36 gesichtete, geschützte Fragmente: Plagiat
| [1.] Jus/Fragment 079 17 - Diskussion Bearbeitet: 17. May 2014, 22:15 Singulus Erstellt: 17. May 2014, 16:53 (Hindemith) | Fragment, Gesichtet, Jus, SMWFragment, Schröder 2004, Schutzlevel sysop, Verschleierung |
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| Untersuchte Arbeit: Seite: 79, Zeilen: 17-24 |
Quelle: Schröder 2004 Seite(n): 111, Zeilen: 8ff |
|---|---|
| 5.3 Einfluss der In-vitro-Stabilität der Anthrazykline auf die Zytotoxizität
Im Rahmen einer parallel durchgeführten Doktorarbeit wurde die In-vitro- Stabilität der Anthrazykline und ihrer liposomalen Formen untersucht (24). Abb. 5.3.1. stellt den mittels Kapillarelektrophorese (CE) gemessenen prozentualen Anteil an unzersetztem Wirkstoff in Abhängigkeit von der Inkubationszeit dar. Freie und liposomale Wirkstoffe wurden in RPMI 1640 Medium (mit 10% FCS) inkubiert, nach 4, 8, 24, 48, 72 und 96 Stunden wurden Proben gezogen. In den Proben wurde der freie Wirkstoff direkt mit der CE gemessen. (24) Griese N Liposomales Daunorubicin.Pharmakokinetik, Metabolisierung, invitro- Stabilität Klinik und Poliklinik für Kinderheilkunde, Abteilung für pädiatrische Hämatologie und Onkologie, 2003 |
5.3. Einfluss der In-vitro-Stabilität der Anthrazykline auf die Zytotoxizität
Im Rahmen einer parallel durchgeführten Doktorarbeit wurde die In-vitro- Stabilität der Anthrazykline und ihrer liposomalen Formen untersucht. Abb.5.3.1. stellt den mittels Kapillarelektrophorese (CE) gemessenen prozentualen Anteil an unzersetztem Wirkstoff in Abhängigkeit von der Inkubationszeit dar. Freie und liposomale Wirkstoffe wurden in RPMI 1640 Medium (mit 10% FCS) inkubiert, nach 4, 8, 24, 48, 72 und 96 Stunden wurden Proben gezogen. Die Proben mit den freien Wirkstoffen wurden direkt mit der CE gemessen. |
Ein Verweis auf die Quelle der Übernahme fehlt. |
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| [2.] Jus/Fragment 080 01 - Diskussion Bearbeitet: 17. May 2014, 22:13 Singulus Erstellt: 17. May 2014, 17:05 (Hindemith) | Fragment, Gesichtet, Jus, SMWFragment, Schröder 2004, Schutzlevel sysop, Verschleierung |
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| Untersuchte Arbeit: Seite: 80, Zeilen: 1-9 |
Quelle: Schröder 2004 Seite(n): 112, 113, Zeilen: 112: 1ff; 113: 3ff |
|---|---|
| Abb. 5.3.1. In-vitro-Stabilität der Anthrazykline im Vergleich (24)
Das freie Doxorubicin ist im Gegensatz zu den liposomalen Formen und freiem Daunorubicin sehr instabil, schon nach 8 Stunden waren nur noch ca. 80% der ursprünglichen Wirkstoffform im Medium vorhanden. Nach 72 Stunden waren es nur noch ca. 20%. Anders verhielt es sich bei der liposomalen Form des Doxorubicins: Hier waren nach 72 Stunden noch über 90% des ursprünglichen Wirkstoffes nachweisbar. Nach 72stündiger Inkubation lagen vom ursprünglichen freien Daunorubicin noch ca.70% vor. Der liposomale Wirkstoff lag nach 72 Stunden noch zu ca.75% unverändert vor. (24) Griese N Liposomales Daunorubicin.Pharmakokinetik, Metabolisierung, invitro- Stabilität Klinik und Poliklinik für Kinderheilkunde, Abteilung für pädiatrische Hämatologie und Onkologie, 2003 |
Abb.5.3.1. In-vitro-Stabilität der Anthrazykline im Vergleich (36)
[...] In Abb.5.3.1. sieht man, dass freies Doxorubicin im Gegensatz zu den liposomalen Formen und freiem Daunorubicin sehr instabil ist, schon nach ca. 8 Stunden waren nur noch ca. 80% der ursprünglichen Wirkstoffform im Medium vorhanden. Nach 72 Stunden waren es nur noch ca. 20%. Anders verhielt es sich bei der liposomalen Form: Hier waren nach 72 Stunden noch über 90% des ursprünglichen Wirkstoffes nachweisbar. [Seite 113] Nach 72 stündiger Inkubation lagen vom ursprünglichen freien Daunorubicin noch ca.70% vor. Der liposomal verpackte Wirkstoff lag nach 72 Stunden noch zu ca.75% als ursprüngliche Form vor. (36) Griese N Liposomales Daunorubicin – Pharmakokinetik, Metabolisierung, In-vitro- Stabilität – Klinik und Poliklinik für Kinderheilkunde, Abteilung für pädiatrische Hämatologie und Onkologie, 2003 |
Ein Verweis auf die Quelle fehlt. |
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| [3.] Jus/Fragment 080 12 - Diskussion Bearbeitet: 17. May 2014, 22:12 Singulus Erstellt: 17. May 2014, 17:08 (Hindemith) | Fragment, Gesichtet, Jus, SMWFragment, Schröder 2004, Schutzlevel sysop, Verschleierung |
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| Untersuchte Arbeit: Seite: 80, Zeilen: 12-17 |
Quelle: Schröder 2004 Seite(n): 118, Zeilen: 5ff |
|---|---|
| In den Abbildungen 5.4.1. und 5.4.2. sind die vergleichenden Ergebnisse der 72stündigen Langzeitinkubationen beispielhaft auf den Zelllinien Cado ES-1 und VH-64 dargestellt.
Deutlich wird, dass sowohl Unterschiede bezüglich des Ansprechens der verschiedenen Zelllinien auf die Anthrazykline, als auch der Zytotoxizität der verschiedenen Anthrazykline auf einer Zelllinie bestehen. |
In den Abbildungen 5.5.1. und 5.5.2. sind die vergleichenden Ergebnisse der 72stündigen Langzeitinkubationen beispielhaft auf den Zelllinien Cado-ES-1 und VH-64 dargestellt.
Deutlich wird, dass sowohl Unterschiede bezüglich des Ansprechens der verschiedenen Zelllinien auf die Anthrazykline, als auch bezüglich der Zytotoxizität der verschiedenen Anthrazykline auf einer Zelllinie bestanden. |
Ein Verweis auf die Quelle fehlt. |
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| [4.] Jus/Fragment 079 01 - Diskussion Bearbeitet: 17. May 2014, 22:11 Singulus Erstellt: 17. May 2014, 16:29 (Hindemith) | Fragment, Gesichtet, Jus, SMWFragment, Schröder 2004, Schutzlevel sysop, Verschleierung |
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| Untersuchte Arbeit: Seite: 79, Zeilen: 1-4 |
Quelle: Schröder 2004 Seite(n): 110, Zeilen: 12ff |
|---|---|
| [Die Anthrazykline sind nachgewiesenermaßen besonders licht- und] temperaturempfindlich und können in Produkte zerfallen, die andere zytotoxische Eigenschaften haben (49). Einige Arbeiten konnten nachweisen, dass sich Verluste der zytotoxischen Aktivität zeigen (Haskill et al. 1981, zit. n: 54). Unter diesem Aspekt müssen auch die Ergebnisse dieser Arbeit kritisch betrachtet werden.
(49) Triche T, Cavazzana A Round Cell Tumors of Bone In: Unni KK(ed) Bone Tumors Churchill Livingstone, New York: 199-224, 1987 (54) Whang-Peng J, Triche TJ, Knutsen T, Miser J, Kao-Shan S, Tsai S, Israel M Cytogenetic Characteristics of Selected Small Round Cell Tumors of Childhood Cancer Genet Cytogenet 21: 185-208, 1986 |
Die Anthrazykline sind nachgewiesenermaßen besonders licht- und temperaturempfindlich und können in Produkte zerfallen, die andere zytotoxische Eigenschaften haben (77).
[...] Andere konnten nachweisen, dass sich Verluste der zytotoxischen Aktivität zeigen (Haskill et al. 1981, zit. n: 77). [...] Unter diesem Aspekt müssen auch die Ergebnisse dieser Arbeit kritisch betrachtet werden (siehe 5.3.). (77) Storm G, Steerenberg PA, van Borssum Waalkes M, Emmen F, Crommelin DJA Potential Pitfalls in In Vitro Antitumor Activity Testing of Free and Liposome-Entrapped Doxorubicin Journal of Pharmaceutical Sciences Vol 77, No 10:823-830, 1988 |
Ein Verweis auf die Quelle fehlt. Man beachte, dass die Quelle (54) in der untersuchten Arbeit Haskill et al. (1981) überhaupt nicht erwähnt. |
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| [5.] Jus/Fragment 026 01 - Diskussion Bearbeitet: 17. May 2014, 22:10 Singulus Erstellt: 16. May 2014, 10:44 (Hindemith) | Fragment, Gesichtet, Jus, SMWFragment, Schröder 2004, Schutzlevel sysop, Verschleierung |
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| Untersuchte Arbeit: Seite: 26, Zeilen: 1ff (komplett) |
Quelle: Schröder 2004 Seite(n): 47, Zeilen: 5ff |
|---|---|
| [Der Zellrasen wurde dabei sehr stark ausgedünnt, dieses führte zu einer sehr niedrigen] Zellzahl in den einzelnen Vertiefungen, zu gestörtem Wachstumsverhalten und entsprechend niedrigen Extinktionswerten.
Deshalb wurde das Medium, in dem die Zellen ausgesiedelt worden waren nicht abgesaugt um es durch die Zytostatika-Verdünnungsreihe zu ersetzen, sondern zu den 100μl Medium wurden 100μl des nun in doppelter Konzentration mit Zytostatikum versetzten Mediums gegeben. 3.4.3 MTT-Test zur Messung der Anzahl stoffwechselaktiver Zellen Der Test misst die Aktivität der mitochondrialen Dehydrogenasen lebender Zellen. Das schwach gelbe 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-tetrazoliumbromid (MTT) dringt in die Zellen ein, sein Tetrazoliumring wird durch Dehydrogenasen aktiver Mitochondrien oxidiert, es entsteht das alkohollösliche, dunkelblaue Formazan. Das im Lysepuffer enthaltene Detergenz SDS lysiert die Zellen und setzt das Formazan frei. Die Intensität der Formazanlösung wird photometrisch bestimmt (31). Dazu wurden zunächst nach Ende der Inkubationszeit in jede zu messende Vertiefung auf 100μl Medium 10μl MTT-Lösung pipettiert, und die Platte wurde für 4 Stunden inkubiert. Nach Beendigung dieser Inkubationszeit wurde das MTT-haltige Medium mit einer Pasteurpipette abgesaugt und durch 100μl Lysepuffer ersetzt. Unter vorsichtigem Schütteln wurden die Kristalle gelöst und die Lösung färbte sich gleichmäßig violett bis dunkelblau. Mit dem Elisa – Reader wurden die Extinktionen bei einer Wellenlänge von 550nm als Testfilter und 630nm als Referenzfilter bestimmt. (31) Lindl T 12.2.4 MTT-Test zur Messung von Lebensfähigkeit und Wachstum Zell- und Gewebekultur, Spektrum Akademischer Verlag 1998: 215-216 |
Der Zellrasen wurde dabei sehr stark ausgedünnt, dieses führte zu einer sehr niedrigen Zellzahl in den einzelnen Vertiefungen, zu gestörtem Wachstumsverhalten und entsprechend niedrigen Extinktionswerten.
