von Maryam Salahshour-Fard
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| [1.] Msf/Fragment 044 01 - Diskussion Zuletzt bearbeitet: 2014-07-04 21:48:45 Hindemith | Fragment, Gesichtet, Msf, SMWFragment, Schutzlevel sysop, Verschleierung, Wagner 2004 |
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| Untersuchte Arbeit: Seite: 44, Zeilen: 1-22 |
Quelle: Wagner 2004 Seite(n): 18, 48, 49, 51, 52, Zeilen: 18: 9ff; 48: letzte 3 Zeilen; 49: 1ff, 51: 12ff; 52: 1ff |
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| [Die retroviralen Gene befinden sich auf zwei voneinander unabhängigen] Konstrukten, was die Bildung rekombinanter replikationskompetenter Viren durch homologe Rekombination erschwert („split packaging function“) (Markowitz et al., 1988). Ein Hilfskonstrukt enthält die Information für die Gene gag und pol, während die vom env Gen kodierten Hüllproteine auf dem VSV.G-Plasmid liegen. Damit diese Zellen virale Partikel bilden können, muss noch die genetische Information für die virale mRNS in die Zellen eingebracht werden, die dann durch die Genprodukte der vorhandenen Hilfskonstrukte zu einem infektionsfähigen Retrovirus verpackt wird. In der vorliegenden Arbeit erfolgte dieser Schritt durch Lipofectamine Transfektion.
2.8.2.1 Die Generierung transienter Retrovirus-Produzentenzellen mittels Transfektion Transfektion bezeichnet das Einbringen von DNS in eukaryotische Zellen mit nicht-viralen Methoden. Eine Transfektion ist zunächst einmal nur transient, d. h. die DNS wird nicht in das Genom integriert, sondern verbleibt extrachromosomal. Ohne eine weitere Selektion geht solche DNS mit der Zeit verloren und die Transgenexpression kommt zum Erliegen. Zum Einbringen von Fremd-DNS in eukaryotische Zellen, die in der Zellkultur gehalten werden, existieren unterschiedliche Methoden. In der vorliegenden Arbeit wurde die Transfektion mit Lipofectamin 2000® durchgeführt, das als polykationisches Lipid mit der negativ geladenen DNS einen Komplex bildet. Das in der vorliegenden Arbeit verwendete Protokoll für eine transiente Transfektion ist in Tabelle 8 aufgeführt. |
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Ein Hilfskonstrukt enthält die Information für die Gene gag und pol, während die vom env Gen kodierten Hüllproteine auf einem anderen liegen. [Seite 48:] 3.4.2 Die Generierung transienter Retrovirus-Produzentenzellen mittels Transfektion Transfektion bezeichnet das Einbringen von DNA in eukaryotische Zellen mit nicht-viralen Methoden. Eine Transfektion ist zunächst einmal nur transient, d. h. die DNA wird nicht in [Seite 49:] das Genom integriert, sondern verbleibt extrachromosomal. Ohne eine weitere Selektion geht solche DNA mit der Zeit verloren und die Transgenexpression kommt zum Erliegen. Zum Einbringen von Fremd-DNA in eukaryotische Zellen, die in der Zellkultur gehalten werden, existieren unterschiedliche Methoden. In der vorliegenden Arbeit wurde die Calzium- Phosphat vermittelte Transfektion angewendet (WIGLER et al., 1977). [...] Das in der vorliegenden Arbeit verwendete Protokoll für eine transiente Transfektion für die Retrovirusproduktion ist in Tabelle 5 aufgeführt. [Seite 51:] Die retroviralen Gene befinden sich auf zwei voneinander unabhängigen Konstrukten, was die Bildung rekombinanter replikationskompetenter Viren durch homologe Rekombination erschwert [Seite 52:] („split packaging function“, eingeführt durch MARKOWITZ et al., 1988). [...] Damit diese Zellen virale Partikel bilden können, muss noch die genetische Information für die virale mRNA in die Zellen eingebracht werden, die dann durch die Genprodukte der vorhandenen Hilfskonstrukte zu einem infektionsfähigen Retrovirus verpackt wird. In der vorliegenden Arbeit erfolgte dieser Schritt durch retrovirale Transduktion. |
Kein Hinweis auf die Quelle. |
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