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Der Einfluss von HIV-1-Tat Peptiden auf die Angioneogenese und ihre mögliche Anwendung in der Therapie

von Dr. Mahmoud Ismail

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Statistik und Sichtungsnachweis dieser Seite findet sich am Artikelende
[1.] Mi/Fragment 030 01 - Diskussion
Zuletzt bearbeitet: 2014-08-30 14:27:57 WiseWoman
Fragment, Gesichtet, Huang 2002, Mi, SMWFragment, Schutzlevel sysop, Verschleierung

Typus
Verschleierung
Bearbeiter
Hindemith
Gesichtet
Yes.png
Untersuchte Arbeit:
Seite: 30, Zeilen: 1ff (komplett)
Quelle: Huang 2002
Seite(n): 14, Zeilen: 6ff
4.2.7 Nicht-denaturierende Gelelektrophorese

Die nicht-denaturierende Gelelektrophorese wurde mit dem Phast-System von Pharmacia durchgeführt. Es wurden Gradientengele von 4-15% Acrylamid genutzt. Folgende Laufbedingungen wurden gewählt: 300 Vh bei 10 V, 0,1 mA, 1 W, 4°C.

4.2.8 Dichtegradientenzentrifugation

Mit einem Gradientenmischer wurde ein kontinuierlicher Gradient von 10-40% Glycerin in Beckman SW40-Zentrifugenröhrchen gegossen. 0,3-0,5 ml Proben wurden auf den Gradienten geschichtet und bei 40 000 rpm im Beckman SW40-Rotor für 16 h bei 4°C zentrifugiert. Der Gradient wurde von oben nach unten in 600-800 μl Fraktionen aliquotiert. Die Proteine der Fraktionen wurden mit TCE präzipitiert.

4.2.9 SDS-PAGE Gelelektrophorese

Lösungen:

4 x Sammelgelpuffer: 250 mM Tris HCl pH 6,8, 0,8% SDS

4 x Trenngelpuffer: 150 mM Tris HCl, pH 8,8, 0,4% SDS

Elektrophoresepuffer: 25 mM Tris, 190 mM Glycerin, 0,1% SDS

Die Proben wurden in 4 x SDS-PAGE-Probenpuffer aufgenommen, 5 min bei 95°C im Heizblock erhitzt und anschließend 3 min bei 14000 rpm zentrifugiert. Um die Proteinmengen auszugleichen, erfolgte zuvor über die photometrische Absorptionsmessung bei 280 nm die Bestimmung der Proteinkonzentrationen. Für den Lauf durch das Sammelgel wurde eine Spannung von 70V angelegt und beim Übergang der Proteine ins Trenngel wurde die Spannung auf 140V erhöht. Die gesamte Elektrophorese dauerte, in Abhängigkeit der Gelkonzentration, 1-1,5 h.

4.2.10 Western Blot

Blotpuffer: 14,4 g Glycerin, 3,04 g Tris, auf 1 Liter H2O Waschpuffer (PBS-T): 140 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 1,8 mM KH2PO4, pH 7,3 und 0,1% Tween-20

2.2.15 SDS-PAGE Elektrophorese

Lösungen:

4 x Sammelgelpuffer: 250 mM Tris HCl pH 6,8, 0,8% SDS

4 x Trenngelpuffer: 150 mM Tris HCl, pH 8,8, 0,4% SDS

Elektrophoresepuffer: 25 mM Tris, 190 mM Glycerin, 0,1% SDS

Die Proben wurden in 4 x SDS-PAGE-Probenpuffer aufgenommen, 5 min bei 95°C im Heizblock erhitzt und anschließend 3 min bei 14000 rpm zentrifugiert. Um die Proteinmengen auszugleichen, wurden die Proben zuerst im Photometer bei der OD280 gemessen. Für den Lauf durch das Sammelgel wurde eine Spannung von 70V angelegt und beim Übergang der Proteine ins Trenngel wurde die Spannung auf 140V erhöht.

2.2.16 Nicht-denaturierende Gelelektrophorese

Nicht-denaturierende Gelelektrophorese wurde mit dem Phast-System von Pharmacia durchgeführt. Es wurden Gradientengele von 4-15% Acrylamid genutzt. Folgende Laufbedingungen wurden gewählt: 300 Vh bei 10 V, 0,1 mA, 1 W, 4°C.

2.2.17 Dichtegradientenzentrifugation

Mit einem Gradientenmischer wurde ein kontinuierlicher Gradient von 10-40% Glycerin in Beckman SW40-Zentrifugenröhrchen gegossen. 0,3-0,5 ml Proben wurden auf den Gradienten geschichtet und bei 40000 rpm im Beckman SW40-Rotor für 16 h bei 4°C zentrifugiert. Der Gradient wurde von oben nach unten in 600-800 μl Fraktionen aliquotiert. Die Proteine der Fraktionen wurden mit TCE präzipitiert.

2.2.18 Western Blot

Blotpuffer: 14,4 g Glycerin, 3,04 g Tris, auf 1 Liter H2O Waschpuffer (PBS-T): 140 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 1,8 mM KH2PO4, pH 7,3 und 0,1% Tween-20

Anmerkungen

Ein Verweis auf die Quelle fehlt.

Sichter
(Hindemith), WiseWoman


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Letzte Bearbeitung dieser Seite: durch Benutzer:WiseWoman, Zeitstempel: 20140830142849

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