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Msf/053

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Die Rolle von Membranlipiden in der UVA-induzierten Signaltransduktion in humanen Keratinozyten

von Dr. Maryam Salahshour-Fard

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Statistik und Sichtungsnachweis dieser Seite findet sich am Artikelende
[1.] Msf/Fragment 053 01 - Diskussion
Zuletzt bearbeitet: 2014-06-29 06:30:50 Hindemith
Fragment, Gesichtet, Knorr 2000, Msf, SMWFragment, Schutzlevel sysop, Verschleierung

Typus
Verschleierung
Bearbeiter
SleepyHollow02
Gesichtet
Yes.png
Untersuchte Arbeit:
Seite: 53, Zeilen: 1-10
Quelle: Knorr 2000
Seite(n): 43, Zeilen: 1-10
[2.9.3 Proteinbestimmung nach Bradford

Die Konzentrationen von Proteinen in Lösung wird durch die Bradford-Methode bestimmt (Bradford 1976). Die Messung basiert auf der Absorption des] Farbstoffes Coomassie Brilliant Blue G-250 bei einer Wellenlänge von 595 nm in Abhängigkeit von der Proteinkonzentration. Der Farbstoff bindet an basische (Ausnahme Arginin) und aromatische Aminosäurereste.

Die Eichkurve des Standardproteins BSA verschiedener Konzentration (1, 2,5,10,20,30 μg) ermöglicht die Bestimmung der Proteinkonzentration der Proben. Es wurde eine konzentrierte Bradford-Reagenzlösung (BioRadTM) verwendet, die mit H2Obidest 1:5 verdünnt wird. Die Messung der optischen Dichte (OD) erfolgte nach Mischen von 1 ml der verdünnten Farbstofflösung mit 10 μl der Proteinprobe unbekannter Konzentration. Anschließend werden die Proben für 30 min bei Raumtemperatur ins Dunkle gestellt.

3.2.8.3 Bestimmung der Proteinkonzentration nach Bradford

Die Konzentration von Proteinen in Lösung wird durch die Bradford-Methode bestimmt (Bradford, 1976). Die Messung basiert auf der Absorption des Farbstoffes Coomassie Brilliant Blue bei einer Wellenlänge von l=595nm in Abhängigkeit von der Proteinkonzentration. Der Farbstoff bindet an basische (Ausnahme Arginin) und aromatische Aminosäurereste.

Die Eichkurve des Standardproteins BSA verschiedener Konzentration (1, 2, 5, 10, 20, 30 μg) ermöglicht die Bestimmung der Proteinkonzentration der Proben. Es wird eine konzentrierte Bradford-Reagenzlösung (BioRadTM ) verwendet, die 1:5 mit H2Obidest verdünnt wird. Die Messung der optischen Dichte erfolgt nach Mischen von 1 ml der verdünnten Farbstofflösung mit 20 μl der Proteinprobe unbekannter Konzentration.

Anmerkungen

Kein Hinweis auf die Quelle.

Sichter
(SleepyHollow02) Schumann

[2.] Msf/Fragment 053 15 - Diskussion
Zuletzt bearbeitet: 2014-07-05 09:14:25 Hindemith
Fragment, Gesichtet, Kamp 2003, Msf, SMWFragment, Schutzlevel sysop, Verschleierung

Typus
Verschleierung
Bearbeiter
SleepyHollow02
Gesichtet
Yes.png
Untersuchte Arbeit:
Seite: 53, Zeilen: 15-31
Quelle: Kamp 2003
Seite(n): 54, Zeilen: 3 ff.
In dieser Arbeit wurde der Proteingehalt auch nach der Methode von Smith bestimmt (Smith et al., 1985): Das Prinzip dieses Tests beruht auf der Reduktion von Cu2+ zu Cu+, welches dann mit Bicinchoninsäure (BCA) einen Farbkomplex bildet, dessen Entstehung photometrisch bei λ=562 nm im ELISA-Reader gemessen werden kann (siehe Schema, unten). Für die Reduktion werden die Aminosäuren Cystein, Cystin, Tryptophan und Tyrosin verantwortlich gemacht.

Von den auf ihren Proteingehalt zu bestimmenden Proben wurden Verdünnungen hergestellt. Ein Volumen von 10 μl dieser Proben wurde in Mikrotiterplatten gegeben, mit 200 μl Farbreagenz versetzt und für 30 min bei 37°C im Dunkeln inkubiert. Anschließend wurde die Extinktion bei λ=562 nm in einem ELISA-Reader bestimmt. Die Proteinkonzentration ergab sich durch Vergleich eines gleichbehandelten BSA-Standards (Konzentrationen zwischen 25 und 1500 μg/ml) mit den Proben. Der Proteingehalt einer Probe wurde zweifach bestimmt. Die Reaktion wird nicht durch Detergenzien und hohe Salzkonzentrationen, aber durch Reduktionsmittel gestört.

Lösungen:

Farbreagenz: Fa. Pierce: 50 Teile Reagenz A + 1 Teil Reagenz B

Reaktionsschema:

4.2.1.1 BCA-Methode (Smith et al., 1985)

Das Prinzip dieses Tests beruht auf der Reduktion von Cu2+ zu Cu+, welches dann mit Bicinchoninsäure (BCA) einen Farbkomplex bildet, dessen Entstehung photometrisch bei λ = 562 nm im ELISA-Reader gemessen werden kann (siehe Schema). Für die Reduktion werden die Aminosäuren Cystein, Cystin, Tryptophan und Tyrosin verantwortlich gemacht. Von den auf ihren Proteingehalt zu bestimmenden Proben wurden Verdünnungen hergestellt. Ein Volumen von 10 μl dieser Proben wurde in Mikrotiterplatten gegeben, mit 200 μl Farbreagenz versetzt und für 30 min bei 37 °C im Dunkeln inkubiert. Anschließend wurde die Extinktion bei λ = 562 nm in einem ELISA-Reader bestimmt. Die Proteinkonzentration ergab sich durch Vergleich eines gleichbehandelten BSA-Standards (Konzentrationen zwischen 25 und 1500 μg/ml) mit den Proben. Der Proteingehalt einer Probe wurde dreifach bestimmt.

Die Reaktion wird nicht durch Detergenzien und hohe Salzkonzentrationen, aber durch Reduktionsmittel gestört.

Lösungen

Farbreagenz: Fa. Pierce: 50 Teile Reagenz A + 1 Teil Reagenz B

Reaktionsschema:

Anmerkungen

Kein Hinweis auf die Quelle.

Sichter
(SleepyHollow02), Hindemith


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Letzte Bearbeitung dieser Seite: durch Benutzer:Hindemith, Zeitstempel: 20140705091657

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