Deshalb wurde das Medium, in dem die Zellen ausgesiedelt worden waren nicht abgesaugt um es durch die Zytostatika-Verdünnungsreihe zu ersetzen, sondern zu den 100μl Medium wurden 100μl des nun in doppelter Konzentration mit Zytostatikum versetzten Mediums gegeben. [...] 3.4.3. MTT-Test zur Messung stoffwechselaktiver Zellen Der Test misst die Aktivität der mitochondrialen Dehydrogenasen lebender Zellen. Das schwach gelbe 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-tetrazolium bromid (MTT) dringt in die Zellen ein, sein Tetrazoliumring wird durch Dehydrogenasen aktiver Mitochondrien oxidiert, es entsteht das alkohollösliche, dunkelblaue Formazan. Das im Lysepuffer enthaltene Detergenz SDS lysiert die Zellen und setzt das Formazan frei. Die Intensität der Formazanlösung wird photometrisch bestimmt (2). Dazu wurden zunächst nach Ende der Inkubationszeit in jede zu messende Vertiefung auf 100μl Medium 10μl MTT-Lösung pipettiert, und die Platte wurde für 4 Stunden inkubiert. Nach Beendigung dieser Inkubationszeit wurde das MTT-haltige Medium mit einer Pasteurpipette abgesaugt und durch 100μl Lysepuffer ersetzt. Unter vorsichtigem Schütteln wurden die Kristalle gelöst und die Lösung färbte sich gleichmäßig violett bis dunkelblau. Mit dem Elisa – Reader wurden die Extinktionen bei einer Wellenlänge von 550nm als Testfilter und 630nm als Referenzfilter bestimmt. (2) Aurias A, Rimbaut C, Buffe D, Dubousset J, Mazabraud A Chromosomal translocations in Ewing’s sarcoma N Engl J Med 309: 496-497, 1983 |
Ein Verweis auf die Quelle fehlt. |
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| [6.] Jus/Fragment 078 08 - Diskussion Bearbeitet: 17. May 2014, 22:07 Singulus Erstellt: 17. May 2014, 16:14 (Hindemith) | Fragment, Gesichtet, Jus, SMWFragment, Schröder 2004, Schutzlevel sysop, Verschleierung |
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| Untersuchte Arbeit: Seite: 78, Zeilen: 8-24 |
Quelle: Schröder 2004 Seite(n): 109, 110, Zeilen: 109: 7ff; 110: 8-11 |
|---|---|
| Zum Erreichen der GI50 waren bei der Zelllinie Cado ES-1 mehr als 10x höhere Zytostatikakonzentrationen notwendig als bei den übrigen Zelllinien.
Bei der Untersuchung der P-Glykoproteinexpression mittels Durchflusszytometrie ergab sich, dass Cado ES-1 mit 60,3% gegenüber 2,0% bei VH-64, 2,1% bei STA-ET-1 und 20,3% bei STA-ET-2.1 die höchste Expression an der Zelloberfläche aufwies. 5.2 Zur Methodik 5.2.1 Zellkulturversuche Zellkulturversuche sind technisch einfach durchzuführen und mit standardisierten Methoden lässt sich Zellmaterial kostengünstig in kurzer Zeit vervielfältigen. Für die präklinische Erprobung neuer Chemotherapeutika sind in-vitro-Versuche ohne Zweifel eine der wichtigsten Methoden. Allerdings laufen sie im Labor unter optimierten Bedingungen ab, so dass die Übertragung auf den einer komplexen Pharmokokinetik unterliegenden Organismus nur sehr eingeschränkt möglich ist. Für zahlreiche Zytostatika wurde eine in-vitro-Instabilität nachgewiesen, so dass man nicht unbedingt von der einmalig zu Inkubationsbeginn auf die Zellen gegebenen Konzentration auf die Konzentration nach 96 Stunden Inkubationszeit schließen kann (49). (49) Triche T, Cavazzana A Round Cell Tumors of Bone In: Unni KK(ed) Bone Tumors Churchill Livingstone, New York: 199-224, 1987 |
Es stellte sich heraus, dass Cado ES-1 die gegenüber den Anthrazyklinen resistenteste
Zelllinie war. Zum Erreichen der GI50 waren 5-10x höhere Zytostatikakonzentrationen notwendig als bei den übrigen Zelllinien. Bei der Untersuchung der P-Glykoproteinexpression mittels Durchflusszytometrie ergab sich, dass Cado ES-1 mit 60,3% gegenüber 1,96% bei VH-64, 2,13% bei STA-ET-1 und 20,31% bei STA-ET-2.1 die höchste Expression aufwies. [...] 5.2. Zur Methodik 5.2.1. Zellkulturversuche Zellkulturversuche sind technisch einfach durchzuführen und mit standartisierten Methoden lässt sich Zellmaterial kostengünstig in kurzer Zeit vervielfältigen. Man kann unter kontrollierten und standartisierten Bedingungen zahlreiche Experimente durchführen und Einflussgrößen beliebig variieren. Für Chemotherapeutika sind Invitro- Versuche auf gut charakterisierten Zelllinien ohne Zweifel eine der wichtigsten Methoden zur präklinischen Evaluierung neuer Substanzen und Therapiekonzepte. Allerdings laufen sie im Labor unter optimierten Bedingungen ab, so dass die Interpretation hinsichtlich der In-vivo-Bedingungen mit großer Vorsicht anzugehen ist. [Seite 110] Für zahlreiche Zytostatika wurde eine In-vitro-Instabilität nachgewiesen, so dass man nicht unbedingt von der einmalig zu Inkubationsbeginn auf die Zellen gegebenen Konzentration auf die Konzentration nach 96 Stunden Inkubationszeit schließen kann (83). (83) Wagner A, Hempel G, Gumbinger HG, Jürgens H, Boos J Pharmacokinetics of Anticancer Drugs In Vitro Drug Resistance in Leukemia and Lymphoma III:397-406 edited by Kaspers et al. Kluwer Academic/Plenum Publishers, New York,1999 |
Ein Verweis auf die Quelle fehlt. |
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| [7.] Jus/Fragment 025 01 - Diskussion Bearbeitet: 17. May 2014, 21:34 Hindemith Erstellt: 16. May 2014, 10:32 (Hindemith) | Fragment, Gesichtet, Jus, SMWFragment, Schröder 2004, Schutzlevel sysop, Verschleierung |
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| Untersuchte Arbeit: Seite: 25, Zeilen: 1ff (komplett) |
Quelle: Schröder 2004 Seite(n): 46, 47, Zeilen: 46: 1ff; 47: 1ff |
|---|---|
| Abb. 3.4.2.
Kurzinkubation mit Anthracyclinen
Zu Abb. 3.4.2.: Für diese Versuchsreihen wurden 20 Platten pro Zelllinie mit den gleichen Verdünnungsreihen angesetzt. Nach einer Kurzexposition von einer, zwei, vier und acht Stunden wurde auf jeweils 4 Platten das Zytostatikum enthaltende Medium von den Zellen abgesaugt und durch RPMI – Medium + FCS 10% ersetzt. Eine zusätzliche Platte wurde umgehend gemessen, die vier anderen je für 24, 48, 72 oder 96 Stunden wieder inkubiert . Nach Ablauf dieser Zeitspanne wurde die Anzahl vitaler Zellen bestimmt. Diese Versuche wurden mit den Zelllinien Cado ES-1 und VH-64 durchgeführt. VH-64 reagierte sehr empfindlich auf das im Abstand weniger Stunden stattfindende Absaugen, das für den ursprünglichen Versuchsaufbau bei den Kurzexpositionen notwendig war. Der Zellrasen wurde dabei sehr stark ausgedünnt, dieses führte zu einer sehr niedrigen [Zellzahl in den einzelnen Vertiefungen, zu gestörtem Wachstumsverhalten und entsprechend niedrigen Extinktionswerten.] |
Abb.3.4.2.
Kurzinkubation mit Anthracyclinen
Zu Abb.3.4.2.: Für diese Versuchsreihen wurden 20 Platten pro Zelllinie mit den gleichen Verdünnungsreihen angesetzt. Nach einer Kurzexposition von einer, zwei, vier und acht Stunden wurde auf jeweils 4 Platten das Zytostatikum enthaltende Medium von den Zellen abgesaugt und durch RPMI – Medium + FCS 10% ersetzt. Eine zusätzliche Platte wurde umgehend gemessen, die vier anderen je für 24, 48, 72 oder 96 Stunden wieder inkubiert und nach Ablauf dieser Zeitspanne wurde die Anzahl vitaler Zellen bestimmt. [Seite 47] Diese Versuche wurden mit den Zelllinien Cado ES-1, VH-64 und STA-ET-1 durchgeführt. VH-64 und STA-ET-1 reagierten sehr empfindlich auf das im Abstand weniger Stunden stattfindende Absaugen, das für den ursprünglichen Versuchsaufbau bei den Kurzexpositionen notwendig war. Der Zellrasen wurde dabei sehr stark ausgedünnt, dieses führte zu einer sehr niedrigen Zellzahl in den einzelnen Vertiefungen, zu gestörtem Wachstumsverhalten und entsprechend niedrigen Extinktionswerten. |
Ein Verweis auf die Quelle fehlt. |
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| [8.] Jus/Fragment 021 01 - Diskussion Bearbeitet: 17. May 2014, 21:33 Hindemith Erstellt: 15. May 2014, 21:16 (Hindemith) | Fragment, Gesichtet, Jus, SMWFragment, Schröder 2004, Schutzlevel sysop, Verschleierung |
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| Untersuchte Arbeit: Seite: 21, Zeilen: 1ff (komplett) |
Quelle: Schröder 2004 Seite(n): 42, 43, Zeilen: 42: 12ff; 43: 1ff |
|---|---|
| Abb. 3.3.1. Wachstumskurven
Stunde 0 = 72 Stunden nach Aussiedlung der Zellen
Die Zellen wurden vor Zugabe der Substanzen einer Präinkubation von 72 Stunden ausgesetzt um Adhärenz und Übergang in exponentielles Wachstum zu erreichen. Vor Versuchsbeginn wurden Wachstumskurven erstellt, um die Wachstumscharakteristika der Zellen zu erfassen und optimale Voraussetzungen für die Versuchsreihen zu erhalten. Die Zellen sollten sich zu Beginn des Beobachtungszeitraums in der exponentiellen Wachstumsphase befinden, um die toxischen Effekte sicher erfassen zu können. Bei Aussiedlung zu vieler Zellen hätten selbstlimitierende Effekte wie zum Beispiel Konkurrenz bezüglich der im Medium enthaltenen Nährstoffe die Ergebnisse der Versuche beeinflussen können. In Abb. 3.3.1. zeigt sich, dass sich die Zellen bei den gewählten ausgesiedelten Zellzahlen über den Inkubationszeitraum von 24 bis 96 Stunden ab Stunde 0 in der exponentiellen Wachstumsphase befanden. |
Abb. 3.3.1. Wachstumskurven
Stunde 0 = 72 Stunden nach Aussiedlung der Zellen
Die Zellen wurden vor Zugabe der Substanzen einer Präinkubation von 72 Stunden ausgesetzt um Adhärenz und Übergang in exponentielles Wachstum zu erreichen. [Seite 43] Vor Versuchsbeginn wurden Wachstumskurven erstellt mit dem Ziel die Wachstumscharakteristika der Zellen zu erfassen und auszutesten, wie viele Zellen ausgesiedelt werden sollten um optimale Voraussetzungen für die Versuchsreihen zu erhalten. Die Zellen sollten sich zu Beginn des Beobachtungszeitraums in der exponentiellen Wachstumsphase befinden um die toxischen Effekte sicher erfassen zu können. Außerdem war es wichtig, dass nicht zu viele Zellen ausgesiedelt wurden, da sonst selbstlimitierende Effekte wie zum Beispiel Konkurrenz bezüglich der im Medium enthaltenen Nährstoffe vorkamen. In Abb.3.3.1. kann man erkennen, dass sich die Zellen bei den gewählten ausgesiedelten Zellzahlen über den Inkubationszeitraum von 24 – 96 Stunden ab Stunde 0 in der exponentiellen Wachstumsphase befanden. |
Ein Verweis auf die Quelle fehlt. |
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| [9.] Jus/Fragment 076 01 - Diskussion Bearbeitet: 17. May 2014, 19:02 Hindemith Erstellt: 14. May 2014, 22:56 (Hindemith) | Fragment, Gesichtet, Jus, SMWFragment, Schröder 2004, Schutzlevel sysop, Verschleierung |
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| Untersuchte Arbeit: Seite: 76, Zeilen: 1-11 (komplett) |
Quelle: Schröder 2004 Seite(n): 107, 108, Zeilen: 107: 6ff: 108: 1-4 |
|---|---|
| 4.5.2 P-Glykoproteinexpression auf VH-64
Abb. 4.5.2.
Hier fallen die dunkelgraue Kurve für die PGP-Bindung und die Negativkontrolle aufeinander. Die Messungen ergaben, dass die PGP-Expression der Zelllinie VH-64 nur 1,96% der Zellpopulation ausmachte. 4.5.3 P-Glykoproteinexpression auf STA-ET-1 Abb. 4.5.3.
Auch hier fallen die dunkelgraue Kurve für die PGP-Bindung und die Negativkontrolle aufeinander. Die Messungen ergaben, dass 2,13% der STA-ET-1 Population eine PGP-Expression aufwies. |
4.7.2. P-Glykoproteinexpression auf VH-64
Abb.4.7.2.
