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Msf/045

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Die Rolle von Membranlipiden in der UVA-induzierten Signaltransduktion in humanen Keratinozyten

von Dr. Maryam Salahshour-Fard

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Statistik und Sichtungsnachweis dieser Seite findet sich am Artikelende
[1.] Msf/Fragment 045 02 - Diskussion
Zuletzt bearbeitet: 2014-07-04 22:44:23 Hindemith
Fragment, Gesichtet, Msf, SMWFragment, Schutzlevel sysop, Verschleierung, Wagner 2004

Typus
Verschleierung
Bearbeiter
SleepyHollow02
Gesichtet
Yes.png
Untersuchte Arbeit:
Seite: 45, Zeilen: 1-26
Quelle: Wagner 2004
Seite(n): 4, 5, 49, 50, 51, 52, Zeilen: 4: 25ff; 5: 1ff; 49: 15ff; 50: 1ff; 51: 1ff; 52: 9ff
Tabelle 8:Transfektionsschema

Wenn alle zwei Plasmide in ein und dieselbe 293T Zelle transfiziert werden, werden hier alle viralen Proteine exprimiert, durch welche die ungespleißte mRNS des retroviralen Vektors als virale mRNS verpackt wird. Auf diese Weise werden infektiöse virale Partikel gebildet, die in den Zellüberstand abgegeben werden.

2.8.2.2 Die Gewinnung retroviraler Überstände

Für die weitere Verwendung wurden die retroviralen Überstände zunächst bei 300g für 5 min zentrifugiert. Anschließend wurde der Überstand durch einen Filter mit einer Porengröße von 0,45μm filtriert. Hierdurch werden virusproduzierende Zellen und Zellreste entfernt. Das Filtrat wurde direkt für eine Transduktion verwendet oder kryokonserviert.

2.8.2.3 Kryokonservierung viraler Überstände

Für die Verwendung zu einem späteren Zeitpunkt wurden die filtrierten retrovirale Überstände erst in N2 eingefroren, dann bei -80°C kryokonserviert. Für eine spätere Transduktion wurde der benötigte Überstand in einem 22°C Wasserbad aufgetaut und sofort verwendet.

2.8.2.4 Retrovirale Transduktion

Im Gegensatz zur Transfektion werden bei einer Transduktion Zellen durch eine virale Infektion genetisch verändert. Hierbei wird die Eigenschaft von Retroviren genutzt, nach einer Infektion direkt stabil in das zelluläre Genom zu integrieren. Das Einbringen genetischen Materials in Zellen mittels viraler Vektoren wird als Infektion oder auch Transduktion bezeichnet. Ein viraler Vektor besteht aus einem menschen- oder tierpathogenen Virus, das für die Übertragung eines heterologen (fremden) Gens verändert wurde. Neben der Einführung des zu transportierenden Gens stehen dabei Veränderungen, welche die Pathogenität des Virus betreffen, im Vordergrund. Beim viralen Gentransfer nutzt man die natürliche Infektionsmaschinerie der Viren aus, um die Gene effizient in eine Zelle zu [bringen.]

[Seite 4:]

Das Einbringen genetischen Materials in Zellen mittels viraler Vektoren wird als Infektion oder auch Transduktion bezeichnet. Ein viraler Vektor besteht aus einem menschen- oder tierpathogenen Virus, das für die Übertragung eines heterologen (fremden) Gens verändert wurde. Neben der Einführung des zu transportierenden Gens stehen dabei Veränderungen, welche die Pathogenität des Virus betreffen, im Vordergrund.

[Seite 5:]

Beim viralen Gentransfer nutzt man die natürliche Infektionsmaschinerie der Viren aus, um die Gene effizient in eine Zelle zu bringen.

[Seite 49:]

Wenn alle drei Plasmide in ein und dieselbe 293T Zelle transfiziert werden, werden hier alle viralen Proteine exprimiert, durch welche die ungespleißte mRNA des retroviralen Vektors als virale mRNA verpackt wird. Auf diese Weise werden infektiöse virale Partikel gebildet, die in den Zellüberstand abgegeben werden.

[Seite 50:]

3.4.3 Die Gewinnung retroviraler Überstände

Für die weitere Verwendung wurden die retroviralen Überstände zunächst durch einen Filter mit einer Porengröße von 0,45 􀀀 m filtriert. Hierdurch werden virusproduzierende Zellen und Zellreste entfernt. Das Filtrat wurde direkt für eine Transduktion verwendet oder kryokonserviert.

[Seite 51:]

3.4.4 Kryokonservierung viraler Überstände

Für die Verwendung zu einem späteren Zeitpunkt wurden retrovirale Überstände bei –80 °C kryokonserviert. Die filtrierten Überstände wurden in bedarfsgerechten Volumina (0,6 ml, 1,2 ml, 1,8 ml) in Cryotubes (Fa. Nalge Nunc Int., Rochester, USA) aliquotiert und dann sofort bei –80 °C gelagert. Für eine spätere Transduktion wurde der benötigte Überstand in einem 22 °C Wasserbad aufgetaut und sofort verwendet.

[Seite 52:]

3.4.7 Die Generierung stabiler Retrovirus-Produzentenzellen mittels retroviraler Transduktion

Im Gegensatz zur Transfektion werden bei einer Transduktion Zellen durch eine virale Infektion genetisch verändert. Hierbei wird die Eigenschaft von Retroviren genutzt, nach einer Infektion direkt stabil in das zelluläre Genom zu integrieren.

Anmerkungen

Kein Hinweis auf die Quelle.

Sichter
(SleepyHollow02), Hindemith


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Letzte Bearbeitung dieser Seite: durch Benutzer:Hindemith, Zeitstempel: 20140704224425

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