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Mi/031

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Der Einfluss von HIV-1-Tat Peptiden auf die Angioneogenese und ihre mögliche Anwendung in der Therapie

von Dr. Mahmoud Ismail

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[1.] Mi/Fragment 031 01 - Diskussion
Zuletzt bearbeitet: 2014-08-25 19:17:25 Singulus
Fragment, Gesichtet, Huang 2002, Mi, SMWFragment, Schutzlevel sysop, Verschleierung

Typus
Verschleierung
Bearbeiter
Hindemith
Gesichtet
Yes.png
Untersuchte Arbeit:
Seite: 31, Zeilen: 1ff (komplett)
Quelle: Huang 2002
Seite(n): 15, Zeilen: 1-28
Nach der SDS-PAGE wurden die aufgetrennten Proteine elektrophoretisch (120 mA bei 4°C über Nacht oder 200mA bei Raumtemperatur 2h) auf Nitrocellelose-Membranen überführt und immunochemisch getestet. Die Membran wurde zuerst mit Ponceau S gefärbt und dann mit 5% Milch (in PBS-T) 1-2 h blockiert. Danach erfolgte die Inkubation mit dem geeigneten Antikörper (anti-c-Jun oder anti-SP1). Die Detektion der Proteine erfolgte mit dem BMChemiluminescence ECL-Kit nach der Vorschrift von Boehringer. Die Röntgenfilme (XDS, XAR von KODAK) wurden in dem Entwicklerautomat „Hyperprocessor“ (Amersham) entwickelt.

4.2.11 Immunpräzipitation (IP)

Mi 31a diss.png

Um unspezifische Bindungen zu beseitigen, wurden die Überstände (ca. 300 μl) der Zelllysate zunächst mit Protein A-Agarose (30 μl) vorinkubiert (1 h, 4°C, auf dem Schüttler). Nach dem Zentrifugieren (1 min 14000 rpm) wurden die Antikörper (1-3 μg anti-C2 oder anti-S4) zu den Überständen zugegeben und inkubiert (1 h, 4°C, auf dem Schüttler). Danach wurden zu dem Gemisch 60 μl Protein A-Agarose zugegeben und über Nacht bei 4°C unter Schütteln inkubiert. Nachdem [sic] Zentrifugieren (1 min 14000 rpm) wurden die Überstände vorsichtig mit einer Absaugpumpe entfernt. Anschließend wurde 1 ml IP-Puffer zugesetzt und 5 min bei 4°C geschüttelt. Dieser Schritt wurde 5-mal wiederholt. Anschließend wurden 20 μl Proben-Puffer zugegeben und 5 min gekocht. Nach dem Zentrifugieren wurden die Proben auf die SDS-Gele aufgetragen und dann der Western Blot mit dem anti-Flag Antikörper durchgeführt.

4.2.12 Bestimmung der Proteinkonzentration

Der Protein-Assay ist eine Modifikation der Proteinbestimmung nach Bradford (Bradford et al., 1976). Zu 200 μl Probe wurden 800 μl Bio-Rad-Lösung zugegeben und gut durchmischt. Für die Erstellung einer Eichkurve wurden BSA-Lösungen mit Konzentrationen von 2, 5, 10, [20 und 50 μg/ml vermessen.]

Nach der SDS-PAGE wurden die aufgetrennten Proteine elektrophoretisch (120 mA bei 4°C über Nacht oder 200mA bei RT 2h) auf Nitrocellelose-Membranen überführt und immunochemisch getestet. Die Membran wurde zuerst mit Ponceau S gefärbt und dann mit 5% Milch (in PBS-T) 1-2 h blockiert. Danach erfolgte die Inkubation mit dem geeigneten Antikörper. Die Detektion der Proteine erfolgte mit dem BM-Chemiluminescence ECL-Kit nach der Vorschrift von Boehringer. Die Röntgenfilme (XDS, XAR von KODAK) wurden in der Entwicklerautomaten „Hyperprocessor“ (Amersham) entwickelt.

2.2.19 Immunpräzipitation (IP)

Mi 31a source.png

Um unspezifische Bindungen zu beseitigen, wurden die Überstände (ca. 300 μl) der Zelllysate zunächst mit Protein A-Agarose (30 μl) vorinkubiert (1 h, 4°C, auf dem Schüttler). Nach dem Zentrifugieren (1 min 14000 rpm) wurden die Antikörper (1-3 μg anti-C2 oder anti-S4) zu den Überständen zugegeben und inkubiert (1 h, 4°C, auf dem Schüttler). Danach wurden zu dem Gemisch 60 μl Protein A-Agarose zugegeben und über Nacht bei 4°C unter Schütteln inkubiert. Nachdem dem Zentrifugieren (1 min 14000 rpm) wurden die Überstände vorsichtig mit einer Absaugpumpe entfernt. Anschließend wurde 1 ml IP-Puffer zugesetzt und 5 min bei 4°C geschüttelt. Diese [sic] Schritt wurde 5 mal wiederholt. Anschließend wurden 20 μl 1 x Proben-Puffer zugegeben und 5 min gekocht. Nach dem Zentrifugieren wurden die Proben auf die SDS-Gele aufgetragen und dann Western Blot mit dem anti-Flag Antikörper durchgeführt.

2.2.20 Bestimmung der Proteinkonzentration

Der Protein-Assay ist eine Modifikation der Proteinbestimmung nach Bradford (1976). Zu 200 μl Probe wurden 800 μl Bio-Rad-Lösung zugegeben und gut durchmischt. Für die Erstellung einer Eichkurve wurden BSA-Lösungen mit Konzentrationen von 2, 5, 10, 20 und 50 μg/ml vermessen.

Anmerkungen

Ein Verweis auf die Quelle fehlt.

Sichter
(Hindemith) Agrippina1


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Letzte Bearbeitung dieser Seite: durch Benutzer:Singulus, Zeitstempel: 20140825191813

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