Hier fallen die dunkelgraue Kurve für die PGP-Bindung und die Negativkontrolle aufeinander. Die Messungen ergaben, dass die PGP-Expression auf VH-64 nur 1,96% der Zellpopulation betrug. 4.7.3. P-Glykoproteinexpression auf STA-ET-1 Abb.4.7.3.
[Seite 108] Auch hier fallen die dunkelgraue Kurve für die PGP-Bindung und die Negativkontrolle aufeinander. Die Messungen ergaben, dass die PGP-Expression auf STA-ET-1 2,13 % der Zellpopulation betrug. |
Ein Verweis auf die Quelle fehlt. |
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| [10.] Jus/Fragment 003 07 - Diskussion Bearbeitet: 17. May 2014, 19:02 Hindemith Erstellt: 14. May 2014, 23:30 (Hindemith) | Fragment, Gesichtet, Jus, SMWFragment, Schröder 2004, Schutzlevel sysop, Verschleierung |
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| Untersuchte Arbeit: Seite: 3, Zeilen: 7-16 |
Quelle: Schröder 2004 Seite(n): 7, 8, Zeilen: 7: 1ff; 8: Abbildung |
|---|---|
| 1.1.5 Epidemiologie
Bei Kindern sind ca. 5% aller bösartigen Neubildungen Knochentumoren. Nach dem Osteosarkom sind Tumoren der Ewing-Familie (EFT) die zweithäufigsten Knochenmalignome im Kindes- und Jugendalter, insgesamt machen sie etwa 2% der kindlichen Malignome aus (40). Nach epidemiologischen Analysen der deutschen Patienten von (EI)CESS 1980-1997, in der die Daten von 945 Patienten berücksichtigt wurden, waren 60% der Patienten männlich, 57,1% erkrankten im Alter zwischen 10 und 19 Jahren, während 20% in jüngerem Alter und knapp ein Viertel nach dem 20. Lebensjahr einen Ewing-Tumor entwickelten (26). Abb. 1.1.2. Ewing-Sarkom der rechten Beckenschaufel (23)
MRT-Aufnahme (23) GPOH Frankfurt 30./31.05.1997 (26) Hense HW, Ahrens S, Paulussen M, Lehnert M, Jürgens H Descriptive Epidemiologie der Ewing-Tumoren – Analysen der deutschen Patienten von (EI)CESS 1980-1997 Klinische Pädiatrie 211: 271-275,1999 (40) Roessner A, Mittler U, Röse I, Radig K, Grote H Pathologie des Ewingsarkoms Pathologe 17: 6-17, 1996 |
1.1.5. Epidemiologie
Bei Kindern jedoch ist die Bedeutung größer, bei ihnen sind ca. 5% aller bösartigen Veränderungen auf Knochentumoren zurückführbar. Nach dem Osteosarkom sind Tumoren der Ewing-Familie (EFT), zu denen neben den typischen Ewing-Sarkomen (EWS) noch die atypischen EWS sowie die malignen Peripheren Neuro-Ektodermalen Tumoren (PNET) zählen (82,72), die zweithäufigsten Knochenmalignome im Kindes- und Jugendalter, insgesamt machen sie etwa 2% der kindlichen Malignome aus. Basierend auf epidemiologischen Analysen der deutschen Patienten von (EI)CESS 1980-1997, in der die Daten von 945 Patienten berücksichtigt wurden, sind in Tabelle 1.1.1. die absoluten Patientenzahlen sowie die entsprechenden relativen Häufigkeiten, getrennt nach Geschlecht und 5-Jahres-Altersklassen, für den gesamten Studienzeitraum 1980-1997 dargestellt. 60% der Patienten waren männlich, 57,1% erkrankten im Alter zwischen 10 und 19 Jahren, während 20% in jüngerem Alter und knapp ein Viertel nach dem 20. Lebensjahr einen Ewing-Tumor entwickelten. [...] (39). [Seite 8] Abb.1.1.2. In der rechten Beckenkenschaufel lokalisiertes Ewing-Sarkom, MRT-Aufnahme
(39) Hense HW, Ahrens S, Paulussen M, Lehnert M, Jürgens H Deskriptive Epidemiologie der Ewing-Tumoren – Analysen der deutschen Patienten von (EI)CESS 1980-1997 Klin. Pädiatr. 211:271-75, 1999 (72) Schmidt D, Herrmann C, Jürgens H, Harms D Malignant peripheral neuroectodermal tumor and its necessary distinction from Ewing’s sarcoma. A report from the Kiel Pediatric Tumor registry Cancer 68:2251-59, 1991 (82) van Valen Frans Ewing’s Sarcoma Family of Tumors Human Cell Culture Vol 1:55-85, 1999 |
Ein Verweis auf die Quelle fehlt. |
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| [11.] Jus/Fragment 005 01 - Diskussion Bearbeitet: 17. May 2014, 19:02 Hindemith Erstellt: 15. May 2014, 00:04 (Hindemith) | Fragment, Gesichtet, Jus, SMWFragment, Schröder 2004, Schutzlevel sysop, Verschleierung |
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| Untersuchte Arbeit: Seite: 5, Zeilen: 1-19 |
Quelle: Schröder 2004 Seite(n): 13, 14, Zeilen: 13: 9ff; 14: 1ff |
|---|---|
| 1.2.1 Chemie und Wirkungsmechanismus
Die aus Streptomyces-Arten gewonnenen, z.T. abgewandelten Antibiotika fasst man als Anthrazykline zusammen. Wirkmechanismus: - DNS – Interkalation - Hemmung der DNS – Synthese - Interaktion mit RNS – Polymerasen - Hemmung der DNS–Topoisomerase II, die bei der Gestaltung superhelikaler Windungen in der DNS Hydrolyse und Wiederverknüpfung durchführt - Biotransformation zu freien Radikalen, welche Doppelstrangbrüche hervorrufen - Chelatbildung (34). Charakteristisch für die Struktur der Anthrazykline ist das vom Naphthacen abgeleitete Ringsystem sowie der am gesättigten Ring A α-glykosidisch verknüpfte Aminozucker. Strukturelle Wirkungsvoraussetzung ist die Verknüpfung einer koplanaren hydrophoben Region (Anthrachinon) mit einer gewinkelten hydrophilen Struktur (OH-Gruppen, Aminozucker in protoniertem Zustand) (41, 34). Während beim Daunorubicin am C-Atom 13 eine Methylgruppe gebunden ist, ist es beim Doxorubicin eine Hydroxymethylgruppe, wodurch ersteres seinen lipophileren Charakter erhält. Abb. 1.2.1. Strukturformeln der Anthrazykline Daunorubicin und Doxorubicin
(34) Mutschler E 10.4 Zytostatisch wirksame Antibiotika Arzneimittelwirkungen Lehrbuch der Pharmakologie und Toxikologie, 6. Auflage 1991 Wissenschaftliche Verlagsgesellschaft: 674-676 (41) Roth J, Fenner H 8.2 Interkalierende Antibiotika und abgeleitete synthetische Verbindungen Arzneistoffe Strukut – Bioreaktivität – Wirkungsbezogene Eigenschaften, 3. Auflage 2000, Deutscher Apotheker Verlag Suttgart 172-176 |
1.2.1. Chemie und Wirkungsmechanismus
Die aus Streptomyces – Arten gewonnenen, z.T. abgewandelten Antibiotika fasst man als Anthrazykline zusammen. Die Anthracycline wirken über verschiedene Mechanismen zytostatisch: - DNS – Interkalation, - Hemmung der DNS – Synthese, - Interaktion mit RNS – Polymerasen, - Hemmung der DNS – Topoisomerase II, die bei der Gestaltung superhelikaler Windungen in der DNS Hydrolyse und Wiederverknüpfung durchführt, - Biotransformation zu freien Radikalen, welche Doppelstrangbrüche hervorrufen, - Chelatbildung, wobei einige der dabei gebildeten Komplexe zum Zelltod beitragen sollen, - [...] Charakteristisch für die Struktur der Anthrazykline ist das vom Naphthacen abgeleitete Ringsystem sowie der am gesättigten Ring A alpha-glykosidisch verknüpfte Aminozucker. [Seite 14] Strukturelle Wirkungsvoraussetzung ist die Verknüpfung einer koplanaren hydrophoben Region (Anthrachinon) mit einer gewinkelten hydrophilen Struktur (OH-Gruppen, Aminozucker in protoniertem Zustand) (56,69). Die Anthrazykline Daunorubicin und Doxorubicin, um die es in dieser Arbeit geht, unterscheiden sich nur durch einen Substituenten am C-Atom 13. Beim Daunorubicin ist hier eine Methylgruppe gebunden, beim Doxorubicin eine Hydroxymethylgruppe, wodurch ersteres seinen lipophileren Charakter erhält. Abb.1.2.1. Strukturformeln der Anthracycline Daunorubicin und Doxorubicin
(56) Mutschler E 10.4 Zytostatisch wirksame Antibiotika Arzneimittelwirkungen Lehrbuch der Pharmakologie und Toxikologie, 6. Auflage 1991 Wissenschaftliche Verlagsgesellschaft: 674-76 (69) Roth J, Fenner H 8.2 Interkalierende Antibiotika und abgeleitete synthetische Verbindungen Arzneistoffe Struktur – Bioreaktivität - Wirkungsbezogene Eigenschaften, 3.Auflage 2000 Deutscher Apotheker Verlag Stuttgart: 172-176 |
Ein Verweis auf die Quelle fehlt. |
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| [12.] Jus/Fragment 006 01 - Diskussion Bearbeitet: 17. May 2014, 19:02 Hindemith Erstellt: 15. May 2014, 05:39 (Hindemith) | Fragment, Gesichtet, Jus, SMWFragment, Schröder 2004, Schutzlevel sysop, Verschleierung |
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| Untersuchte Arbeit: Seite: 6, Zeilen: 1ff (komplett) |
Quelle: Schröder 2004 Seite(n): 14, 15, 16, Zeilen: 14: 8ff; 15: 4ff; 16: 1ff |
|---|---|
| 1.2.2 Nebenwirkungen
Die wichtigste unerwünschte Wirkung der Anthrazykline ist ihre Kardiotoxizität. Dosisabhängig kommt es zu einer Myokardschädigung, die mit einer Lipid-Peroxidation erklärt wird. Dabei auftretende reaktive Sauerstoffverbindungen sind zytotoxisch und führen zu einer Membranschädigung (34). Weitere allgemeine Nebenwirkungen der zytostatischen Therapie sind Übelkeit, Immunsuppression, Knochenmarksdepression, Diarrhoe, Erbrechen, Gastroenteritiden und Alopezie. Die Substanzen selbst wirken kanzerogen und mutagen. Die Ausscheidung erfolgt überwiegend auf biliärem Weg (34). 1.2.3 Indikationen Zum ersten Mal wurde 1963 die zytostatische Aktivität von Daunorubicin gegen leukämische Zellen in Mailand und Paris untersucht. 1967 begann man mit präklinischen Versuchsreihen. Diese konnten die Wirksamkeit von Doxorubicin gegen zahlreiche solide Tumoren nachweisen. Zu dieser Zeit bestätigten schon vielversprechende klinische Studien die Wirksamkeit von Daunorubicin bei akuter myeloischer Leukämie (46, 52). Heute sind die beiden Wirkstoffe für die folgenden Tumorentitäten zugelassen: Daunorubicin: Remissionsinduktion bei akuten lymphoblastischen bzw. lymphatischen (ALL) und akuten myeloischen (AML) Leukämien im Kindes- und Erwachsenenalter. Doxorubicin: Kleinzelliges Bronchialkarzinom, Mammakarzinom, fortgeschrittenes Ovarialkarzinom, intravesikuläre Rezidivprophylaxe oberflächlicher Harnblasenkarzinome, neoadjuvante und adjuvante Therapie des Osteosarkoms, fortgeschrittenes Weichteilsarkom , Ewing-Sarkom, Hodgkin-Lymphom, hochmalignes Non-Hodgkin- Lymphom, fortgeschrittenes Multiples Myelom, fortgeschrittenes oder rezidiviertes Endometriumkarzinom, Wilms-Tumor, fortgeschrittenes papilläres/follikuläres Schilddrüsenkarzinom, fortgeschrittenes Neuroblastom und fortgeschrittenes Magenkarzinom. (34) Mutschler E 10.4 Zytostatisch wirksame Antibiotika Arzneimittelwirkungen Lehrbuch der Pharmakologie und Toxikologie, 6. Auflage 1991 Wissenschaftliche Verlagsgesellschaft: 674-676 (46) Sikora K, Advani S, Koroltchouk V, Magrath I, Levy L, Pinedo H, Schwartsmann G, Tattersall M, Yan S Essential Drugs for Cancer Therapy: A World Health Organization Consultation Annals of Oncology 10: 385-390, 1999 (52) Wagner A., Hempel G, Gumbinger HG, Jürgens H, Boos J Pharmacokinetics of Anticancer Drugs in Vitro Drug Resistance in Leukaemia and Lymphoma III: 397-406 Edited by Kaspers et al Kluwer Academic/Plenum Publishers, New York 1999 |
1.2.2. Nebenwirkungen
