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Msf/Fragment 050 07

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Typus
Verschleierung
Bearbeiter
SleepyHollow02
Gesichtet
Yes.png
Untersuchte Arbeit:
Seite: 50, Zeilen: 7-14, 22-29
Quelle: Braziulis 2004
Seite(n): 50, 51, Zeilen: 50: 20 ff.; 51: 1-3
Zur anschließenden spezifischen Proteindetektion wurde die Membran in Blocklösung für mindestens 60 min bei Raumtemperatur geblockt. Anschließend wurde die Membran ÜN bei 4°C in einer geeigneten Verdünnung des ersten Antikörpers in Blocklösung (verdünnt in TBS-T + 5% Trockenmilch) geschwenkt. Die Membran wurde dann dreimal für je 10 min in TBS-T gewaschen und mit einem gegen den ersten Antikörper gerichteten, Peroxidasegekoppelten Zweitantikörper (1:1000 in TBS-T + 5% Trockenmilch verdünnt) für 90 min bei RT inkubiert und anschließend mehrmals in TBS-T gewaschen.

1 x TBS-T (pH 7,6):150 mM NaCl

50 mM Tris

0,1% (v/v) Tween 20

Blockierungslösung: 1,5 M NaCl

0,5 M Tris

0,1% (v/v) Tween 20

5% Trockenmilch


2.9.1.4 ECL-Detektion von Peroxidase-gekoppelten Antikörpern

Die ECL (Enhanced Chemiluminescence)-Methode (ECL-Kit; Amersham) ist eine Licht emittierende, nicht-radioaktive Nachweismethode zur Detektion von immobilisierten Antigenen mit Peroxidase-gekoppelten Antikörpern. Die Peroxidase ist mit dem sekundären Antikörper gekoppelt und katalysiert eine Chemolumineszensreaktion, die auf einem Röntgenfilm detektiert werden kann. Nach Inkubation der Western-Blot-Membran mit dem sekundären Antikörper wurde diese mit TBS-T gewaschen.

Zur anschließenden spezifischen Proteindetektion wurde die Membran in Blocklösung

A für mindestens 60 min bei Raumtemperatur geblockt. Anschließend wurde die Membran 2-12h bei 4°C in einer geeigneten Verdünnung des ersten Antikörpers in Blocklösung A geschwenkt. Die Membran wurde dann dreimal für je 10 min in TBS-T gewaschen und mit einem gegen den ersten Antikörper gerichteten, Peroxidasegekoppelten Zweitantikörper für 50-90 min inkubiert und anschließend mehrmals in TBS-T gewaschen..

ECL-Detektion von Peroxidase-gekoppelten Antikörpern

Die ECL-Methode (ECL-Kit; Amersham-Buchler, Braunschweig) ist eine Licht emittierende, nicht-radioaktive Nachweismethode zur Detektion von immobilisierten Antigenen mit Peroxidase-gekoppelten Antikörpern. Die Peroxidase ist mit dem

[Seite 51]

sekundären Antikörper gekoppelt und katalysiert eine Chemolumineszensreaktion, die auf einem Röntgenfilm detektiert werden kann. Nach Inkubation der Western-Blot- Membran mit dem sekundären Antikörper wurde diese mit TBS-T gewaschen.

Anmerkungen

Kein Hinweis auf die Quelle.

Sichter
(SleepyHollow02), Hindemith

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