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Msf/Fragment 038 08

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Typus
KeineWertung
Bearbeiter
SleepyHollow02
Gesichtet
No.png
Untersuchte Arbeit:
Seite: 38, Zeilen: 8 ff.
Quelle: Hoernschemeyer 2001
Seite(n): 119, 120, Zeilen: 119: 21ff; 120: 1ff
Diese Versuche wurden in Anlehnung an die Veröffentlichungen von Brown und Rose (1992) durchgeführt. Die Zellen wurden in 21 cm² ∅ Kulturschalen zur Konfluenz herangezogen. Anschließend wurden sie 1x mit eiskaltem PBS gewaschen und mit 2-3 ml TNE-Puffer (pH 7,4), der Proteaseinhibitoren (1 mM PMSF und ein Cocktail von Proteaseinhibitoren, Complete) und 1% Triton-X-100 enthielt, lysiert. Die Zellreste wurden mit einem Zellschaber von den Schalenböden geschabt und mittels eines (Hand)-Homogenisators und durch 20-maliges Pressen durch eine Nadel (22 gauge) homogenisiert. Anschließend 30 min auf Eis inkubiert.

Die erhaltene Suspension wurde anschließend mit 60%-Optiprep-Lösung in TNE-Puffer auf 40% Optiprep-Lösung eingestellt und auf den Boden eines Zentrifugenröhrchens pipettiert. Dann wurde sie mit 2,1 ml 30%- und 0,9 ml 5%-Optiprep-Lösung in TNE-Puffer überschichtet und in der Ultrazentrifuge (L8-M, Beckman, Rotor 50.2 Ti) 4h bei 4°C, 40.000 rpm zentrifugiert. Nach der Zentrifugation werden je 7 Fraktionen von ca. je 600 μl Volumen gesammelt. Von diesem Extrakten wurden Aliquots für eine Proteinbestimmung nach der BCA-Methode (s. 2.9.4) abgenommen, die restlichen Proben wurden bis zur weiteren Aufarbeitung bei -80°C eingefroren.

wurden in Anlehnung an die Veröffentlichungen von Brown und Rose

(1992) und Melkonian et al. (1999) durchgeführt. Die Zellen wurden in 21 cm² Kulturschalen zur Konfluenz herangezogen, und nach 5.2.3.2 mit den jeweiligen Sphingolipid/BSA-Komplexen inkubiert. Die Zellen wurden ohne Belichtung mit 1 ml TNEPuffer pH 7,5, der 1 % Triton-X-100 enthielt, lysiert. Die Zellreste wurden mit einem Zellschaber von den Schalenböden geschabt und entweder mittels eines (Hand)-Homogenisators oder durch 40-maliges Pressen durch eine Nadel (22 gauge) homogenisiert. Die erhaltene Suspension wurde anschließend mit 80 %-Saccharose-Lösung in TNEPuffer auf 40 % Saccharose eingestellt und auf den Boden eines Zentrifugenröhrchens pipettiert. Dann wurde mit 5 ml 38 %- und 3 ml 5 %-Saccharose-Lösung in TNE-Puffer überschichtet und in der Ultrazentrifuge (L8-80M, Beckman, München) im Schwenkrotor SW41Ti 18 h bei 4°C zentrifugiert (28000 rpm, 135000·g). Das Zentrifugenröhrchen wurde vorsichtig im Boden angestochen und der Inhalt in Fraktionen von ca. 300 μl Volumen

[Seite 120:]

gesammelt. Die Lipide wurden über RP-18-Material von polaren und wasserlöslichen Komponenten (u.a. Saccharose) befreit (5.2.3.7). Anschließend wurde die enthaltene Radioaktivität im Szintillationszähler quantifiziert (5.2.1.2) und der Lipidextrakt über Dünnschichtchromatographie aufgetrennt.

Anmerkungen

Kein Hinweis auf die Quelle.

Sichter
(SleepyHollow02), (Hindemith)

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