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Msf/043

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Die Rolle von Membranlipiden in der UVA-induzierten Signaltransduktion in humanen Keratinozyten

von Dr. Maryam Salahshour-Fard

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Statistik und Sichtungsnachweis dieser Seite findet sich am Artikelende
[1.] Msf/Fragment 043 01 - Diskussion
Zuletzt bearbeitet: 2014-07-04 21:26:52 Hindemith
Fragment, Gesichtet, Msf, SMWFragment, Schutzlevel sysop, Verschleierung, Wagner 2004

Typus
Verschleierung
Bearbeiter
SleepyHollow02
Gesichtet
Yes.png
Untersuchte Arbeit:
Seite: 43, Zeilen: 1ff (komplett)
Quelle: Wagner 2004
Seite(n): 22, 48, 51, 52, Zeilen: 22: 24ff; 48: 5ff; 51: 9ff; 52: 1
Der Vektor enthält einen Spleißdonor und -akzeptor, die denen des wildtyp Mo-MLV entsprechen und hier für die Synthese der env-mRNA notwendig sind. Der Vektors pRVH-1 enthält zusätzliche Schnittstellen in Form einer multiple cloning site. Für die Insertion des Caveolin-1shRNAi muss die EcoRI und XhoI Schnittstelle verwendet werden, um einen ordnungsgemäßen Spleißvorgang zu gewährleisten. Die Verwendung einer internal ribosomal entry site-Sequenz (IRES) ist für die Expression verschiedener Proteine von einer mRNA notwendig. PRVH-1 wurde für die Kombination mit den Verpackungsplasmiden pVSV.G entwickelt, um mittels transienter Transfektion in Phoenix Zellen innerhalb von nur einer Woche retrovirale Zellüberstände mit hohem viralem Titer zu generieren. Das Verpackungsplasmid ist in Abbildung 14 schematisch dargestellt. Der in allen Plasmiden enthaltende humane CMV IE Promotor und das im bakteriellen Plasmidanteil enthaltende SV 40 ori bewirken eine stärkere Plasmidexpression und damit höhere virale Titer.

Bei der Verwendung der Zelllinie 293T bewirken die Proteine der adenoviralen E1A Region eine Aktivierung des CMV IE Promotors. Das in den Zellen enthaltende SV 40 large T Antigen ermöglicht durch Wirkung auf das SV 40 ori der Plasmide eine Amplifikation der kompletten Plasmide und erhöht die Plasmidkopienzahl pro Zelle. Das G-Protein des Vesikulären-Stomatitis-Virus (VSV.G), einem Rhabdovirus, kodiert für die Hüllproteine des Vesikulären- Stomatitis-Virus und enthält ebenfalls den CMV IE Promotor für die Genexpression und das SV 40 ori. Im Gegensatz zu den anderen Hüllproteinen, findet bei VSV.G der Viruseintritt in die Zelle mittels Membranfusion nach Bindung an Phospholipidkomponenten der Zellmembran statt (Mastromarino et al., 1987). Da in diesem Fall die virale Infektion nicht von der Anwesenheit spezifischer Rezeptorproteine abhängig ist, besteht ein sehr großes Wirtsspektrum (Yee et al., 1994). VSV.G-pseudotypisierte Viren haben außerdem den Vorteil, dass sie im Gegensatz zu anderen Retroviren mittels Ultrazentrifugation konzentriert werden können (Burns et al., 1993).

2.8.2 Phoenix-Zellen: Verpackungszelllinie

Phoenix-Zellen sind eine Retrovirus-Verpackungszelllinie der dritten Generation für die Generierung amphotroper, MLV-abstammender Retroviren. Diese Zelllinie basiert auf 293T Zellen, welche mit zwei Hilfskonstrukten stabil transfiziert wurden. Die retroviralen Gene befinden sich auf zwei voneinander unabhängigen [Konstrukten, was die Bildung rekombinanter replikationskompetenter Viren durch homologe Rekombination erschwert („split packaging function“) (Markowitz et al., 1988).]

