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| Untersuchte Arbeit: Seite: 37, Zeilen: 2-24 |
Quelle: Huang 2002 Seite(n): 2, 21, 22, Zeilen: 2: 16ff; 21: letzter Abschnitt; 22: 1ff |
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| 5 Ergebnisse
5.1 Die basische Domäne des Tat-Proteins Das 86-Aminosäuren-Tat-Protein wird von zwei Exons kodiert (Neuveut et al., 1996). Die ersten 72 Aminosäuren werden von dem ersten Exon kodiert, die übrigen 14 C-terminalen Aminosäuren von einem weiteren Exon. Das Tat-Protein besteht aus 5 funktionellen Domänen (Abb. 6) (Huang et al., 2002): einer N-terminalen, einer Cystein-reichen, einer Kern-, einer basischen und einer C-terminalen Region. Um die Wirkung der Tat-Region 37-72 auf das Proteasom besser untersuchen zu können, wurde ein Tat-Peptid 37-72 synthetisiert (Tatpep1). Außerdem wurden veränderte Versionen von Tatpep1 synthetisiert und ihre Wirkung getestet. In Tatpep2 wurde die basische Domäne (AA 49-57) deletiert. Tatpep3 hat eine Deletion des C-terminalen Bereichs von Tatpep1. In Tatpep4 wurde die Kern-Region deletiert (Abb. 7). Die Tat-Peptide 1-4 wurden mit isoliertem 20S Proteasom getestet. 0,1 μg 20S Proteasom wurden mit unterschiedlichen Konzentrationen der vier Tat-Peptide 30 min bei 37°C vorinkubiert. Mit Hilfe von fluorogenen Substraten lässt sich die Inhibition des 20S Proteasoms durch die Tat-Peptide im in vitro-System untersuchen. Die Freisetzung der fluoreszierenden Substanz AMC ist Maß für die Aktivität des 20S Proteasoms. Suc-Leu-Leu-Val-Tyr-AMC ist ein Substrat der Chymotrypsin-ähnlichen Aktivität des Proteasoms. Das vollständige Tat-Protein wurde als positive Kontrolle benutzt. Zur Berechnung der kinetischen Parameter wurde ein Modell verwendet, das von zwei Bindungsstellen des Tat-Proteins am 20S Proteasom ausgeht. Aus den Hemm-Kurven und den kinetischen Parametern (Abb. 7) ist ersichtlich, dass der Hemmeffekt des Tatpep1 auf das 20S Proteasom sehr ähnlich des vollständigen Tat-Proteins ist. Durch die Deletion der basischen Domäne ging die Hemmung verloren, während die Deletion des C-terminalen und des Kern-Bereichs wenig Einfluß hatten (Abb. 7). |
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Das 86-Aminosäuren-Tat-Protein wird von zwei Exons kodiert. Die ersten 72 Aminosäuren werden von dem ersten Exon kodiert, die übrigen 14 C-terminalen Aminosäuren vom zweiten Exon. Das Tat-Protein besteht aus 5 Domänen; einer N-Terminalen-, einer Cystein-reichen-, einer Kern-, einer Basischen und einer C-Terminalen- Region. [Seite 21] 3.2 Die basische Domäne des Tat-Proteins spielt bei der Inhibition des 20S Proteasoms eine entscheidende Rolle Um die Wirkung der Tat-Region 37-72 auf das Proteasom besser untersuchen zu können, wurde ein Tat-Peptid 37-72 synthetisiert (Tatpep1). Außerdem wurden veränderte Versionen von Tatpep1 [Seite 22] synthetisiert und ihre Wirkung getestet. In Tatpep2 wurde die basische Domäne (AA 49-57) deletiert. Tatpep3 hat eine Deletion des C-terminalen Bereichs von Tatpep1. In Tatpep4 wurde die Kern-Region deletiert (siehe Abb. 3.2A). Die Tat-Peptide 1-4 wurden mit isoliertem 20S Proteasom getestet. 0,1 μg 20S Proteasom wurden mit unterschiedlichen Konzentrationen der vier Tat-Peptide 30 min bei 37°C vorinkubiert. Mit Hilfe von fluorogenen Substraten lässt sich die Inhibition des 20S Proteasoms durch die Tat-Peptide im in vitro-System untersuchen. Die Freisetzung der fluoreszierenden Substanz AMC ist Maß für die Aktivität des 20S Proteasoms. Suc-Leu-Leu-Val-Tyr-AMC ist ein Substrat der Chymotrypsin-ähnlichen Aktivität (Schnitt nach hydrophoben Aminosäuren) des Proteasoms. Das vollständige Tat-Protein wurde als positive Kontrolle benutzt. Zur Berechnung der kinetischen Parameter wurde ein Modell verwendet, dass von zwei Bindungsstellen des Tat-Proteins am 20S Proteasom ausgeht. Aus den Hemm-Kurven und den kinetischen Parametern (Abb. 3.2B) ist ersichtlich, dass der Hemmeffekt des Tatpep1 auf das 20S Proteasom sehr ähnlich wie dem vollständigen Tat-Proteins ist. Durch die Deletion der basischen Domäne ging die Hemmung verloren, während die Deletion des C-terminalen und des Kern-Bereichs wenig Einfluß hatten. |
Ein Verweis wird am Anfang gegeben, jedoch auf eine andere Publikation von Huang zusammen mit Huangs Doktorvater und andere Forscher aus 2002. Dort dann nicht dieser Wortlaut stehten, weil der Aufsatz auf Englisch ist. |
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