Eine für Zytostatika mit Anthrachinon-Struktur charakteristische unerwünschte Nebenwirkung ist ihre Kardiotoxizität. Bei Langzeitbehandlung kommt es zu einer Myokardschädigung, die mit einer Lipid- Peroxidation erklärt wird. Dabei auftretende reaktive Sauerstoffverbindungen sind zytotoxisch und führen zu einer Membranschädigung. [Seite 15] [...] (56). Weitere Nebenwirkungen der Anthrazykline sind Knochenmarksdepression, Immunsuppression, Diarrhoe, Übelkeit, Erbrechen, Gastroenteritiden und Alopezie. Die Substanzen selbst wirken kanzerogen und mutagen. [...] Die Ausscheidung erfolgt überwiegend auf biliärem Weg. [...] (56) 1.2.3. Indikationen Zum ersten Mal wurde 1963 die zytostatische Aktivität von Daunomycin (=Daunorubicin) gegen leukämische Zellen in Mailand und Paris ausgetestet. 1967 begann man mit präklinischen Versuchsreihen. Diese konnten die Wirksamkeit von Adriamycin (=Doxorubicin) gegen zahlreiche solide Tumoren nachweisen. Zu dieser Zeit bestätigten schon vielversprechende klinische Studien die Wirksamkeit von Daunorubicin bei akuter myeloischer Leukämie (55). Heute sind die beiden Wirkstoffe für die folgenden Tumorentitäten zugelassen: Daunoblastin® (Daunorubicin): Remissionsinduktion bei akuten lymphoblastischen bzw. lymphatischen (ALL) und akuten myeloischen (AML) Leukämien im Kindes- und Erwachsenenalter. Adriblastin® (Doxorubicin): Kleinzelliges Bronchialkarzinom, Mammakarzinom, fortgeschrittenes Ovarialkarzinom, intravesikuläre Rezidivprophylaxe oberflächlicher Harnblasenkarzinome, neoadjuvante und adjuvante Therapie des Osteosarkoms, fortgeschrittenes Weichteilsarkom des Erwachsenen, Ewing-Sarkom, Frühstadium des [Seite 16] Hodgkin-Lymphoms, fortgeschrittenes Hodgkin-Lymphom, hochmalignes Non- Hodgkin-Lymphom, Remissionsinduktion bei akuter lymphatischer oder myeloischer Leukämie, fortgeschrittenes Multiples Myelom, fortgeschrittenes oder rezidiviertes Endometriumkarzinom, Wilms-Tumor, fortgeschrittenes papilläres/follikuläres Schilddrüsenkarzinom, fortgeschrittenes Neuroblastom und fortgeschrittenes Magenkarzinom. (55) Muggia FM Liposomal encapsulated anthracyclines: New therapeutic horizons Evolving Therapies Vol. 3, Nr. 2: 156-162, 2001 (56) Mutschler E 10.4 Zytostatisch wirksame Antibiotika Arzneimittelwirkungen Lehrbuch der Pharmakologie und Toxikologie, 6. Auflage 1991 Wissenschaftliche Verlagsgesellschaft: 674-76 |
Ein Verweis auf die Quelle fehlt. |
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| [13.] Jus/Fragment 007 01 - Diskussion Bearbeitet: 17. May 2014, 19:02 Hindemith Erstellt: 15. May 2014, 06:07 (Hindemith) | Fragment, Gesichtet, Jus, SMWFragment, Schröder 2004, Schutzlevel sysop, Verschleierung |
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| Untersuchte Arbeit: Seite: 7, Zeilen: 1ff (komplett) |
Quelle: Schröder 2004 Seite(n): 16, 17, Zeilen: 16: 7ff; 17: 1-3 |
|---|---|
| 1.2.4 Resistenzmechanismen gegen Anthrazykline
Resistenz kann entweder intrinsisch mit primär fehlendem Ansprechen auf die Therapie oder erworben sein, wobei nach zunächst gutem Ansprechen auf die Therapie eine Resistenzentwicklung erfolgt. Den besterforschten und -charakterisierten Mechanismus dieser Resistenz (MDR = Multidrug Resistance) stellt dabei das Produkt des MDR1 Gens, das sogenannte PGlykoprotein (PGP), dar, ein 170-kd großes kanalbildendes Tunnelprotein, das als energieabhängige Effluxpumpe der äußeren Zellmembran die Zytostatika aus der Zelle herauspumpen kann und so deren Anreicherung im Zytoplasma verhindert (22). Verschiedene andere molekulare Mechanismen werden mit der MDR in Verbindung gebracht, die in ihrer Gesamtheit vermutlich multifaktoriell sind (22, 30). Als weiterer Mechanismus wird das Multidrug Resistance associated Protein (MRP) diskutiert. Wie beim P-Glykoprotein handelt es sich hierbei um ein Membranprotein, das zur ABC-Familie der Transportproteine gehört (ABC = ATP Binding Cassette). Ihre Primärstrukturen sind unterschiedlich, sie ähneln sich aber sehr in ihrer Funktion und in ihrer Affinität zu bestimmten Chemotherapeutika (32). (22) Gottesmann MM How Cancer Cells Evade Chemotherapy: Sixteenth Richard and Hinda Rosenthal Foundation Award Lecture Cancer Research 53: 747-754, 1993 (30) Lehnert M Clinical Multdrug Resistance in Cancer: A Multifactorial Problem European Journal of Cancer 6: 912-920, 1996 (32) Loe DW, Deeley RG, Cole SPC Biology of the Multdrug Resistance – associated Proteine, MRP European Journal of Cancer 6: 945-957, 1996 |
1.2.4. Resistenzmechanismen gegen Anthrazykline
Resistenz kann entweder intrinsisch, wobei die Tumoren von Anfang an nicht auf die Therapie ansprechen, oder erworben sein, wobei die Tumoren zunächst auf die Therapie ansprechen, aber im Nachhinein eine Resistenz entwickeln und therapierefraktär werden. Den besterforschten und -charakterisierten Mechanismus dieser Resistenz (MDR = Multidrug Resistance) stellt dabei das Produkt des MDR1 Gens, das sogenannte PGlykoprotein (PGP) dar, ein 170-kd großes kanalbildendes Tunnelprotein, das als energieabhängige Effluxpumpe der äusseren Zellmembran die Zytostatika aus der Zelle herauspumpen kann und so dessen Anreicherung im Zytoplasma verhindert. Dieser Mechanismus spielt eine besondere Rolle bei Anthrazyklinen, Vinca-Alkaloiden oder anderen hydrophoben Verbindungen (32). Verschiedene andere molekulare Mechanismen werden mit der MDR in Verbindung gebracht, die in ihrer Gesamtheit vermutlich multifaktoriell sind (32,47). [...] Wie schon erwähnt, sind auch weitere Mechanismen der Chemoresistenz derzeit in der Diskussion. Das Multidrug Resistance associated Protein (MRP) spielt dabei eine bedeutende Rolle. Wie beim P-Glykoprotein handelt es sich hierbei um ein Membranprotein, das zur ABC-Familie der Transportproteine gehört (ABC = ATP Binding Cassette). [Seite 17] Ihre Primärstrukturen sind unterschiedlich, nur ungefähr 15% der Aminosäuren sind identisch, sie ähneln sich aber sehr in ihrer Funktion und in ihrer Affinität zu bestimmten Chemotherapeutika (49). (32) Gottesman MM How Cancer Cells Evade Chemotherapy: Sixteenth Richard and Hinda Rosenthal Foundation Award Lecture Cancer Research 53:747-754, 1993 (47) Lehnert M Clinical Multidrug Resistance in Cancer: A Multifactorial Problem European Journal of Cancer Vol 32A, No 6: 912-920, 1996 (49) Loe DW, Deeley RG, Cole SPC Biology of the Multidrug Resistance – associated Protein, MRP European Journal of Cancer Vol 32, No 6: 945-957, 1996 |
Ein Verweis auf die Quelle fehlt. |
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| [14.] Jus/Fragment 008 01 - Diskussion Bearbeitet: 17. May 2014, 19:02 Hindemith Erstellt: 15. May 2014, 19:49 (Hindemith) | Fragment, Gesichtet, Jus, SMWFragment, Schröder 2004, Schutzlevel sysop, Verschleierung |
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| Untersuchte Arbeit: Seite: 8, Zeilen: 1-18, 21-26 |
Quelle: Schröder 2004 Seite(n): 29, 30, Zeilen: 29: 1ff; 30: 1ff |
|---|---|
| 2 Fragestellung und Zielsetzung
Mit alleiniger Lokaltherapie liegt die 5-Jahres-Überlebensrate bei Patienten mit Ewingtumoren unter 10%, da rasch Metastasen auftreten. Die Prognose der lokalisierten Erkrankungen konnte durch die Einführung der systemischen Polychemotherapie auf 50-75% angehoben werden (29). Beim Einsatz der Chemotherapie als Kombinationstherapie für das Ewing-Sarkom spielen die Anthrazykline neben den alkylierenden Substanzen eine übergeordnete Rolle (siehe 1.1.8. und 1.2.). Die WHO hat im Rahmen des NCP (National Cancer Programme) Richtlinien zur Prävention, zu Vorsorgeuntersuchungen, zu Screeningprogrammen und zur optimalen Behandlung von malignen Erkrankungen erarbeitet. Ein wichtiges Kriterium war dabei die Beurteilung des Ansprechens auf die Chemotherapie. Die Familie der Ewingtumoren fällt wie oben bereits erwähnt unter diejenigen Entitäten, die beim Einsatz adjuvanter und neoadjauvanter Chemotherapie durch eine verlängerte durchschnittliche Überlebenszeit charakterisiert sind, wenn die Behandlung frühzeitig erfolgt (46). Trotz dieser Erkenntnisse und der klinischen Erfahrungen werden weder im Screening- Programm des NCI (National Cancer Institute) noch von der pharmazeutischen Industrie neu entwickelte Substanzen systematisch auf ihre Wirksamkeit beim Ewing-Sarkom in präklinischen In-vitro-Versuchen getestet. [...] Ziel war hier die systematische In-vitro-Beurteilung der Wirksamkeit der bewährten Anthrazykline Daunorubicin und Doxorubicin an 4 verschiedenen Ewing-Sarkom- Zelllinien. Für das In-vitro-Modell wurden Zelllinien gewählt, die sich bezüglich ihres biologischen Wachstumsverhaltens, ihrer Empfindlichkeit auf verschiedene Einflüsse und der Resistenz gegenüber den Zytostatika unterschieden. (29) Langer T, Stöhr W, Bielack S, Paulussen M, Treuner J, Beck JD for the German Late Effects Working Group in the German Society of Pediatric Oncology and Hematology (GPOH) Late Effects Surveillance System for Sarcoma Patients Pediatr Blood Cancer 42: 373-379, 2004 (46) Sikora K, Advani S, Koroltchouk V, Magrath I, Levy L, Pinedo H, Schwartsmann G, Tattersall M, Yan S Essential Drugs for Cancer Therapy: A World Health Organization Consultation Annals of Oncology 10: 385-390, 1999 |
2. Fragestellung und Zielsetzung
Mit alleiniger Lokaltherapie liegt die 5-Jahres-Überlebensrate bei Patienten mit Ewingtumoren unter 10%, da rasch Metastasen auftreten. Die Prognose der lokalisierten Erkrankungen konnte durch die Einführung der systemischen Polychemotherapie auf 50-65% angehoben werden (63). Beim Einsatz der Chemotherapie als Kombinationstherapie für das Ewing-Sarkom spielen die Anthrazykline neben den alkylierenden Substanzen eine übergeordnete Rolle (siehe 1.1.8. und 1.2.). [...] Die WHO hat im Rahmen des NCP (National Cancer Programme) Richtlinien zur Prävention, zu Vorsorgeuntersuchungen, zu Screeningprogrammen und zur optimalen Behandlung von malignen Erkrankungen erarbeitet. Dabei hat sie onkologische Erkrankungen gemäß ihres Ansprechen auf Chemotherapie beurteilt. Die Familie der Ewingtumoren fällt dabei unter diejenigen Entitäten, die beim Einsatz adjuvanter Chemotherapie durch eine verlängerte durchschnittliche Überlebenszeit charakterisiert ist, wenn die Behandlung frühzeitig erfolgt (75). Trotz dieser Charakterisierung und der klinischen Erfahrungen werden weder im Screening-Programm des NCI (National Cancer Institute), noch von der [Seite 30] pharmazeutischen Industrie systematisch neu entwickelte Substanzen auf ihre Wirksamkeit beim Ewing-Sarkom in präklinischen In-vitro-Versuchen getestet. Ziel war hier die systematische In-vitro-Beurteilung der Wirksamkeit der liposomalen Anthrazykline Daunoxome® und Caelyx® an 4 verschiedenen Ewing-Sarkom-Zelllinien. Für das In-vitro-Modell wurden Zelllinien gewählt, die sich bezüglich ihres biologischen Wachstumsverhaltens, ihrer Empfindlichkeit auf verschiedene Einflüsse und der Resistenz gegenüber den Zytostatika unterschieden. (63) Paulssen M, Ahrens S, Braun-Munziger G, Craft AW, Dockhorn Dworniczak B, Dörffel W, Dunst,J, Fröhlich B, Göbel U, Häussler M, Klingebiel T, Koscielniak E, Mittler U, Rübe C, Winkelmann W, Voûte PA, Zoubek A, Jürgens H EICESS 92 (European Intergroup Cooperative Ewing’s Sarcoma Study) – Erste Ergebnisse Klin. Pädiatr. 211:276-83, 1999 (75) Sikora K, Advani S, Koroltchouk V, Magrath I, Levy L, Pinedo H, Schwartsmann G, Tattersall M, Yan S Essential drugs for cancer therapy: A World Health Organization consultation Annals of Oncology 10:385-90, 1999 |
Ein Verweis auf die Quelle fehlt. Im wesentlichen sind die Zielsetzungen der Arbeit identisch mit dem einen Unterschied, dass bei Jus (2008) "Daunorubicin und Doxorubicin" untersucht werden und in der Quelle die liposomal verkapselten Versionen derselben Wirkstoffe: "Daunoxome® und Caelyx®". Man beachte, dass es in der untersuchten Arbeit keinen Abschnitt 1.1.8. gibt und hier wohl eine Übernahme im copy-paste-Stil vorliegt. |
