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Lcg/Fragment 043 01

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Typus
Verschleierung
Bearbeiter
Hindemith
Gesichtet
Yes.png
Untersuchte Arbeit:
Seite: 43, Zeilen: 1ff (komplett)
Quelle: Mallig 2006
Seite(n): 63, 64, Zeilen: 63: 18ff; 64: 1ff
4.10.2 Analyse der Lymphozyten in der Milzsuspension

Um die verschiedenen Subpopulationen der Lymphozyten in der Milzsuspension messen zu können, macht man sich ihre spezifischen Zelloberflächenantigene zunutze. So lässt dich das CD4-Antigen der T-Helferzellen und das Ly49-Antigen (CD56-Antigen beim Menschen) der natürlichen Killerzellen durch an anti-Maus- CD4-Antikörper und anti-Ly49-Antikörper gekoppeltes Fluorescein Isothiocyanat (FITC) detektieren. Das CD8-Antigen der zytotoxischen T-Zellen lässt sich über an anti-Maus-CD8-Antikörper gekoppeltes Phycoerythrin (PE) identifizieren.

Aufbereitung der Proben

Um störende Erytrozyten zu hämolysieren wurde die Milzsuspension mit 14ml hypotoner Lyselösung (Ansatz siehe Anhang) versetzt und für 15 min im Kühlschrank inkubiert. Nach Zentrifugation (Labofuge 400R, Heraeus Instruments, Hanau) bei 4°C und 4500 rpm für 10 min wurde der Überstand verworfen und die Zellen mit 1.000 μl PBS resuspendiert. Nach erneuter Zentrifugation bei 4°C und 4500 rpm für 5 min wurde der Überstand erneut verworfen und die Zellen mit 45 μl PBS versetzt und auf drei FACS Röhrchen (Sarstedt, Nümbrecht) zu je 15 ml aufgeteilt. Ein Röhrchen diente der Bestimmung des Leerwerts. Auf die anderen wurden je 5 μl der oben beschriebenen mit Fluoreszenzfarbstoffen konjugierten Antikörper verteilt (Tabelle 8). Die Proben wurden für 30 Minuten im Kühlschrank bei 4°C inkubiert. Anschließend wurden 1000 μl PBS zugefügt, fünf Minuten bei 4°C mit 4500 rpm zentrifugiert und der Überstand verworfen. Diese Waschprozedur wurde einmal wiederholt. Schließlich wurden die Proben nach Zugabe von 150 μl PBS der FACS-Analyse unterzogen.

4.4.4.1 Analyse der Lymphozyten in der Milzsuspension

Um die verschiedenen Subpopulationen der Lymphozyten in der Milzsuspension messen zu können, machte man sich ihre spezifischen Zelloberflächenantigene zunutze: das CD4-Antigen der T-Helferzellen, das CD8-Antigen der zytotoxischen T-Zellen und das Ly49-Antigen (CD56-Antigen beim Menschen) der natürlichen Killerzellen. Mit folgenden Fluoreszenzfarbstoffen konjugierte monoklonale Antikörper dienten zu ihrer Identifizierung: Mit Fluorescein Isothiocyanat (FITC), welches im grünen Fluoreszenzspektrum detektierbar ist, gekoppelte anti-Maus- CD4-Antikörper und anti-Ly49-Antikörper und mit im roten Fluoreszenzspektrum detektierbarem Phycoerythrin (PE) gekoppelte anti-Maus-CD8-Antikörper (BD Biosciences, Pharmingen, San Diego, USA).

[Seite 64]

Aufbereitung der Proben:

Um eine Hämolyse der die durchflusszytometrische Analyse störenden Erythrozyten zu erreichen,wurde die nach der Organentnahme auf Eis gelagerte Milzsuspension mit 14 ml hypotoner Lyselösung (Herstellung: siehe Anhang) versetzt und für 15 Minuten im Kühlschrank inkubiert. Danach folgte eine zehnminütige Zentrifugation (Labofuge 400R, Heraeus Instruments, Hanau) bei 4°C mit 450× g. Der Überstand wurde verworfen und die Zellen mit 1.000 μl PBS resuspendiert. Nach erneuter Zentrifugation bei 4°C und 450×g für fünf Minuten und Absaugen des Überstandes wurden die Zellen jeder Probe in 45 μl PBS resuspendiert und auf jeweils drei FACS-Röhrchen (Sarstedt, Nümbrecht) zu je 15 μl aufgeteilt.

Ein Röhrchen diente der Bestimmung des Leerwerts. Auf die anderen wurden je 5 μl der oben beschriebenen mit Fluoreszenzfarbstoffen konjugierten Antikörper wie in Tabelle 16 dargestellt, verteilt.

[...]

Die Proben wurden für 30 Minuten im Kühlschrank bei 4°C inkubiert. Danach wurden 1000 μl PBS hinzugegeben, fünf Minuten bei 4°C mit 450×g zentrifugiert und der Überstand verworfen. Diese Waschprozedur wurde einmal wiederholt. Schließlich wurden die Proben nach Zugabe von 150 μl PBS der durchflusszytometrischen Messung unterzogen.

Anmerkungen

Ein Verweis auf die Quelle fehlt.

Sichter
(Hindemith), Klgn

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