den Ligationsansatz wurde zu 50-100 ng dephosphoriliertem Vektor ein zwei- bis dreifach molarer Überschuß an zu klonierender Insert-DNA gegeben. Der Ansatz enthielt außerdem noch 0,1 VT 10x Ligationspuffer, sowie 1 Unit T4-Ligase. Das Reaktionsvolumen betrug 20 μl. Die Ligation erfolgte über Nacht bei 16 °C im Kryobad. Im Anschluß daran konnte eine Transformation von kompetenten Zellen mit dem Ligationsansatz vorgenommen werden. Wurde er nicht sofort weiterverwendet, konnte er bei –20 °C eingefroren werden.

3.20.3. Ligation und Klonierung von PCR-Fragmenten mit Hilfe des „TOPO TA Cloning Kits“

Der "TOPO TA Cloning Kit" bietet eine spezielle Möglichkeit, um PCR-Fragmente ohne Blunt-Reaktion, Dephosphorylieren des Vektors oder DNA-Aufreinigung über ein Gel in den PCR-

[Seite 38, Zeile 1-14]

Script Vektor zu klonieren. Der Reagenziensatz zeichnet sich durch eine hohe Klonierungseffizienz aus.

Bei dieser Methode wird das PCR-Fragment direkt in die Ligation mit dem Vektor gegeben. Dieser ist schon geschnitten und wird durch eine Topoisomerase an der Religation gehindert. Bei der Ligation löst sich die Topoisomerase innerhalb weniger Minuten und das Fragment ligiert mit dem Vektor.

Die einzigen Voraussetzungen für diese Art der Klonierung sind eine hohe DNA Konzentration und PCR-Fragmente mit überhängenden Enden.

PCR-Fragmente, die mit Taq-Polymerase erstellt wurden, tragen ein zusätzliches Adenosinnukleotid, das die Polymerase an die generierten PCR-Enden anhängt. Bei Pfu-Polymerase geschieht dies nicht. Diese Polymerase beendet ihre Aktivität immer ohne Überhänge. In diesem Versuch können entweder Pfu-generierte Fragmente verwendet werden, oder PCR-Fragmente, die mit Pfu-Polymerase poliert wurden. Dabei wird das überhängende A entfernt und die Fragmente liegen ebenfalls „blunt-end“ vor.

Anmerkungen

Die Textübereinstimmungen erstrecken sich über die komplette Seite ohne Quellenverweis.

Sichter
(Hood) Singulus

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