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| [15.] Jus/Fragment 024 01 - Diskussion Bearbeitet: 17. May 2014, 19:02 Hindemith Erstellt: 16. May 2014, 10:05 (Hindemith) | Fragment, Gesichtet, Jus, KomplettPlagiat, SMWFragment, Schröder 2004, Schutzlevel sysop |
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| Untersuchte Arbeit: Seite: 24, Zeilen: 1ff (komplett) |
Quelle: Schröder 2004 Seite(n): 45, Zeilen: 1ff |
|---|---|
| Inkubationsschemata für die Dauerinkubation und die Kurzzeitexposition
Abb. 3.4.1. Dauerinkubation mit Anthracyclinen
Zu Abb. 3.4.1.: Je eine Platte mit den entsprechenden Verdünnungsreihen der Zytostatika wurde für 24, 48, 72 oder 96 Stunden inkubiert, und nach Ende dieser Zeitspanne wurde die Anzahl vitaler Zellen bestimmt. |
Inkubationsschemata für die Dauerinkubation und die Kurzzeitexposition
Abb.3.4.1. Dauerinkubation mit Anthracyclinen
Zu Abb.3.4.1.: Je eine Platte mit den entsprechenden Verdünnungsreihen der Zytostatika wurde für 24, 48, 72 oder 96 Stunden inkubiert, und nach Ende dieser Zeitspanne wurde die Anzahl vitaler Zellen bestimmt. |
Ein Verweis auf die Quelle fehlt. |
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| [16.] Jus/Fragment 022 01 - Diskussion Bearbeitet: 17. May 2014, 19:02 Hindemith Erstellt: 16. May 2014, 10:13 (Hindemith) | Fragment, Gesichtet, Jus, KomplettPlagiat, SMWFragment, Schröder 2004, Schutzlevel sysop |
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| Untersuchte Arbeit: Seite: 22, Zeilen: 1ff (komplett) |
Quelle: Schröder 2004 Seite(n): 43, 44, Zeilen: 43: 13ff; 44: 1-5 |
|---|---|
| So war die optische Dichte ausreichend hoch und eine sichere Erfassung bei der anschließenden Messung war gewährleistet. Anhand der Wachstumskurven konnten die Verdopplungszeiten der Zellen in der exponentiellen Wachstumsphase unter optimalen Bedingungen auf den Platten ermittelt werden (siehe Tab. 3.3.1.).
Tab. 3.3.1. Proliferationsrate der Zelllinien
3.4 Versuchsaufbau 3.4.1 Größe des Inkubationsansatzes Die Größe des Inkubationsansatzes wurde mit n = 4 auf 96-Loch-Platten festgelegt. Dargestellt ist im Ergebnisteil jeweils eine Versuchsreihe. Zur Sicherstellung der Reproduzierbarkeit der Daten wurde bei den Langzeitinkubationen jeder Versuch mindestens 2 mal wiederholt. Dabei wurden jeweils vergleichbare Ergebnisse erzielt. Die Kurzzeitexpositionen und anschließende Nachinkubation mit RPMI-Medium wurden nur jeweils einmal mit n = 4 auf den 96-Well-Platten durchgeführt. |
So war die optische Dichte ausreichend hoch und eine sichere Erfassung bei der anschließenden Messung war gewährleistet. Anhand der Wachstumskurven konnten die Verdopplungszeiten der Zellen in der exponentiellen Wachstumsphase unter optimalen Bedingungen auf den Platten ermittelt werden (siehe Tab.3.3.1.).
Tab.3.3.1. Proliferationsrate der Zelllinien
3.4. Versuchsaufbau 3.4.1. Größe des Inkubationsansatzes Die Größe des Inkubationsansatzes wurde mit n = 4 auf 96-Loch-Platten festgelegt. [Seite 44] Dargestellt ist im Ergebnisteil jeweils eine Versuchsreihe. Zur Sicherstellung der Reproduzierbarkeit der Daten wurde bei den Langzeitinkubationen jeder Versuch mindestens 3 mal wiederholt. Dabei wurden jeweils vergleichbare Ergebnisse erzielt. Die Kurzzeitexpositionen und anschließende Nachinkubation mit RPMI – Medium wurden nur jeweils einmal mit n = 4 auf den 96-Well-Platten durchgeführt. |
Ein Verweis auf die Quelle fehlt. |
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| [17.] Jus/Fragment 027 01 - Diskussion Bearbeitet: 17. May 2014, 19:01 Hindemith Erstellt: 16. May 2014, 10:51 (Hindemith) | Fragment, Gesichtet, Jus, KomplettPlagiat, SMWFragment, Schröder 2004, Schutzlevel sysop |
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| Untersuchte Arbeit: Seite: 27, Zeilen: 1ff (komplett) |
Quelle: Schröder 2004 Seite(n): 49, Zeilen: 1ff |
|---|---|
| 3.5 Durchflusszytometrie zur Überprüfung der P-Glykoprotein Expression auf den verwendeten Zelllinien
3.5.1 Das Durchflusszytometer Das Durchflusszytometer ist ein optisches Messsystem, das Streulicht- und Fluoreszenzsignale einzelner in einem Flüssigkeitsstrom fokussierter Partikel analysiert. Im Gegensatz zu einem statischen Fluorimeter beruhen die Ergebnisse auf einer gleichzeitigen Messung mehrerer physikalischer und biochemischer Parameter jeweils einer einzelnen Zelle. Im wesentlichen werden optische Signale unterschiedlicher Qualität, wie Fluoreszenz und Lichtstreuung, gemessen. Diese Signale entstehen beim Kontakt eines Partikels mit einem Lichtstrahl. Dazu werden die Zellen, die sich in einer Suspension befinden, hintereinander zu einem Analysepunkt geleitet, an dem sie vom fokussierten Lichtstrahl einer Lichtquelle beleuchtet werden. Das optische Detektionssystem und die Elektronik quantifizieren die Fluoreszenz– und Streulichtemissionen jeder einzelnen Zelle. Eine Analyse besteht demnach aus der Summe vieler schnell aufeinanderfolgender Einzelmessungen. 3.5.2 Darstellung der Messergebnisse In der Einfarbenimmunfluoreszenzmessung, wie sie hier durchgeführt wurde, findet die einparametrische Histogrammanalyse Anwendung. Die digitalisierten Werte einer Messung können bei einer Auflösung von 1024 Klassen Werte [sic] von 0 bis 1023 einnehmen. Die einzelnen Messwerte fallen in das jeweils ihnen entsprechende Register. Im Histogramm sind also die Anzahl der Zellen (Ordinate) gegen die Klassen (Abszisse) aufgetragen. Der Unterschied zwischen zwei benachbarten Klassen entspricht einem definierten Unterschied der jeweiligen Eigenschaftsexpression einer Zelle. |
3.6. Durchflusszytometrie zur Überprüfung der P-Glykoprotein Expression auf den verwendeten Zelllinien
3.6.1. Das Durchflusszytometer Das Durchflusszytometer ist ein optisches Messsystem, das Streulicht- und Fluoreszenzsignale einzelner in einem Flüssigkeitsstrom fokussierter Partikel analysiert. Im Gegensatz zu einem statischen Fluorimeter beruhen die Ergebnisse auf einer gleichzeitigen Messung mehrerer physikalischer und biochemischer Parameter jeweils einer einzelnen Zelle. Im wesentlichen werden optische Signale unterschiedlicher Qualität, wie Fluoreszenz und Lichtstreuung, gemessen. Diese Signale entstehen beim Kontakt eines Partikels mit einem Lichtstrahl. Dazu werden die Zellen, die sich in einer Suspension befinden, hintereinander zu einem Analysepunkt geleitet, an dem sie vom fokussierten Lichtstrahl einer Lichtquelle beleuchtet werden. Das optische Detektionssystem und die Elektronik quantifizieren die Fluoreszenz– und Streulichtemissionen jeder einzelnen Zelle. Eine Analyse besteht demnach aus der Summe vieler schnell aufeinanderfolgender Einzelmessungen (73). 3.6.2. Darstellung der Messergebnisse In der Einfarbenimmunfluoreszenzmessung, wie sie hier durchgeführt wurde, findet die einparametrische Histogrammanalyse Anwendung. Die digitalisierten Werte einer Messung können bei einer Auflösung von 1024 Klassen Klassenwerte von 0 bis 1023 einnehmen. Die einzelnen Messwerte fallen in das jeweils ihnen entsprechende Register. Im Histogramm sind also die Anzahl der Zellen (Ordinate) gegen die Klassen (Abszisse) aufgetragen. Der Unterschied zwischen zwei benachbarten Klassen entspricht einem definierten Unterschied der jeweiligen Eigenschaftsexpression einer Zelle (73). (73) Schmitz G, Rothe G Grundlagen der Durchflußzytometrie Durchflußzytometrie in der klinischen Zelldiagnostik:3-48 Schattauer, 1996 |
Ein Verweis auf die Quelle fehlt. Auch findet sich in der untersuchten Arbeit kein Verweis auf Schmitz & Rothe (1996) |
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| [18.] Jus/Fragment 028 01 - Diskussion Bearbeitet: 17. May 2014, 19:01 Hindemith Erstellt: 16. May 2014, 10:55 (Hindemith) | Fragment, Gesichtet, Jus, KomplettPlagiat, SMWFragment, Schröder 2004, Schutzlevel sysop |
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| Untersuchte Arbeit: Seite: 28, Zeilen: 1ff (komplett) |
Quelle: Schröder 2004 Seite(n): 50, Zeilen: 1ff |
|---|---|
| 3.5.3 Analyse von Immunfluoreszenzmessungen
Zur Bestimmung antigenpositiver Zellen ist die Orientierung an der Verteilung einer geeigneten Negativkontrolle notwendig. Die negativen Zellen umfassen den Bereich bis zu jener Klasse, in der die Fluoreszenz (Autofluoreszenz und unspezifische Bindung) einer negativen Zelle noch fallen kann. Dieser Klassenwert wird dann für die folgenden Messungen beibehalten. Jede Zelle mit einem höheren Klassenwert gilt dann als „positiv“. Hier wurden die Zelllinien Cado ES-1, VH-64, STA-ET-1 und STA-ET-2.1 mit der Einfarbenimmunfluoreszenzmessung auf ihre jeweilige P-Glykoproteinexpression untersucht. Die Negativkontrolle wurde mit Antikörpern gegen Glykophorin durchgeführt, welches nur auf hämatopoetischen Stammzellen nachzuweisen ist. |
3.6.3. Analyse von Immunfluoreszenzmessungen
Zur Bestimmung antigenpositiver Zellen ist die Orientierung an der Verteilung einer geeigneten Negativkontrolle notwendig. Die negativen Zellen umfassen den Bereich bis zu jener Klasse, in der die Fluoreszenz (Autofluoreszenz und unspezifische Bindung) einer negativen Zelle noch fallen kann. Dieser Klassenwert wird dann für die folgenden Messungen beibehalten. Jede Zelle mit einem höheren Klassenwert gilt dann als „positiv“ (73). Hier wurden die Zelllinien Cado ES-1, VH-64, STA-ET-1 und STA-ET-2.1 mit der Einfarbenimmunfluoreszenzmessung auf ihre jeweilige P-Glykoproteinexpression untersucht. Die Negativkontrolle wurde mit Antikörpern gegen Glykophorin durchgeführt, welches nur auf hämatopoetischen Stammzellen nachzuweisen ist. (73) Schmitz G, Rothe G Grundlagen der Durchflußzytometrie Durchflußzytometrie in der klinischen Zelldiagnostik:3-48 Schattauer, 1996 |
Ein Verweis auf die Quelle fehlt. Auch gibt es in der untersuchten Arbeit keinen Verweis auf Schmitz & Rothe (1996). |
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| [19.] Jus/Fragment 029 01 - Diskussion Bearbeitet: 17. May 2014, 19:01 Hindemith Erstellt: 16. May 2014, 13:47 (Hindemith) | Fragment, Gesichtet, Jus, KomplettPlagiat, SMWFragment, Schröder 2004, Schutzlevel sysop |
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| Untersuchte Arbeit: Seite: 29, Zeilen: 1ff (komplett) |
Quelle: Schröder 2004 Seite(n): 51, Zeilen: 1ff |
|---|---|
| 4 Ergebnisse
4.1 Langzeitinkubationen 4.1.1 Cado ES–1 A) Langzeitinkubation von 24 bis 96 Stunden mit Daunorubicin auf Cado ES-1
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4. Ergebnisse
4.1. Langzeitinkubationen 4.1.1. Cado ES–1 A) Langzeitinkubation von 24 bis 96 Stunden mit DaunoXome® auf Cado ES-1
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Ein Verweis auf die Quelle fehlt. |
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| [20.] Jus/Fragment 030 04 - Diskussion Bearbeitet: 17. May 2014, 19:01 Hindemith Erstellt: 16. May 2014, 19:34 (Hindemith) | Fragment, Gesichtet, Jus, SMWFragment, Schröder 2004, Schutzlevel sysop, Verschleierung |
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| Untersuchte Arbeit: Seite: 30, Zeilen: 4-8 |
Quelle: Schröder 2004 Seite(n): 52, Zeilen: 1-5 |
|---|---|
| Die horizontale Markierung bei 50% stellt die Prozentmarke dar, die der GI50 (GI = Growth-Inhibition) entspricht.