Das G-Protein des Vesikulären-Stomatitis-Virus (VSV.G), einem Rhabdovirus, kann ebenfalls die viralen env-Poteine ersetzen (EMI et al., 1991). Im Gegensatz zu den anderen Hüllproteinen, findet bei VSV.G der Viruseintritt in die Zelle mittels Membranfusion nach Bindung an Phospholipidkomponenten der Zellmembran statt (MASTROMARINO et al., 1987). Da in diesem Fall die virale Infektion nicht von der Anwesenheit spezifischer Rezeptorproteine abhängig ist, besteht ein sehr großes Wirtsspektrum (YEE et al., 1994). VSV.G-pseudotypisierte Viren haben außerdem den Vorteil, dass sie im Gegensatz zu anderen Retroviren mittels Ultrazentrifugation konzentriert werden können (BURNS et al., 1993).

[Seite 48:]

Der Vektor enthält einen Spleißdonor und –akzeptor, die denen des wildtyp Mo-MLV entsprechen und hier für die Synthese der env-mRNA notwendig sind. [...] Als Weiterentwicklung des Vektors pSTITCH enthält pBullet zusätzliche Schnittstellen im Anschluss an die NcoI Schnittstelle in Form einer multiple cloning site. Für die Insertion eines Transgens muss jedoch immer auch die NcoI Schnittstelle verwendet werden, um einen ordnungsgemäßen Spleißvorgang zu gewährleisten.

pSTITCH, bzw. pBullet, wurde für die Kombination mit den Verpackungsplasmiden pHIT 60 (SONEOKA et al., 1995, vgl. Abbildung 9 B) und pCOLT-GALV (WEIJTENS et al., 1998, vgl. Abbildung 9 D) entwickelt, um mittels transienter Transfektion in 293T Zellen innerhalb von nur einer Woche retrovirale Zellüberstände mit hohem viralen Titer zu generieren. Die beiden Verpackungsplasmide sind in Abbildung 9 schematisch dargestellt. Der in allen Plasmiden enthaltende humane CMV IE Promotor und das im bakteriellen Plasmidanteil enthaltende SV 40 ori bewirken eine stärkere Plasmidexpression und damit höhere virale Titer. Bei der Verwendung der Zelllinie 293T bewirken die Proteine der adenoviralen E1A Region eine Aktivierung des CMV IE Promotors. Das in den Zellen enthaltende SV 40 large T Antigen ermöglicht durch Wirkung auf das SV 40 ori der Plasmide eine Amplifikation der kompletten Plasmide und erhöht die Plasmidkopienzahl pro Zelle. [...] Das Plasmid pHCMV-G kodiert für die Hüllproteine des Vesikulären- Stomatitis-Virus und enthält ebenfalls den CMV IE Promotor für die Genexpression und das SV 40 ori.

[Seite 51:]

3.4.6 Phoenix-Ampho: Verpackungszelllinie der dritten Generation

Phoenix-Ampho Zellen sind eine Retrovirus-Verpackungszelllinie der dritten Generation für die Generierung amphotroper, MLV-abstammender Retroviren. Diese Zelllinie basiert auf 293T Zellen, welche mit zwei Hilfskonstrukten stabil transfiziert wurden. Die retroviralen Gene befinden sich auf zwei voneinander unabhängigen Konstrukten, was die Bildung rekombinanter replikationskompetenter Viren durch homologe Rekombination erschwert

[Seite 52:]

(„split packaging function“, eingeführt durch MARKOWITZ et al., 1988).

Anmerkungen

Kein Hinweis auf die Quelle.

Sichter
(SleepyHollow02), Hindemith


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Letzte Bearbeitung dieser Seite: durch Benutzer:Hindemith, Zeitstempel: 20140704212714

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