Die GI50 ist diejenige Konzentration des Zytostatikums bei der die Anzahl der vitalen Zellen im Vergleich zur mitgeführten Kontrolle auf 50% reduziert wurde. Hier wurde die GI50 graphisch ermittelt: |
Die schwarze Linie bei 50% stellt die Prozentmarke dar, die der GI50 (GI = Growth- Inhibition) entspricht.
Die GI50 ist diejenige Konzentration des Zytostatikums bei der die Anzahl der vitalen Zellen im Vergleich zur mitgeführten Kontrolle auf 50% reduziert wurde. Hier wurde die GI50 graphisch ermittelt: |
Ein Verweis auf die Quelle fehlt. |
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| [21.] Jus/Fragment 023 01 - Diskussion Bearbeitet: 17. May 2014, 16:30 Singulus Erstellt: 16. May 2014, 09:58 (Hindemith) | Fragment, Gesichtet, Jus, SMWFragment, Schröder 2004, Schutzlevel sysop, Verschleierung |
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| Untersuchte Arbeit: Seite: 23, Zeilen: 1ff (komplett) |
Quelle: Schröder 2004 Seite(n): 44, Zeilen: 6ff |
|---|---|
| 3.4.2 Inkubation der Zellen mit den Zytostatika
72 Stunden nach Aussiedeln der Zellen wurde das RPMI – Medium aus den Vertiefungen mit Pasteurpipette und Vakuumpumpe vorsichtig abgesaugt, ohne den Zellrasen zu beschädigen, und anschließend durch 100μl neues Medium mit der entsprechenden Daunorubicin oder Doxorubicin - Konzentration ersetzt. Die Verdünnungsreihen wurden vor jedem Experiment neu angesetzt. Dazu wurden die für die Versuchsreihe benötigte Menge an mit Zytostatikum versetztem Medium und das Mischungsverhältnis für jede Konzentration errechnet. Anschließend wurde Medium mit der entsprechenden Menge an Zytostatikum für jede Konzentration in einem sterilen Einmal-Röhrchen versetzt. Die Zelllinien VH-64, STA-ET-1 und STA-ET-2.1 zeigten schon eine deutliche Verringerung der Zellzahl bei niedrigeren Konzentrationen der Zytostatika als Cado ES- 1, so dass die Verdünnungsreihen hier zugunsten niedrigerer Konzentrationen verändert wurden. Auf einer 96-Loch-Platte hatten jeweils eine Verdünnungsreihe für Daunorubicin und Doxorubicin mit n = 4 Ansätzen pro Konzentration Platz. Außerdem wurden pro Platte 8 Wells mit Medium als Kontrolle mitgeführt. |
3.4.2. Inkubation der Zellen mit den Zytostatika
72 Stunden nach Aussiedeln der Zellen wurde das RPMI – Medium aus den Vertiefungen mit Pasteurpipette und Vakuumpumpe vorsichtig abgesaugt, um den Zellrasen nicht zu beschädigen, und anschließend durch 100μl neues Medium mit der entsprechenden DaunoXome®- oder Caelyx®- Konzentration ersetzt. Die Verdünnungsreihen wurden vor jedem Experiment neu angesetzt. Dazu wurden die für die Versuchsreihe benötigte Menge an mit Zytostatikum versetztem Medium und das Mischungsverhältnis für jede Konzentration errechnet. Anschließend wurde Medium mit der entsprechenden Menge an Zytostatikum für jede Konzentration in einem sterilen Einmal-Röhrchen versetzt. Die Zelllinien VH-64, STA-ET-1 und STA-ET-2.1 zeigten schon eine deutliche Verringerung der Zellzahl bei niedrigeren Konzentrationen der Zytostatika als Cado- ES-1, so dass die Verdünnungsreihen hier zugunsten niedrigerer Konzentrationen verändert wurden. Auf einer 96-Loch-Platte hatten jeweils eine Verdünnungsreihe für DaunoXome® und Caelyx® mit n = 4 Ansätzen pro Konzentration Platz. Außerdem wurden pro Platte 8 Wells mit Medium als Kontrolle mitgeführt. |
Ein Verweis auf die Quelle fehlt. |
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| [22.] Jus/Fragment 064 01 - Diskussion Bearbeitet: 17. May 2014, 16:29 Singulus Erstellt: 16. May 2014, 19:42 (Hindemith) | Fragment, Gesichtet, Jus, KomplettPlagiat, SMWFragment, Schröder 2004, Schutzlevel sysop |
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| Untersuchte Arbeit: Seite: 64, Zeilen: 1-4 |
Quelle: Schröder 2004 Seite(n): 79, Zeilen: 1-4 |
|---|---|
| Der Effekt auf die Überlebensrate der Zellen veränderte sich ab 48 Stunden Nachinkubationszeit nicht mehr wesentlich, die GI50 für 48 bis 96 Stunden lagen in allen 4 Versuchsabschnitten sehr eng beieinander. Die größten Unterschiede waren bei 24 Stunden Nachinkubationszeit festzustellen. | Der Effekt auf die Überlebensrate der Zellen veränderte sich ab 48 Stunden Nachinkubationszeit nicht mehr wesentlich, die GI50 für 48 – 96 Stunden lagen in allen 4 Versuchsabschnitten sehr eng beieinander.
Die größten Unterschiede waren bei 24 Stunden Nachinkubationszeit festzustellen. |
Ein Verweis auf die Quelle fehlt. |
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| [23.] Jus/Fragment 086 01 - Diskussion Bearbeitet: 17. May 2014, 16:28 Singulus Erstellt: 16. May 2014, 07:12 (Hindemith) | Fragment, Gesichtet, Jus, SMWFragment, Schröder 2004, Schutzlevel sysop, Verschleierung |
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| Untersuchte Arbeit: Seite: 86, Zeilen: 1-7 |
Quelle: Schröder 2004 Seite(n): 123, Zeilen: 1ff |
|---|---|
| 5.5 Einfluss der Multidrug Resistance (MDR) auf die Überlebensrate der Zellen
Um die unterschiedliche Zytotoxizität auf den verschiedenen Zelllinien zu beurteilen, wurde in einer parallelen Arbeit die PGP- vermittelte MDR bestimmt. Die hier verwendeten Zelllinien unterschieden sich in ihrer PGP - Expression (siehe 4.7.) und in ihrem Ansprechen gegenüber der Anthrazykline (siehe 4.2. und 4.3.). Die Zelllinie Cado ES-1 zeigte mit 60,3% gegenüber 2,0% bei VH-64, 2,1% bei STAET- 1 und 20,3% bei STA-ET-2.1 die höchste PGP- Expression. |
5.6. Einfluss der Multidrug Resistance (MDR) auf die Überlebensrate der Zellen
Um die unterschiedliche Zytotoxizität auf den verschiedenen Zelllinien zu beurteilen, wurde die PGP- vermittelte MDR bestimmt. Die hier verwendeten Zelllinien unterschieden sich in ihrer PGP - Expression (siehe 4.7.) und in ihrem Ansprechen gegenüber der Anthrazykline (siehe 4.2. und 4.3.). Die Zelllinie Cado-ES-1 zeigte mit 60,3% gegenüber 1,96% bei VH-64, 2,13% bei STA-ET-1 und 20,31% bei STA-ET-2.1 die höchste PGP- Expression. |
Ein Verweis auf die Quelle fehlt. Man beachte, dass es das Kapitel 4.7. in der untersuchten Arbeit nicht gibt, in der Quelle aber schon. Dies kann als Indiz für eine Übernahme im Copy-Paste Stil gesehen werden. |
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| [24.] Jus/Fragment 020 01 - Diskussion Bearbeitet: 17. May 2014, 16:26 Singulus Erstellt: 15. May 2014, 21:12 (Hindemith) | Fragment, Gesichtet, Jus, KomplettPlagiat, SMWFragment, Schröder 2004, Schutzlevel sysop |
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| Untersuchte Arbeit: Seite: 20, Zeilen: 1ff (komplett) |
Quelle: Schröder 2004 Seite(n): 41, 42, Zeilen: 41: 16ff; 42: 1ff |
|---|---|
| VH-64: montags Zellsuspension : Medium = 1:25, freitags Zellsuspension: Medium = 1:15
Cado ES-1: montags und freitags je nach Wachstumsverhalten Zellsuspension: Medium = 1:6 oder 1:8 STA-ET-1: montags und freitags Zellsuspension : Medium = 1:10 STA-ET-2.1: montags und freitags Zellsuspension : Medium = 1:4 3.3.4 Vorbereiten der Platten Bevor die Zellen ausgesiedelt werden konnten, mussten die 96-Loch-Platten mit Kollagen beschichtet werden. Dazu wurden 50μl einer aus Collagen 1TypR (4mg/ml) und 0,1M Essigsäure bestehenden Lösung in jede Vertiefung pipettiert und unter laufender Sterilbank getrocknet. 3.3.5 Aussiedeln der Zellen auf 96-Well-Platten Nach Trypsinisierung und Resuspensierung in 5ml RPMI - Medium wurden 100μl des Fläschcheninhalts abgenommen, in 10ml isotone Elektrolyt-Lösung gegeben und im Zellzähler gezählt. Für die Versuche wurden entsprechend der Wachstumscharakteristik Zellsuspensionen mit 2500 - 5000 Zellen/100μl für Cado ES-1, 1500 – 4000 Zellen/100μl für STA-ET-1, 5000 Zellen/100μl für STA-ET-2.1 und 1500 – 2000 Zellen/100μl für VH-64 hergestellt. In jede Vertiefung wurden 100μl dieser Suspensionen pipettiert. |
VH-64: montags Zellsuspension : Medium = 1:25, freitags Zellsuspension : Medium = 1:15
Cado ES-1: montags und freitags je nach Wachstumsverhalten Zellsuspension : Medium = 1:6 oder 1:8 STA-ET-1: montags und freitags Zellsuspension : Medium = 1:10 STA-ET-2.1: montags und freitags Zellsuspension : Medium = 1:4 3.3.4. Vorbereiten der Platten Bevor die Zellen ausgesiedelt werden konnten, mussten die 96-Loch-Platten mit Kollagen beschichtet werden. [Seite 42] Dazu wurden 50μl einer aus Collagen 1TypR (4mg/ml) und 0,1M Essigsäure bestehenden Lösung in jede Vertiefung pipettiert und unter laufender Sterilbank getrocknet. 3.3.5. Aussiedeln der Zellen auf 96-Well-Platten Nach Trypsinisierung und Resuspendierung in 5ml RPMI - Medium wurden 100μl des Fläschcheninhalts abgenommen, in 10ml isotone Elektrolyt-Lösung gegeben und im Zellzähler gezählt. Für die Versuche wurden entsprechend der Wachstumscharakteristik Zellsuspensionen mit 2500 - 5000 Zellen/100μl für Cado ES-1, 1500 – 4000 Zellen/100μl für STA-ET-1, 5000 Zellen/100μl für STA-ET-2.1 und 1500 – 2000 Zellen/100μl für VH-64 hergestellt. In jede Vertiefung wurden 100μl dieser Suspensionen pipettiert. |
Ein Verweis auf die Quelle fehlt. |
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| [25.] Jus/Fragment 018 01 - Diskussion Bearbeitet: 17. May 2014, 16:24 Singulus Erstellt: 15. May 2014, 20:52 (Hindemith) | Fragment, Gesichtet, Jus, KomplettPlagiat, SMWFragment, Schröder 2004, Schutzlevel sysop |
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| Untersuchte Arbeit: Seite: 18, Zeilen: 1ff (komplett) |
Quelle: Schröder 2004 Seite(n): 40, Zeilen: 1ff |
|---|---|
c) STA-ET-1
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c) STA-ET-1
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Ein Verweis auf die Quelle fehlt. |
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| [26.] Jus/Fragment 092 01 - Diskussion Bearbeitet: 17. May 2014, 15:47 Singulus Erstellt: 16. May 2014, 06:49 (Hindemith) | Fragment, Gesichtet, Jus, SMWFragment, Schröder 2004, Schutzlevel sysop, Verschleierung |
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| Untersuchte Arbeit: Seite: 92, Zeilen: 1-14 |
Quelle: Schröder 2004 Seite(n): 139, Zeilen: 1-6, 9-16 |
|---|---|
| 6 Zusammenfassung
Es wurde eine systematische In-vitro-Beurteilung der Wirksamkeit der bewährten Zytostatika Daunorubicin und Doxorubicin aus der Gruppe der Anthrazykline auf Ewingsarkom-Zelllinien durchgeführt. Die Wirkstoffe wurden auf den vier gut charakterisierten Zelllinien Cado-ES-1, VH-64, STA-ET-1 und STA-ET-2.1 in unterschiedlichen Konzentrationen für unterschiedlich lange Zeiträume inkubiert. Nach der Inkubation mit unterschiedlichen Konzentrationen wurde mittels MTT-Assay die Überlebensrate bestimmt. Dabei stellte sich heraus, dass Cado-ES-1 die gegenüber den Anthrazyklinen resistenteste Zelllinie war und zum Erreichen der GI50 deutlich höhere Zytostatikakonzentrationen notwendig waren als bei den übrigen Zelllinien. Bei der Untersuchung der P-Glykoprotein-Expression mittels Durchflusszytometrie ergab sich, dass Cado-ES-1 mit 60,3% gegenüber 2,0% bei VH-64, 2,1% bei STA-ET-1 und 20,3% bei STA-ET-2.1 die höchste Expression aufwies. |
6. Zusammenfassung
Es wurde eine systematische In-vitro-Beurteilung der Wirksamkeit der liposomalen Anthrazykline DaunoXome® und Caelyx® auf Ewingsarkom-Zelllinien durchgeführt. Die Wirkstoffe wurden auf den vier gut charakterisierten Zelllinien Cado-ES-1, VH-64, STA-ET-1 und STA-ET-2.1 in unterschiedlichen Konzentrationen für unterschiedlich lange Zeiträume inkubiert. [...] Anschließend wurde mittels MTT-Test die Stoffwechselaktivität der überlebenden Zellen bestimmt. Dabei stellte sich heraus, dass Cado-ES-1 die gegenüber den Anthrazyklinen resistenteste Zelllinie war und zum Erreichen der GI50 5-10x höhere Zytostatikakonzentrationen notwendig waren als bei den übrigen Zelllinien. Bei der Untersuchung der P-Glykoprotein-Expression mittels Durchflusszytometrie ergab sich, dass Cado-ES-1 mit 60,3% gegenüber 1,96% bei VH-64, 2,13% bei STAET- 1 und 20,31% bei STA-ET-2.1 die höchste Expression aufwies, so dass dieses einen Erklärungsansatz für die erhöhte Resistenz bieten könnte. |
Ein Verweis auf die Quelle fehlt. |
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| [27.] Jus/Fragment 016 01 - Diskussion Bearbeitet: 17. May 2014, 15:45 Singulus Erstellt: 15. May 2014, 20:43 (Hindemith) | Fragment, Gesichtet, Jus, KomplettPlagiat, SMWFragment, Schröder 2004, Schutzlevel sysop |
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| Untersuchte Arbeit: Seite: 16, Zeilen: 1ff (komplett) |
Quelle: Schröder 2004 Seite(n): 38, Zeilen: 1ff |
|---|---|
| 3.2 Verwendete Zelllinien
3.2.1 Charakteristika der Zelllinien Für die Untersuchungen wurden 4 gut charakterisierte Zelllinien der Ewing-Familie gewählt, die sich bezüglich ihres biologischen Wachstumsverhaltens, ihrer Empfindlichkeit auf verschiedene Einflüsse und der Resistenz gegenüber den Zytostatika unterscheiden (51). Tab. 3.2.1. Die Zelllinien und ihre Charakteristika
Die Zellen stammten aus dem Labor für experimentelle Orthopädie in Münster und wurden von Dr. rer. nat. F. van Valen zur Verfügung gestellt. (51) Van Valen F Ewing`s Sarcoma Family of Tumors Human Cell Culture 1:55-85, 1999 |
3.2 Verwendete Zelllinien
3.2.1. Charakteristika der Zelllinien Für die Untersuchungen wurden 4 gut charakterisierte Zelllinien der Ewing-Familie gewählt, die sich bezüglich ihres biologischen Wachstumsverhaltens, ihrer Empfindlichkeit auf verschiedene Einflüsse und der Resistenz gegenüber den Zytostatika unterscheiden. Tab. 3.2.1. Die Zelllinien und ihre Charakteristika
Die Zellen stammten aus dem Labor für experimentelle Orthopädie in Münster und wurden von Dr. rer. nat. F. van Valen zur Verfügung gestellt. |
Ein Verweis auf die Quelle fehlt. |
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| [28.] Jus/Fragment 017 01 - Diskussion Bearbeitet: 17. May 2014, 15:43 Singulus Erstellt: 15. May 2014, 20:46 (Hindemith) | Fragment, Gesichtet, Jus, KomplettPlagiat, SMWFragment, Schröder 2004, Schutzlevel sysop |
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| Untersuchte Arbeit: Seite: 17, Zeilen: 1ff (komplett) |
Quelle: Schröder 2004 Seite(n): 39, Zeilen: 1ff |
|---|---|
| Abb. 3.2.1. Lichtmikroskopische Aufnahmen der vier Zelllinien
a) Cado ES-1
b) VH-64 |
Abb.3.2.1. Lichtmikroskopische Aufnahmen der vier Zelllinien
a) Cado ES-1
b) VH-64 |
Ein Verweis auf die Quelle fehlt, obwohl es sich um die gleichen Aufnahmen handelt. |
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| [29.] Jus/Fragment 019 01 - Diskussion Bearbeitet: 17. May 2014, 15:42 Singulus Erstellt: 15. May 2014, 20:55 (Hindemith) | Fragment, Gesichtet, Jus, KomplettPlagiat, SMWFragment, Schröder 2004, Schutzlevel sysop |
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| Untersuchte Arbeit: Seite: 19, Zeilen: 1ff (komplett) |
Quelle: Schröder 2004 Seite(n): 40, 41, Zeilen: 40: 1-5; 41: 1-15 |
|---|---|
| 3.3 Zellkulturpflege
3.3.1 Auftauen der Zellen Die Zellen wurden im Einfrier-Röhrchen bei 37oC im Wasserbad aufgetaut, anschließend in 5ml RPMI – Medium überführt und bei 1200 rpm für 5 min bei 4oC zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen, das Zellpellet in 8ml RPMI-Medium mit 10% FCS aufgenommen und anschließend in kollagenbeschichtete 25T-Fläschchen überführt. 3.3.2 Einfrieren der Zellen Die Zellen wurden in einem Gemisch aus 10% DMSO, 10% FCS, 80% RPMI – Medium resuspendiert und zunächst von Raumtemperatur um 1oC pro Minute auf – 80oC abgekühlt und dann in flüssigem Stickstoff bei –198oC eingefroren. 3.3.3 Passagieren der Zellen Die Zellen wurden vor dem Passagieren vom Boden der Zellkulturflasche gelöst. Dazu wurde zunächst das Medium abgesaugt und anschließend der Zellrasen gleichmäßig mit 1ml Trypsin-EDTA Lösung (1x konzentriert) bedeckt. Nach ein bis zwei Minuten wurde die überstehende Lösung bis auf wenige μl abgesaugt und die Zellkulturflasche für einige Minuten in den Inkubator gestellt. Danach wurden die abgelösten Zellen in 5ml Medium resuspendiert. Entsprechend ihres Wachstumsverhaltens wurden die Zellen 2 mal pro Woche passagiert: |
3.3. Zellkulturpflege
3.3.1. Auftauen der Zellen Die Zellen wurden im Einfrier-Röhrchen bei 37oC im Wasserbad aufgetaut, anschließend in 5ml RPMI – Medium überführt und bei 1200rpm für 5 min bei 4oC zentrifugiert. [Seite 41] Der Überstand wurde verworfen, das Zellpellet in 8ml RPMI – Medium mit 10% FCS aufgenommen und anschließend in kollagenbeschichtete 25T-Fläschchen überführt. 3.3.2. Einfrieren der Zellen Die Zellen wurden in einem Gemisch aus 10% DMSO, 10% FCS, 80% RPMI – Medium resuspendiert und zunächst von Raumtemperatur um 1oC pro Minute auf – 80oC abgekühlt und dann in flüssigem Stickstoff bei –198oC eingefroren. 3.3.3. Passagieren der Zellen Die Zellen wurden vor dem Passagieren vom Boden der Zellkulturflasche gelöst. Dazu wurde zunächst das Medium abgesaugt und anschließend der Zellrasen gleichmäßig mit 1ml Trypsin – EDTA Lösung (1x konzentriert) bedeckt. Nach ein bis zwei Minuten wurde die überstehende Lösung bis auf wenige μl abgesaugt und die Zellkulturflasche für einige Minuten in den Inkubator gestellt. Danach wurden die abgelösten Zellen in 5ml Medium resuspendiert. Entsprechend ihres Wachstumsverhaltens wurden die Zellen 2 mal pro Woche passagiert: |
Ein Verweis auf die Quelle fehlt. |
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| [30.] Jus/Fragment 093 01 - Diskussion Bearbeitet: 17. May 2014, 15:40 Singulus Erstellt: 15. May 2014, 21:52 (Hindemith) | Fragment, Gesichtet, Jus, KomplettPlagiat, SMWFragment, Schröder 2004, Schutzlevel sysop |
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| Untersuchte Arbeit: Seite: 93, Zeilen: 1-9 |
Quelle: Schröder 2004 Seite(n): 141, Zeilen: 1-9 |
|---|---|
| Die Prognose der Ewing-Tumoren ist mit Einführung der systemischen Polychemotherapie deutlich günstiger geworden. Die 5-Jahres-Überlebensrate konnte auf 50-75% angehoben werden.
Die WHO hat im Rahmen des NCP die Familie der Ewingtumoren in eine Kategorie eingeteilt, die durch eine verlängerte durchschnittliche Überlebenszeit charakterisiert ist, wenn die Behandlung frühzeitig erfolgt. Trotzdem fehlen bisher systematische In-vitro-Versuche zur Evaluierung sowohl klinisch bereits etablierter Substanzen als auch neuer Substanzen, die neue Möglichkeiten für eine erfolgreiche Chemotherapie bieten könnten. |
Die Prognose der Ewing-Tumoren ist mit Einführung der systemischen Polychemotherapie deutlich günstiger geworden. Die 5-Jahres-Überlebensrate konnte auf 50-65% angehoben werden.
Die WHO hat im Rahmen des NCP die Familie der Ewingtumoren in eine Kategorie eingeteilt, die durch eine verlängerte durchschnittliche Überlebenszeit charakterisiert ist, wenn die Behandlung frühzeitig erfolgt. Trotzdem fehlen bisher systematische In-vitro-Versuche zur Evaluierung sowohl klinisch bereits etablierter Substanzen als auch neuer Substanzen, die neue Möglichkeiten für eine erfolgreiche Chemotherapie bieten könnten. |
Die letzte Seite der Zusammenfassung ist ohne Quellenverweis übernommen. |
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| [31.] Jus/Fragment 004 01 - Diskussion Bearbeitet: 17. May 2014, 15:37 Singulus Erstellt: 14. May 2014, 23:36 (Hindemith) | Fragment, Gesichtet, Jus, SMWFragment, Schröder 2004, Schutzlevel sysop, Verschleierung |
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| Untersuchte Arbeit: Seite: 4, Zeilen: 1-6 |
Quelle: Schröder 2004 Seite(n): 10, 11, Zeilen: 10: 18-21 ; 11: 11-12 |
|---|---|
| 1.1.6 Therapie und Prognose
Mit alleiniger Lokaltherapie liegt die 5-Jahres-Überlebensrate unter 10%, da rasch Metastasen auftreten. Die Prognose der lokalisierten Erkrankungen konnte durch die Einführung der systemischen Polychemotherapie auf 50-75% angehoben werden. Das EURO-E.W.I.N.G. 99 Chemotherapie-Protokoll sieht für alle Patienten zunächst eine Induktion aus 6 Blöcken VIDE (Vincristin, Ifosfamid, Doxorubicin, Etoposid) vor. |
1.1.8. Therapie und Prognose
Mit alleiniger Lokaltherapie liegt die 5-Jahres-Überlebensrate unter 10%, da rasch Metastasen auftreten. Die Prognose der lokalisierten Erkrankungen konnte durch die Einführung der systemischen Polychemotherapie auf 50-65% angehoben werden. [Seite 11] Das EURO-E.W.I.N.G. 99 Protokoll sieht für alle Patienten zunächst eine Induktion aus 6 Blöcken VIDE (Vincristin, Ifosfamid, Doxorubicin, Etoposid) vor, [...] |
Ein Verweis auf die Quelle fehlt. |
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| [32.] Jus/Fragment 002 21 - Diskussion Bearbeitet: 17. May 2014, 15:35 Singulus Erstellt: 14. May 2014, 23:03 (Hindemith) | Fragment, Gesichtet, Jus, KomplettPlagiat, SMWFragment, Schröder 2004, Schutzlevel sysop |
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| Untersuchte Arbeit: Seite: 2, Zeilen: Abbildung |
Quelle: Schröder 2004 Seite(n): 6, Zeilen: Abbildung |
|---|---|
| Abb. 1.1.1. Histologie des Ewing-Sarkoms
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Abb.1.1.1. Histologie des Ewing-Sarkoms
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Ein Verweis auf die Quelle fehlt. |
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| [33.] Jus/Fragment 077 01 - Diskussion Bearbeitet: 17. May 2014, 15:33 Singulus Erstellt: 14. May 2014, 22:59 (Hindemith) | Fragment, Gesichtet, Jus, KomplettPlagiat, SMWFragment, Schröder 2004, Schutzlevel sysop |
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| Untersuchte Arbeit: Seite: 77, Zeilen: 1-4 |
Quelle: Schröder 2004 Seite(n): 108, Zeilen: 5ff |
|---|---|
| 4.5.4 P-Glykoproteinexpression auf STA-ET-2.1
Abb. 4.5.4.
Die Messungen ergaben, dass die PGP-Expression auf STA-ET-2.1 20,31 % der Zellpopulation betrug. |
4.7.4. P-Glykoproteinexpression auf STA-ET-2.1
Abb.4.7.4.
Die Messungen ergaben, dass die PGP-Expression auf STA-ET-2.1 20,31 % der Zellpopulation betrug. |
Ein Verweis auf die Quelle fehlt. |
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| [34.] Jus/Fragment 075 01 - Diskussion Bearbeitet: 17. May 2014, 15:30 Singulus Erstellt: 14. May 2014, 22:51 (Hindemith) | Fragment, Gesichtet, Jus, KomplettPlagiat, SMWFragment, Schröder 2004, Schutzlevel sysop |
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| Untersuchte Arbeit: Seite: 75, Zeilen: 1-8 |
Quelle: Schröder 2004 Seite(n): 106, 107, Zeilen: 106: 5ff; 107: 1ff |
|---|---|
| 4.5 P-Glykoproteinexpression auf den Zelllinien
4.5.1 P-Glykoproteinexpression auf Cado ES-1 Abb. 4.5.1.
Die dunkelgraue Kurve, welche die Bindung des Fluoreszenz-markierten Antikörpers gegen PGP darstellt, ist gegenüber der Negativkontrolle, die als hellgrau unterlegtes Histogramm dargestellt ist, nach rechts verschoben. Die Messungen ergaben, dass die PGP-Expression auf dieser Zelllinie 60,3% der Zellpopulation betrug. |
4.7. P-Glykoproteinexpression auf den Zelllinien
4.7.1. P-Glykoproteinexpression auf Cado ES-1 Abb.4.7.1.
[Seite 107] Die dunkelgraue Kurve, welche die Bindung des Fluoreszenz-markierten Antikörpers gegen PGP darstellt, ist gegenüber der Negativkontrolle, die als hellgrau unterlegtes Histogramm dargestellt ist, nach rechts verschoben. Die Messungen ergaben, dass die PGP-Expression auf dieser Zelllinie 60,3% der Zellpopulation betrug. |
Ein Verweis auf die Quelle fehlt. |
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| [35.] Jus/Fragment 002 01 - Diskussion Bearbeitet: 17. May 2014, 15:29 Singulus Erstellt: 14. May 2014, 21:38 (Hindemith) | Fragment, Gesichtet, Jus, SMWFragment, Schröder 2004, Schutzlevel sysop, Verschleierung |
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| Untersuchte Arbeit: Seite: 2, Zeilen: 1-7 |
Quelle: Schröder 2004 Seite(n): 3, Zeilen: 7-13 |
|---|---|
| 1.1.3 Molekulargenetik
Für das Ewing-Sarkom ist eine charakteristische chromosomale Aberration beschrieben, die bereits seit den 80er Jahren bekannt ist. Es handelt sich dabei um ein Rearrangement des Chromosoms 22, am bekanntesten ist eine Translokation zwischen den langen Armen der Chromosomen 11 und 22 (15, 50). Konventionelle zytogenetische Untersuchungen zeigten, dass Ewing-Tumoren in etwa 85% eine reziproke Translokation t(11;22) (q24;q12) aufweisen. (15) Dockhorn-Dworniczak B, Schäfer KL, Valen F et al Molekulargenetischer Nachweis der t(11;22)(q24;q12)-Translokation in Ewing-Sarkomen und malignen peripheren neuroektodermalen Tumoren (MPNT) Pathologe 15: 103-112,1994 (50) Turc-Carel C, Philipp I, Berger MP, Philipp T, Lenoir CM Chromosome Study of Ewing`s Sarcoma (ES) Cell Lines. Consistency of a Reciprokal Translocation t(11;22)(q24;q12) Cancer Genet Cytogenet 12: 1-19, 1984 |
1.1.3. Molekulargenetik
In den 80er Jahren wurde zum ersten Mal eine charakteristische chromosomale Aberration beim Ewing-Sarkom beschrieben. Es handelt sich dabei um ein Rearrangement des Chromosoms 22, am bekanntesten ist eine Translokation zwischen den langen Armen der Chromosomen 11 und 22 (18,80). Konventionelle zytogenetische Untersuchungen zeigten, dass Ewing-Tumoren in etwa 85% eine reziproke Translokation t(11;22) (q24;q12) aufweisen. (18) Dockhorn-Dworniczak B, Schäfer KL, Dantcheva R, Blasius S, van Valen F, Burdach S, Winkelmann W, Jürgens H, Böcker W Molekulargenetischer Nachweis der t(11;22)(q24;q12)-Translokation in Ewing-Sarkomen und malignen peripheren neuroektodermalen Tumoren (MPNT) Pathologe 15:103-12, 1994 (80) Turc-Carel C, Philip I, Berger MP, Philip T, Lenoir CM Chromosome study of Ewing’s sarcoma (ES) cell lines. Consistency of a reciprocal translocation t(11:22)(q24:q12) Cancer Genet Cytogenet 12:1-19, 1984 |
Ein Verweis auf die Quelle fehlt. |
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| [36.] Jus/Fragment 001 09 - Diskussion Bearbeitet: 17. May 2014, 15:27 Singulus Erstellt: 14. May 2014, 21:33 (Hindemith) | Fragment, Gesichtet, Jus, SMWFragment, Schröder 2004, Schutzlevel sysop, Verschleierung |
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|
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| Untersuchte Arbeit: Seite: 1, Zeilen: 8-18 |
Quelle: Schröder 2004 Seite(n): 1, Zeilen: 20ff |
|---|---|
| 1.1.2 Histogenese
Die eigentliche Herkunft des Sarkoms ist bis heute nicht endgültig geklärt, zahlreiche unterschiedliche Zellen wurden als Stammzellen angenommen (14, 28). Eine vollständige Neubewertung hat die Histogenese des Ewing-Sarkoms erfahren, seit entdeckt wurde, dass es zytogenetische Gemeinsamkeiten mit dem peripheren malignen neuroektodermalen Tumor (PNET) und dem damit eng verwandten kleinzelligen Tumor der Brustwand, dem sogenannten Askin Tumor aufweist. Bei der Untersuchung von Ewing-Sarkomzellen in Kultur kann man spontane oder induzierte neurale Differenzierungsmuster beobachten. Elektronenmikroskopisch entwickeln die Zellen typische Merkmale neuronaler Zellen wie Zytoplasmaausläufer mit Mikrofilamenten und neurosekretorische Granula (5). (5) Beijnen JH, van der Nat JM, Lbadie RP, Underberg WJM Decomposition of Mitomycin and Anthracycline Cytostatics in Cell Culture Medium Anticancer Research 6:39-44, 1986 (14) Dickman PS, Liotta LA, Triche TJ Ewing´s Sarcoma. Characterization in Established Cultures and Evidence of its Histogenesis LAB Invest 47:375-382, 1982 (28) Kadin ME, Bensch KG On the Origin of Ewing´s Tumor Cancer 27:257-272, 1971 |
1.1.2. Histogenese
Die eigentliche Herkunft des Sarkoms ist bis heute nicht endgültig geklärt, zahlreiche unterschiedliche Zellen wurden als Stammzellen angenommen. So wurde neben vaskulärem und myelogenem Ursprung (43) auch eine Abstammung des Tumors von undifferenzierten mesenchymalen Zellen bzw. retikuloendothelialen Zellen des Knochenmarks diskutiert (17). Eine vollständige Neubewertung hat die Histogenese des Ewing-Sarkoms erfahren, seit entdeckt wurde, dass es zytogenetische Gemeinsamkeiten mit dem peripheren [Seite 2] malignen neuroektodermalen Tumor (PNET) und dem damit eng verwandten kleinzelligen Tumor der Brustwand, dem sogenannten Askin Tumor aufweist. Bei der Untersuchung von Ewing-Sarkomzellen in Kultur kann man spontane oder induzierte neurale Differenzierungsmuster beobachten. Elektronenmikroskopisch entwickeln die Zellen Zytoplasmaausläufer mit Mikrofilamenten und neurosekretorischen Granula. (17) Dickman PS, Liotta LA, Triche TJ Ewing’s Sarcoma. Characterization in established cultures and evidence of its histogenesis LAB Invest 47:375-82, 1982 (43) Kadin ME, Bensch KG On the Origin of Ewing’s Tumor Cancer 27:257-72, 1971 |
Ein Verweis auf die Quelle fehlt. |
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